Chlamydia MIF IgA (Español)

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1 (Español) REF IF1250A Rev. S Ensayo para la Detección de Anticuerpos por Microinmunofluorescencia (MIF) para la detección de anticuerpos IgA frente a Chlamydia pneumoniae y Chlamydia trachomatis en suero humano Este prospecto es sólo para exportación y no para su distribución en Estados Unidos. Fuera de los Estados Unidos: Para Utilización en el Diagnóstico in vitro PROPOSITO DEL ENSAYO El ensayo de Focus Diagnostics para la detección de anticuerpos por microinmunofluorescencia (MIF) de IgA frente a Chlamydia tiene como finalidad la detección cualitativa y evaluación semicuantitativa de los anticuerpos IgA frente a Chlamydia pneumoniae y Chlamydia trachomatis en suero humano. Este ensayo no está diseñado como un reactivo de auto-diagnóstico. RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO Las Chlamydias son organismos intracelulares obligados que causan infecciones agudas y crónicas en mamíferos y aves. El ciclo de vida de las Chlamydias se divide en dos fases distintas: un estadio infeccioso extracelular no replicativo y un estadio intracelular obligado no infeccioso y replicativo. La forma infecciosa o cuerpo elemental (CE), se une a la membrana de la célula diana y penetra por fagocitosis. Una vez en el interior celular, el cuerpo elemental se reorganiza en partículas reticulares (PR) (formando cuerpos de inclusión) y comienza la fisión binaria. Después de 18 a 24 horas las partículas reticuladas se condensan para formar cuerpos elementales que son liberados para iniciar otro ciclo de infección 1. El cuerpo elemental de la Chlamydia posee los antígenos que son específicos de género (grupo), de especie y de serotipo. Los antígenos de grupo se encuentran estrechamente relacionados con los lipopolisacáridos (LPS) de la membrana externa. Estos LPS extraíbles se usan comúnmente para producir antígenos reactivos de grupo para pruebas serológicas. La proteína principal de la membrana externa (MOMP) contiene antígenos que son específicos para la especie y el serotipo. Alrededor del 60% de la membrana externa de la bacteria está constituida por MOMP. Se han detectado otros tipos diferentes de proteínas estructurales asociadas a la membrana externa de las Chlamydias; sin embargo, los LPS y MOMP dominan la inducción de la respuesta inmune en humanos 9. El género Chlamydia está representado por tres especies diferentes. Chlamydia trachomatis incluye 12 serotipos individuales (A L) y es el agente etiológico asociado con tracoma, linfogranuloma venéreo (LGV), enfermedad pélvica inflamatoria y neumonía infantil 2. El 65% de los hijos de madres infectadas nacidos por parto vaginal adquieren la infección por C. trachomatis. 3 La mayoría de las infecciones por C. trachomatis son asintomáticas. 3 El 65% de los hijos de madres infectadas nacidos por parto vaginal adquieren la infección por C. trachomatis. 3 Chlamydia psittaci está representada por muchos serotipos que son responsables de la psitacosis humana, una zoonosis aguda asociada con aves infectadas 4. La especie recientemente identificada, Chlamydia pneumoniae, se asocia con neumonía. En el 25 al 45% de los adultos evaluados se detectan anticuerpos frente a C. pneumoniae y es la responsable aproximadamente del 10% de los casos de neumonía 7,8. Las infecciones por C. pneumoniae pueden ser subclínicas. Para el diagnóstico de las infecciones por Chlamydia, pueden utilizarse la reacción en los cultivos, los ensayos para detección de anticuerpos por fluorescencia directa (DFA) y la serología. Aunque los cultivos positivos y la DFA son las pruebas más concluyentes, presentan dificultades para la obtención y el transporte de la muestra, además de requerir un procedimiento complejo 4,10. Por esa razón, para el diagnóstico de rutina se emplean pruebas serológicas, tales como la prueba de fijación del complemento (CF), la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y el ensayo inmunoenzimático (EIA) 3. Las pruebas serológicas pueden utilizarse en presuntos diagnósticos de algunas de las infecciones por Chlamydia, por ejemplo: LGV, neumonía infantil causada por C. trachomatis, psitacosis y neumonía causada por C. pneumoniae. La serología no es útil en infecciones genitales comunes causadas por C. trachomatis. Las pruebas FC para Chlamydia empezaron a estar disponibles en la década de los 40. Esta prueba utiliza un antígeno LPS enriquecido para la detección de anticuerpos específicos de grupo. Las pruebas por fijación de complemento son más difíciles de realizar técnicamente y son poco sensibles 4. Los EIA disponibles comercialmente emplean un antígeno que da lugar a una amplia gama de reacciones cruzadas, usualmente derivado de un serotipo LGV. Como consecuencia, al igual que ocurre con la prueba por CF, se detectan únicamente respuestas de anticuerpos específicos de grupo 9. Se dispone de dos tipos de pruebas IFA. Una de ellasutiliza como substrato células infectadas que expresan los cuerpos de inclusión enteros de las