METODOLOGÍA. Cultivo de G. lamblia

Transcripción

1 METODOLOGÍA Cultivo de G. lamblia Se utilizaron cultivos axénicos de trofozoítos de la cepa de G. lamblia GS/M-83- H7 (ATCC 50581) y WB clona C6 adquirida de la American Type Culture Collection (ATCC 50803), así como también 2 aislados clínicos de la región (YJJ y MHG), conservados en medio de cultivo TYI-S-33, suplementado con suero bovino al 10 % (Keister, 1983). Se incubaron a 37 ºC en condiciones micro-aerofílicas. Animales de Experimentación Para el modelo murino, se utilizó la cepa singénica C3H/HeJ de 8 a 14 semanas de edad, adquiridos de The Jackson Laboratories (Maine, USA). Los animales fueron mantenidos en el Bioterio del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos de la Universidad de Sonora (DIPA), con fotoperíodos de 12 horas a 25 ºC y alimentados con una dieta comercial para ratones (Harlan Teklad. Proteína 18 %, grasa 5 % y Fibra 5 %, dieta esterilizable). Se eligió este modelo de ratón ya que es susceptible a la infección por la cepa de G. lamblia GS/M 83 H7 (Byrd y col., 1994). 9

2 Líneas Celulares Para la fusión de células B se utilizó la línea celular P3 X 63.Ag8 proveniente de mieloma de células B de ratón, proporcionada generosamente por el Dr. Emil Unanue del Departamento de Inmunología y Patología de la Universidad de Washington en St. Louis MO. Los cultivos se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado al 5 % con suero fetal bovino (SFB) (Hyclone, USA), inactivado por calentamiento. Las líneas celulares fueron mantenidas a 37 ºC en una atmósfera de 5 % CO 2, con una humedad relativa del % en incubadora Isoterm (Fisher Scientific, USA). Obtención de Proteínas Solubles de Trofozoítos de G. lamblia Los extractos antigénicos solubles de G. lamblia se obtuvieron por el método de Gottstein y col., (1990). A partir de un cultivo confluente o en fase logarítmica de trofozoitos de G. lamblia, se colocaron los tubos en agua/hielo por 15 minutos para que los trofozoítos adheridos al vidrio se despegaran, después se realizaron 3 lavados con solución reguladora de fosfatos (PBS), ph 7.2 a 4 ºC (Gibco, USA). Los trofozoitos se resuspendieron en 800 µl de PBS y para su lisis se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y temperatura ambiente respectivamente. Para evitar la degradación de las proteínas se adicionó inhibidores de proteasas (4-(2-aminoetil) bencenosulfonilfluoruro (AEBSF), bestatina, leupeptina, pepstatina A, E-64 y 1,10-fenantrolina), 5 µl/microtubo (P2714, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 10

3 Para una lisis total, se sonicó 2 veces por 2 minutos a 30 ciclos (Brandson sonifier 250, Shelton, CT, USA). Finalmente, el extracto sonicado se centrifugó a 14,000 x g por 15 minutos a 4 ºC (Chaudhuri y col., 1997). El sobrenadante con el antígeno soluble de G. lamblia se mantuvo en congelación a -30 ºC hasta su uso. La estimación de proteína se realizó por el método de Bradford (1976) (Anexo 1). Infección de Ratones C3H/HeJ con Trofozoítos de G. lamblia En ensayos anteriores se estableció que la dosis óptima infectiva de G. lamblia en el modelo murino C3H/HeJ es de 5x10 6 trofozoítos, según Velázquez y col., La infección de ratones se llevó a cabo por inoculación intragástrica con 5x10 6 trofozoitos resuspendidos en solución reguladora de fosfatos (PBS) (Gibco, USA) fría, utilizando una jeringa para insulina con aguja de alimentación forzada. Esto se realizó en tres ocasiones con un periodo de 6 semanas entre cada infección (Anexo 2). Generación de Anticuerpos Monoclonales Específicos Contra G. lamblia Para obtener las células de bazo de los ratones infectados, éstos se sacrificaron por dislocación cervical 5 días después de la última infección. El bazo fue extraído de manera aséptica, macerado y después filtrado a través de una superficie fina de tela (tela de organza). Posteriormente, el filtrado se centrifugó por 5 min a 500 x g y se retiró el sobrenadante. El precipitado conteniendo las células se resuspendió en 5 ml de solución ACK Lysing para eliminar glóbulos rojos. La suspensión celular se centrifugó utilizando las condiciones antes mencionadas, las células se resuspendieron en 5 ml de medio DMEM y fueron contadas con cámara de Neubauer (Ontiveros, 2004) (Anexo 3). 11

4 Fusión Celular El proceso de fusión se centra en la fusión de las células B esplénicas de ratones con las células de mieloma P3 X 63.Ag8. Como fusógeno se utilizó polietilenglicol 1500 (PEG). Se realizó una suspensión de células de bazo y células P3 X 63.Ag8 en proporción 1:1, lavándose la suspensión celular con 5 ml de DMEM en 3 ocasiones. Posteriormente el tubo conteniendo las células se colocó en baño de agua a 37 o C, gota a gota, se agregó 1 ml de polietilenglicol en 1 min. Después se agitó suavemente por 1 min y se agregaron 2 ml de DMEM en 2 min. Finalmente, se agregaron 7 ml de DMEM gota a gota en un lapso de 3 min para completar un volumen final de 10 ml. El tubo se centrifugó a 500 x g por 5 min y se retiró el medio. Posteriormente las células se resuspendió suavemente en 10 ml de medio D10F. Por último, los hibridomas formados se pre-seleccionaron por una deficiencia en la formación de la enzima hipoxantinaguanina fosforibosiltransferasa o la timidina quinasa, cultivando en medio selectivo HAT D10F (Hipoxantina, Timidina y Aminopterina) por 2 semanas. La post-selección se realizó de 20 a 30 días, propagando los hibridomas en medio HT D10F (Hipoxantina y Timidina solamente). La Aminopterina no se requirió más (Galfre y col., 1977). Una vez que se estableció el cultivo, los hibridomas se dejaron crecer continuamente en medio de cultivo DMEM con antibióticos y suero fetal bovino produciendo el anticuerpo. 12

