Básicamente existen dos tipos de cultivos

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María Luz Villalobos Ortíz
hace 7 años
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1 Importancia de las células intestinales estudios de IPEC R. Davin Grup de Recerca en Nutrició, Universitat Autònoma de Barcelona investigación Básicamente existen dos tipos de cultivos celulares: (a) de células primarias y (b) de líneas celulares continuas. Las células primarias se aíslan directamente de un sujeto con una vida limitada Las líneas celulares continuas, también referidas como establecidas o inmortales, tienen la habilidad adquirida de proliferar infinitamente. Las líneas celulares continuas son uno de los modelos más usados y útiles para estudiar el efecto de factores específicos Hay varios medios para conseguir la inmortalidad de una línea celular: las células tumorales y las indiferenciadas son inherentemente inmortales, pero las células normales también pueden ser inmortalizadas (ser dotadas de habilidad tumoral) mediante la introducción de genes externos con un virus. 85

Líneas de células intestinales La mayoría de investigaciones han sido realizadas en líneas celulares intestinales humanas derivadas de un cáncer de colon (por ejemploht-29, T84, Caco-2) o de duodeno

3 Líneas de células intestinales La mayoría de investigaciones han sido realizadas en líneas celulares intestinales humanas derivadas de un cáncer de colon (por ejemploht-29, T84, Caco-2) o de duodeno (HUTU-80). Pero también en líneas células intestinales pequeñas de rata (por ejemplo IEC-6 y IEC-18), las cuales no son cancerosas. Sin embargo, la estructura y la función del tracto gastrointestinal de los roedores parece diferir del de otros mamíferos domésticos como el cerdo. Célula epitelial Na+ Solutos pequeños Productos bacterianos y antígenos de la dieta A día de hoy disponemos de tres líneas celulares epiteliales intestinales porcinas distintas: La línea celular IPI-2I fue aislada de tejido ileal de un verraco adulto y fue transformada con un plásmido que inmortaliza las células. La línea celular IPEC-1 fue aislada de una mezcla de tejidos de íleon y yeyuno de lechón de un día. Son una línea celular no transformada. La línea celular IPEC-J2 fue aislada de tejido yeyunal de lechón de un día y también es una línea celular no transformada. Actimiosina /Anillo investigación Claudina Claudina-2 Ocludina MLCK Lamina propia Na+ Solutos pequeños Endosoma TGFβ Ácido retinoico IL-13 TLR IFNγ TNF Antígeno MHC TCR Célula T H 2 Célula T Célula T H 1 LAP Célula T Reg IL10 y TGFβ Figura 2. Función barrera de las IECs (J. R. Turner, 2008) La falta de líneas celulares epiteliales intestinales no derivadas de tumores y la especificidad para porcino establece la importancia de la línea celular IPEC-J2, además de considerar que puede soportar adecuadamente infecciones de una gran variedad de microorganismos. Se ha demostrado que los resultados obtenidos en estudios realizados con la línea celular IPEC-J2 pueden ser trasladados a estudios con el animal (cerdo) entero. 87

Cómo se ven afectadas las IPEC La línea celular IPEC-J2 constituye un excelente modelo para las interacciones de estos patógenos con el epitelio intestinal porcino y es usada frecuentemente desde su

4 Cómo se ven afectadas las IPEC La línea celular IPEC-J2 constituye un excelente modelo para las interacciones de estos patógenos con el epitelio intestinal porcino y es usada frecuentemente desde su caracterización realizada por Shierack et al., Antes de su caracterización, las células IPEC-J2 se usaban como modelo de la enteropatía proliferativa porcina (Lawsonia intracellularis), pues la bacteria penetra y prolifera en ellas, como también se ha observado en desafíos con Chlamydia. Cuando Shierack et al., 2006, caracterizaron las células IPEC-J2, demostraron que las IPEC también soportan la invasión con diferentes especies de Salmonella y la adhesión de E. coli. La habilidad de estas bacterias para inducir una respuesta inflamatoria e inmune (por ejemplo mediante la expresión de citoquinas y TLRs) ha sido repetidamente demostrada en subsiguientes estudios con las IPEC-J2. También se ha mostrado que la permeabilidad de la monocapa de IPEC-J2 (medida con resistencia eléctrica transepitelial; TEER) se ve reducida por Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC). Escherichia coli, Salmonella y Chlamydia son patógenos mayores en la industria porcina, además de ser representativos con estrategias de infección muy diferenciadas. Ésta es una de las principales razones por las que la línea celular IPEC-J2 constituye un excelente modelo para las interacciones de estos patógenos con el epitelio intestinal porcino. Las toxinas ETEC han sido completamente estudias en las IPEC-J2, su rol en la adherencia bacteriana ha sido presentado por Johnson et al., La adherencia es un punto clave, pues para las ETEC es un prerrequisito previo a la colonización. 1 Invasión mediada por sp1 Bacterias 3 Influjo de neutrófilos 4 Desprendimiento epitelial y lesión Célula epitelial de la vesícula biliar 2 Respuesta preinflamatoria local Figura 3. Salmonella puede invadir las células epiteliales (paso 1). Esta infección intracelular lleva a una respuesta inflamatoria local (paso 2) mediada por neutrófilos (paso 3), con la consecuente lesión tisular y desprendimiento epitelial (paso 4). (González-Escobedo et al., 2011) 88