Chlamydias. Los cuerpos reticulares, que incluyen los cuerpos de inclusión, expresan epítopos específicos de género y, como consecuencia, no permiten la detección diferencial de las reacciones de anticuerpos específicos frente a las distintas especies de Chlamydia 11. La otra prueba IFA disponible es la microinmunofluorescencia (MIF), presentada en la década de los 70 9, en la que se utilizan cuerpos elementales (CE) purificados como substrato. Al eliminar el antígeno LPS específico de género, los CE purificados permiten detectar reacciones de anticuerpos específicos frente a especies y serotipos de Chlamydia. Los CE de todas las especies y serotipos de Chlamydia se pueden purificar y combinar, o bien utilizarse como sustratos individuales 9. La neumonía es la causa principal de muerte por enfermedades infecciosas en los Estados Unidos. Se estima que en los Estados Unidos hay 4 millones de casos anuales de neumonía adquirida en la comunidad (NAC), los cuales ocasionan un millón de hospitalizaciones. La neumonía es una enfermedad respiratoria aguda que se acompaña de un infiltrado pulmonar que puede detectarse por una radiografía de tórax o por observación durante la auscultación de datos asociados con neumonía (ej. ruidos respiratorios anormales). Las infecciones originadas por patógenos emergentes complican el diagnóstico y el seguimiento del NAC. En la actualidad, la Chlamydia, el Mycoplasma y la Legionella figuran entre los agentes causantes más comunes de la neumonía atípica. La denominación neumonía típica, hoy un tanto obsoleta, proviene de la época en que la mayoría de las neumonías eran causadas por Streptococcus pneumoniae. La respuesta inmune primaria frente a la infección por Chlamydia son anticuerpos de la clase IgM que aparecen al comienzo de la infección. A esta respuesta inicial le sigue de cerca una respuesta de anticuerpos IgG e IgA. La respuesta temprana de anticuerpos IgG, IgM e IgA está dirigida frente a antígenos de Chlamydia específicos de grupo y de especie. En infecciones primarias por Chlamydia, un incremento de cuatro veces en el título de IgG tiene valor diagnóstico. Cuando se sospecha de una infección por C. pneumoniae o C. psittaci, la presencia de niveles detectables de IgM tiene un elevado valor para el diagnóstico 12. Sin embargo, la presencia de IgM en pacientes infectados con C. trachomatis es poco predictiva de una infección en curso: la respuesta de IgM se detecta sólo en el 28 a 33% de los pacientes con infección en curso por C. trachomatis y puede ser detectada en pacientes sin una infección activa por Chlamydia 12. La infección primaria por C. pneumoniae se caracteriza por una respuesta predominante de IgM dentro de las primeras 2 a 4 semanas, una respuesta de IgG más tardía dentro de las 6 a 8 semanas 13 y una respuesta débil o ausente de IgA 18. Después de una infección aguda por C. pneumoniae, los anticuerpos IgM desaparecen generalmente entre los 2 y los 6 meses 13, los títulos de anticuerpos IgG se elevan y normalmente disminuyen lentamente, mientras que los anticuerpos IgA tienden a desaparecer rápidamente 19. Hay 92 millones de casos nuevos estimados de Chlamydia trachomatis que ocurren cada año en todo el mundo (OMS, 2001). Cada año, cuatro millones de casos nuevos estimados ocurren en los Estados Unidos y los países industrializados. De las personas infectadas, hasta un 70% de las mujeres y un 50% de los varones son

2 Página 2 asintomáticos. C. trachomatis causa a menudo infecciones asintomáticas del aparato genital en varones y mujeres y las bacterias pueden permanecer infecciosas en el hospedador durante meses. Esto conduce a un alto número de individuos infectados no detectados y que diseminan la infección a otros varones y mujeres a través del contacto sexual. Típicamente, es menos probable que los hombres soliciten atención para el diagnóstico que las mujeres y la mayoría de las infecciones comunicadas ocurren en el grupo etario de 15 a 24 años. Aunque esto conduce a una subestimación del número total de casos, hace de C. trachomatis uno de los agentes patógenos de transmisión sexual curables más comunes en seres humanos. Esto tiene importancia para la salud pública porque C. trachomatis puede tener graves consecuencias a largo plazo, especialmente en las mujeres. Es una causa bien comprobada de enfermedad inflamatoria pélvica (EID) que puede producir infertilidad, embarazos ectópicos y dolor crónico. Estos trastornos pueden tener consecuencias importantes en el curso de la vida para el individuo afectado y pueden ser costosas de tratar. Además, los niños que nacen de mujeres infectadas por Chlamydia pueden sufrir oftalmía del recién nacido (oftalmia neonatorum) y pneumonitis. La EID es un síndrome complejo que incluye una amplia gama de enfermedades inflamatorias como endometriosis, salpingitis y abscesos tuboováricos. Estas enfermedades pueden estar provocadas por diversos microorganismos. A diferencia del tratamiento contra otros microorganismos de transmisión sexual específicos, no hay un único tratamiento