Universidad Nacional de Tucumán ENZIMAS

Transcripción

1 ENZIMAS INTRODUCIÓN Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en ausencia de un catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y son casi en su totalidad de naturaleza proteica, con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico (ribozimas). Las funciones vitales de cualquier célula serían imposibles de mantener si las reacciones que ocurren en ella fueran extremadamente lentas. Además de incrementar la velocidad de las reacciones, las enzimas exhiben una elevada especificidad y en algunos casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando o disminuyendo su actividad. Las enzimas, como todos los catalizadores, son efectivas en pequeñas cantidades, no sufren modificaciones químicas irreversibles durante la catálisis ni afectan el equilibrio de las reacciones que catalizan. Aunque el estado inicial y final de la reacción es el mismo, se llega al equilibrio mucho más rápidamente, es decir, sólo modifican la velocidad de la reacción. Por otro lado, debido a su naturaleza proteica, comparten características con las proteínas no enzimáticas y difieren de los catalizadores inorgánicos en que: a) Son termolábiles y su actividad depende en la mayoría de los casos del ph del medio. b) El reconocimiento de la enzima por su sustrato es altamente específico. c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas de sustrato por unidad de tiempo. d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos. 1

2 Las enzimas alteran las velocidades de reacción, pero no los equilibrios ni la posibilidad termodinámica de que una reacción se lleve a cabo, o sea que actúan sobre la energía de activación. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina. Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa cataliza la deshidrogenación (oxidación) del Gliceraldehído-3-fosfato a 3-fosfoglicerato. Incluso tienen nombres específicos que no dan información alguna del sustrato o de la reacción que catalizan, como la tripsina (enzima proteolítica). No obstante, existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se subdivide a su vez en clases: 2

3 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción. Ej. CATALASA) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales. Ej. Glucosa fosfotransferasa) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis. Proteasas: pepsina; glucanasas: amilasa), 4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerización. Ej. Fosfotriosa isomerasa) 6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP. Ej. Oxalacetato sintetasa). CINÉTICA ENZIMÁTICA Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, en su mayoría. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E): La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Los estudios cinéticos proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción enzimática puede medirse midiendo la aparición de los productos o bien la desaparición de los reactivos. La medida se realiza generalmente en las condiciones óptimas de ph, temperatura, presencia de cofactores, etc, concentraciones saturantes de sustrato y, en estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). Sin embargo, dichas condiciones varían cuando se quiere estudiar el efecto de alguna de estas variables (ph, temperatura, concentración de sustrato, etc.) o e de otros factores (inhibidores o activadores), sobre la velocidad de la reacción. 3

4 Al medir la aparición de producto (o la desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción (Figura 1), o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de aparición del producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para que los valores determinados reflejen la cantidad de enzima presente en la preparación siempre se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v 0 ) que es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. Así, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, puede considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del ensayo y, en estas condiciones, no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. 4

5 La ecuación de Michaelis-Menten Las reacciones enzimáticas, como habíamos dicho anteriormente, se caracterizan porque aunque aumente la concentración de sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación a que todos los centros activos de la enzima están ocupados. La velocidad depende tanto de la cantidad de enzima como del sustrato en suficiente cantidad. En la cinética de Michaelis-Menten se considera sólo la velocidad inicial de las reaciones para cada concentración de sustrato cuando se construye una gráfica, evitando el error introducido por el deterioro de la enzima. Como en un primer momento no hay producto no se considera la reacción inversa. [S] La velocidad depende de una constante de velocidad K y de su inversa 5

6 El paso limitante en la velocidad es K2, por lo tanto la expresión de la velocidad será Donde K2 también recibe el nombre de Kcat. La concentración de la enzima será mucho menor que la de sustrato porque no se consume. Las enzimas que siguen esta cinética se dice que siguen la cinética de Michaelis-Menten. Al aumentar la concentración de enzima la gráfica es igual pero por arriba. FACTORES QUE INCIDEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad enzimática está influida por una serie de factores: Cambios en la temperatura 6

7 Cambios en el ph Presencia de cofactores Las concentración de sustratos y productos finales Presencia de inhibidores Modulación alostérica Modificación covalente Activación por Proteólisis Isoenzimas TEMPERATURA Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción aumenta con la temperatura. En general la velocidad se duplica cada incremento de unos 10 C y viceversa. Existe una temperatura óptima, por encima de esta la velocidad decrece rápidamente por desnaturalización de la enzima. La temperatura de máxima actividad no corresponde necesariamente con la temperatura de máxima estabilidad. PH TºC 7

8 Efecto del ph del medio de incubación: cambios moderados en del ph afectan el estado iónico de la enzima y con frecuencia también del sustrato. En general, la actividad óptima se encuentra entre ph 5 y ph 9 como latripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su óptimo a valores de ph bastante alejados de dichos límites. A valores extremos de ph se produce desnaturalización de la enzima. PRESENCIA DE COFACTORES Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Los cofactores pueden ser iones inorgánicos o complejos orgánicos (coenzima). 8

9 Coenzima: es una molécula no proteica unida covalentemente a la enzima, es decir un grupo prostético. Apoenzima: parte proteica a la que se uno la coenzima. Holoenzima: es la enzima completa activa (grupo prostético y apoenzima). apoenzima + grupo prostético= holoenzima inactiva funcional CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato. 9