Más recientemente, las células IPEC-J2 se usaron para demostrar como altas concentraciones de desoxinivalenol, una toxina producida por hongos del género Fusarium, reducía la viabilidad de las

5 Más recientemente, las células IPEC-J2 se usaron para demostrar como altas concentraciones de desoxinivalenol, una toxina producida por hongos del género Fusarium, reducía la viabilidad de las células epiteliales intestinales porcinas. Esto es interesante en nutrición porcina puesto que el desoxinivalenol a menudo contamina el grano de cereales, causando diarrea y pérdida de peso en cerdos. Las células IPEC-J2 han visto aumentado su uso en el estudio de potencial probiótico de microorganismos, focalizándose o bien en su potencial adherente a la línea celular IPEC-J2 o en la habilidad del probiótico para inhibir la respuesta inflamatoria inducida por un patógeno específico. investigación Algunos ejemplos de estos probióticos son cepas de Enterococcus, Saccharomyces o múltiples especies de Lactobacillus. La validez de estos estudios aún está por confirmar, puesto que los artículos de las pruebas in vivo aún no se han publicado. En una publicación reciente, algunos ingredientes (salvado de trigo, glicomacropéptido de caseína, oligosacáridos manano, extracto de garrofín, y extracto de la fermentación de Aspergillus oryzae) fueron capaces de reducir la adhesión de ETEC a las IPEC-J2, e interferir en la respuesta inflamatoria innata. Otro estudio demuestra como el ácido fítico redujo los efectos negativos del desoxinivalenol en la integridad de la membrana de la línea celular epitelial intestinal. Células intestinales epiteliales Células dendríticas Entre los distintos ingredientes de la dieta y aditivos usados en los estudios con IPEC, debemos prestar especial atención a aquellos relacionados con el uso y la influencia del zinc en el epitelio intestinal. Neutrófilos Eosinófilos Monocitos Linfocitos Figura 4. Resumen de las citoquinas y quimioquinas producidas por las IECs 89

6 Dosis y fuente de zinc El uso de óxido de zinc en el alimento a dosis farmacológicas (ZnO, ppm) está ampliamente aceptado en la industria porcina para reducir la incidencia y la severidad de la diarrea post-destete de los lechones, en particular la causada por ETEC K88. Sin embargo, el mecanismo terapéutico no se comprende del todo. En un primer estudio in vitro realizado con la línea celular intestinal humana Caco-2, se demostró que incrementar las concentraciones de ZnO reducía la adhesión de ETEC K88 y su internalización en la línea celular. También se observó que el ZnO previene el incremento de permeabilidad de las tight junction inducida por ETEC y la expresión de distintos genes de respuesta inflamatoria, también inducida por ETEC. Este estudio no mostró ningún efecto antimicrobiano del ZnO, proveyendo mecanismos alternativos para la reducción de la incidencia de diarrea post-destete en cerdos suplementados con ZnO. Sin embargo, como ya se ha señalado, la Caco-2 es una línea celular intestinal humana, mientras que ETEC K88 es un patógeno específico porcino. Algunos estudios recientes investigaron el efecto de la dosis y la fuente de ZnO en células IPEC -J2 desafiadas con ETEC con el fin de acercarse al un mejor modelo de investigación porcino. Las células IPEC-J2 se usaron en un modelo in vitro de infección intestinal con ETEC, con y sin suplementación con ZnO. El análisis genómico identificó incrementos en la expresión de distintos genes de respuesta inmune innata (como citoquinas) en respuesta a la exposición a ETEC, pero se redujo cuando las células fueron simultáneamente expuestas al ZnO. Los efectos metabólicos mostraron que el ZnO puede modificar la morfología celular IPEC-J2 a bajas concentraciones, y que reduce la viabilidad celular a mayores valores. Cuando la adhesión de las ETEC a la célula del huésped se midió tan solo 2 horas después, la suplementación con ZnO no mostró ningún efecto.sin embargo, cuando se midió en un periodo más largo, el ZnO a concentraciones que no afectaban la morfología de las IPEC-J2 redujeron la adhesión de ETEC. % ZnO potenciado HiZox Animine ZnO común 0,75 1,5 mg/l ZnO Figura 5. Reducción de la adhesión de ETEC a las células IPEC-J2 Estos hallazgos sugieren que la dosis y la fuente de ZnO tienen un impacto significativo tanto en las IPEC-J2 como en el metabolismo del patógeno, reduciendo también la expresión de genes inflamatorios cuando se desafía IPEC-2. 90

7 Conclusiones Las células epiteliales intestinales son la primera línea de defensa frente al ambiente externo y tienen un rol importante en la respuesta inflamatoria. El uso de líneas celulares epiteliales como modelo in vitro ha ido ganando popularidad los últimos años. La línea celular IPEC-J2 representa un buen modelo específico porcino para el estudio del efecto de ingredientes de la dieta en la respuesta inflamatoria causada por patógenos porcinos específicos. investigación El uso de IPEC-J2 y de otras líneas celulares crecerán en el futuro, ofreciendo un modelo excelente para investigar el mecanismo terapéutico del ZnO. nutrinews Noviembre 2014 Células intestinales- Estudio de IPEC 91

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