5 Inmunofluorescencia Indirecta de Trofozoítos La inmunofluorescencia de los trofozoítos se realizó a partir de un cultivo confluente de trofozoitos de G. lamblia. Se colocaron los tubos en agua/hielo por 15 minutos para que los trofozoítos adheridos al vidrio se despegaran, después se realizaron 3 lavados con PBS-BSA 1 %- Azida de sodio 0.1 % ph 7.2 a 4 ºC (Gibco, USA). Posterior a estos lavados, se colocaron 5 x 10 5 trofozoítos por pozo en placas de 96 pozos fondo V y se centrifugó para eliminar el exceso de solución reguladora y se resuspendió en el sobrenadante del hibridoma a probar, incubando por 1 hr a 4 ºC. Inmediatamente después de este tiempo se realizaron 3 lavados con PBS-BSA 1 %- Azida de sodio 1 % ph ºC y en el último lavado se eliminó el sobrenadante y se resuspendió en una solución de anticuerpo secundario (1:200) (Goat anti-igg Mouse FITC), se incubó por 1 hr a 4 ºC y protegido de la luz. Posteriormente se realizaron 3 lavados como se mencionó anteriormente, los trofozoítos se resuspendieron en 100 µl de PBS-BSA 1 %-Azida de sodio 0.1 % ph 7.2 y se agregaron 100 µl de paraformaldehido 2 % (Anexo 4). Dot-Blott de Proteínas de G. lamblia El inmuno reconocimiento de las proteínas de G. lamblia se evaluó adsorbiendo antígeno a membrana de nitrocelulosa, bloqueando posteriormente con PBS 1X-BSA 1 %- Leche descremada (Svelty 1% grasa) 5 % por 1 hr, realizando lavados al terminar el tiempo de incubación. Posterior a esto las membranas se ponen en contacto con los sobrenadantes a probar por 2 hr, después de este tiempo se realizaron 5 lavados de 5 minutos cada uno con PBS 1X, posteriormente las membranas se colocaron en una solución de anticuerpo secundario (1:5000) (Goat anti-igg Mouse HPRO, en PBS 1X- 13

6 BSA 1 %- Leche descremada 1 %), se incubó por 1 hr, realizando lavados como se mencionó anteriormente y después se revela la reacción antígeno-anticuerpo por quimioluminiscencia utilizando el Kit Super Signal West Pico (Pierce Rockford IL). Determinación de Isotipo de los Anticuerpos Monoclonales El isotipo de los anticuerpos monoclonales se evaluó adsorbiendo anticuerpo específico de isotipo a pozos de placa de micro titulación (SIGMA, Mouse monoclonal antibody isotyping reagents, en dilución 1:1000), realizando al terminar el tiempo de incubación 3 lavados con PBS 1X. Posteriormente, se agregaron 50 µl del sobrenadante a probar y se incubo 1 hr, después de este tiempo se realizaron lavados como se mencionó anteriormente y se adicionaron 50 µl a cada pozo de una solución con anticuerpo secundario (1:1000) (Goat anti-igg Mouse HPRO, en PBS 1X- BSA 1 %), se incubó por 1 hr. Se lavó la placa y se adicionaron 50 µl por pozo de una mezcla de ABTS y H 2 O 2 como cromógeno. Las densidades ópticas se registraron en un lector de microplaca Benchmark a 415 nm (Bio-Rad, Hercules, CA. USA) (Anexo 6). Electroforesis de Proteínas de G. lamblia El análisis electroforético de las proteínas de G. lamblia se realizó en geles de poliacrilamida al 12 % (SDS-PAGE), utilizando condiciones desnaturalizantes y reductoras (4 % de SDS y 2 % de β-mercaptoetanol). La electroforesis se llevó a cabo en una cámara de electroforesis mini Protean III Bio-Rad (Laemmli, 1970) (Anexo 5). 14

7 Electrotransferencia e Inmunodetección (Western Blotting) Se realizó un gel preparativo en SDS-PAGE en condiciones reductoras y desnaturalizantes (0.05 % de SDS y 0.05 % de β mercaptoetanol) con proteínas solubles de G. lamblia, las proteínas del gel se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en solución de Tris-glicina (0.05 % de SDS) ph 8.3 utilizando un sistema semi-seco (Semi- Dry Transfer Cell, Trans-Blot SD Cell, Bio-rad). Una vez transferidas las proteínas a la membrana, esta se cortó en tiras de 4 mm de ancho y se guardaron a -20 C hasta su uso. Los sitios libres de antígeno en la membrana fueron bloqueados con una solución de PBS-BSA 1 %-leche descremada 5 %. Posterior a 5 lavados con PBS 1X, las membranas se incubaron con el sobrenadante conteniendo al anticuerpo monoclonal a probar durante 2 horas en agitación suave. Posterior a 5 lavados con PBS 1X, las membranas se incubaron en solución de anticuerpo de cabra anti-igg de ratón acoplado a peroxidasa (1:10000) (PBS-BSA1 %- leche descremada 1 %) a temperatura ambiente por 1 hr. La reacción en las membranas se reveló por quimioluminiscencia utilizando el Kit Super Signal West Pico (Pierce Rockford IL) (Anexo 7). 15