10 PRESENCIA DE INHIBIDORES Inhibidores competitivos Un inhibidor competitivo, ocupa el sitio activo de la enzima y compite con el sustrato para ocupar este lugar. Esto reduce la eficiencia de la enzima en el proceso de catálisis. Puede revertirse el proceso con el agregado de mayor cantidad de sustrato. Inhibidores no competitivos La inhibición no competitiva de una enzima puede ocurrir cuando un inhibidor se une a ella en un lugar distinto del centro activo. Los inhibidores no competitivos rebajan la velocidad de la reacción, i.e. la velocidad de formación del producto es menor con el inhibidor presente que con el inhibidor ausente. Esto significa que el centro activo esta modificado, pero no inhabilitado, por la presencia del inhibidor. Como se muestra en la gráfica 2, el efecto del inhibidor no competitivo no puede ser sobrepasado con alta concentración de sustrato. Puesto que el inhibidor y el sustrato no compiten por el mismo lugar de unión sobre la enzima; un inhibidor no competitivo reduce la velocidad de la reacción en todas las concentraciones de sustrato. Azul= sin inhibidor, Rojo= con inhibidor MODULACIÓN ALOSTÉRICA alostéricas Las enzimas con múltiples subunidades tienen estructura cuaternaria. Una consecuencia de las subunidades múltiples es que cada subunidad catalítica individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una enzima con 10

11 estructura cuaternaria puede unir más de una molécula de sustrato. Alostérica significa "forma diferente"; las enzimas alostéricas pueden cambiar de conformación. Las enzimas alostéricas presentan conformaciones activa e inactiva como resultado de la unión del sustrato en el centro activo y de las moléculas reguladoras en otros lugares de unión (centros alostéricos). En el caso simple de una enzima alostérica con una conformación activa y otra inactiva, el cambio en la velocidad de reacción, con el incremento de la concentración de sustrato, es tipicamente una curva con forma sigmoidea "S". Unión de efectores a las subunidades reguladoras Las enzimas alostéricas pueden tener también subunidades reguladoras que unen moléculas reguladoras: inhibidores o activadores. A los activadores y los inhibidores se les llama en general "efectores". Los inhibidores promueven que las enzimas alostéricas adopten su conformación inactiva y los activadores favorecen la conformación activa. Entre las dos conformaciones activa e inactiva existe un equilibrio. La cantidad de enzima activa e inactiva es dependiente de las concentraciones relativas de sustrato e inhibidor, como sugiere el siguiente diagrama: 11

12 La unión de un inhibidor alostérico provoca que la enzima adopte la conformación inactiva y promueve la unión cooperativa de la segunda molécula de inhibidor. Un exceso de sustrato puede revertir el efecto inhibidor. La unión del sustrato promueve que la enzima asuma la conformación activa y se favorezca la unión cooperativa de sustrato adicional, induciendo la formación del producto. El significado de las curvas de forma-s, con y sin inhibidor Cuando la concentración de sustrato se incrementa, el sustrato se une a la enzima y dispara el cambio de conformación hacia la conformación activa de la enzima. En presencia de inhibidor, se requiere mayor concentración de sustrato para que la enzima cambie a su conformación activa. Sin embargo, cuando se alcanza la suficiente concentración de sustrato para disparar el cambio hacia la conformación activa, el sustrato se une cooperativamente (curva con forma- S) y la misma velocidad máxima se alcanza, en presencia o ausencia de inhibidor. MODIFICACIÓN COVALENTE Otras enzimas pasan de una forma menos activa a otra más activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi (Fósforo inorgánico) o el AMP (Adenosín monofosfato). 12

13 También se da el caso inverso, en el que una enzima muy activa se desactiva al liberar algún grupo químico. En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es más activa que la no fosforilada, mientras que en las vías biosintéticas ocurre lo contrario. ACTIVACIÓN POR PROTEÓLISIS Algunas enzimas no se sintetizan como tales, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos 13

14 ISOENZIMAS Pueden existir enzimas dotadas de distintas características pero que catalicen una misma reacción y presentes en diferentes tejidos, son llamadas isoenzimas. Ej: Lactato deshidrogenada, Hexoquinasa. Lactato deshidrogenasa (LDH) Esta enzima esta formada por la asociación de cinco cadenas peptídicas de dos diferentes tipos de monómeros: M y H. Las variantes encontradas en el ser humano son: 14

15 LDH1: M M M M (abundante en el corazón, el cerebro y los eritrocitos; alrededor del 33 % de la LDH en el suero humano es de este tipo) LDH2: M M M H (abundante en el corazón, el cerebro y los eritrocitos; alrededor del 45 % de la LDH en el suero humano es de este tipo) LDH3: M M H H (abundante en el cerebro, los riñones y los pulmones; constituye alrededor del 18 % de la LDH en suero humano) LDH4: M H H H ((abundante en el hígado, músculo esquelético y el tejido renal; constituye alrededor del 3 % de la LDH serica) LDH5: H H H H ((abundante en el tejido hepático, músculo esquelético y el ileum; apenas hasta 1 % de la LDH del suero humano es LDH5) En el infarto del miocardio, la LDH total en suero aumenta, y debido a que el músculo cardíaco contiene más LDH1 que LDH2, el nivel de LDH1 en suero se hace mayor que el de LDH2 entre 12 y 24 horas después del infarto, por lo que el radio LDH1/LDH2 se hace mayor y se mantiene invertido durante varios días. Se observa un aumento de LDH5 en diversas patologías hepáticas como la cirrosis, hepatitis y otras. Un aumento de LDH5 durante una enfermedad cardíaca sugiere congestión hepática secundaria. 15

16 Figura. Lactato deshidrogenasa LDH1 Bibliografía de la cátedra. 16