de elección para las personas con EID. Varios tratamientos antibióticos han demostrado ser muy eficaces a la hora de lograr un remedio clínico en personas con EID. Las opciones terapéuticas disponibles para pacientes con EID han sido diseñadas para ofrecer flexibilidad. Los tratamientos para la EID normalmente ofrecen una cobertura de amplio espectro para combatir los patógenos causales más comunes. Los criterios de selección para un tratamiento deben tener en cuenta la etiología microbiana así como la disponibilidad en el centro, el coste económico, la aceptación por parte del paciente y las diferencias regionales en la sensibilidad a los antibióticos. Este tratamiento de amplio espectro para personas con EID seguirá aplicándose hasta que se realicen estudios más concluyentes. Cualquier tratamiento usado debe cubrir C. trachomatis, N. gonorrhoeae, anaerobios, bacilos gram-negativos y estreptococos 14. Los programas de detección de la infección por C. trachomatis deben apuntar a detectar y tratar una proporción significativa de infecciones asintomáticas de modo de reducir la morbilidad asociada a infecciones por Chlaymidia junto con la incidencia y la prevalencia de la infección. Aunque la serología nunca puede sustituir a los métodos que tienen como objetivo la detección directa de Chlamydia trachomatis, hay situaciones en las cuales las pruebas serológicas confiables pueden ser provechosas. De hecho, las infecciones urogenitales por estas bacterias frecuentemente no producen manifestaciones. Por lo tanto, la determinación de anticuerpos contra los antígenos de C. trachomatis puede ser útil para establecer si un paciente ha tenido una exposición anterior a la infección. Por ejemplo, en los pacientes con infección crónica en los que las bacterias ya no son detectables localmente, una prueba serológica positiva puede ser la única indicación de la presencia de clamidia1 15. Los análisis de microinmunofluorescencia (MIF) se consideran el patrón oro serológico 20. Se ha demostrado que los MIF detectan los anticuerpos de la fase aguda contra C. trachomatis más a menudo en los pacientes con enfermedad inflamatoria pélvica (EID), mediante serología, en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) o el cultivo de tejidos en muestras del cérvix y de la uretra obtenidas de los mismos pacientes infectados 17. Se pueden utilizar varias otras pruebas para detectar los anticuerpos contra C. trachomatis en las muestras séricas humanas, incluidos la fijación de complemento, el EIA, y el radioinmunoensayo. Mientras que los antígenos usados en estas pruebas varían considerablemente, todas ellas miden los anticuerpos contra diversos determinantes antigénicos de las especies de Chlamydia. La mayoría de las mujeres con enfermedad inflamatoria pélvica aguda tienen anticuerpos séricos contra C. trachomatis, a menudo en altos títulos. Puesto que los anticuerpos del suero persisten durante varios años después de la infección aguda, es difícil utilizar ensayos de anticuerpos séricos para el diagnóstico de EID aguda por clamidias. Sin embargo, algunos estudios sugieren que los anticuerpos de la clase inmunoglobulina A (IgA) específicos de vida corta pueden ser un marcador potencial de la infección 16 activa por clamidia. En un estudio 15, se utilizaron análisis de inmunotransferencia (Western blot) de muestras del suero de donantes de sangre sanos y de pacientes infectados por C. trachomatis para determinar respuestas de anticuerpos frente a antígenos enteros de C. trachomatis Los resultados del análisis de inmunotransferencia mostraron que la respuesta de IgM parecía estar limitada a una pequeña cantidad de antígenos mientras que la de IgA, y de IgG particularmente, reconocieron un alto número de antígenos. El análisis de inmunotransferencia mostró que el suero de pacientes infectados por C. trachomatis aumentó el número de las respuestas de IgG, de IgM, y de IgA a los antígenos enteros de Chlamydia con respecto a los sueros de donantes de sangre sanos. Los pacientes infectados por C. trachomatis tenían considerablemente más IgG para LPS, MOMP, hsp60, y pgp3 y más IgA para LPS y MOMP que donantes de sangre sanos cuando se examinó el porcentaje de individuos con anticuerpos séricos contra proteínas sintéticas o antígenos recombinantes. La prueba MIF frente a Chlamydia de Focus Diagnostics utiliza una cepa de C. pneumoniae (TW183), dos cepas de C. psittaci, y ocho serotipos (D K) de C. trachomatis. Los cuerpos elementales de la Chlamydia se sometieron a un proceso propio de la compañía para la eliminación de los LPS, que podrían interferir con la reacción, y se diluyeron en saco vitelino al 3% para añadir contraste de fondo. Cada porta contiene doce pocillos; con cuatro áreas antigénicas dentro de cada pocillo. Cada pocillo contiene áreas antigénicas separadas para cada especie y un control separado de saco vitelino. PRINCIPIO DEL METODO El ensayo para la detección de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFA) utiliza la técnica de "sandwich" en dos etapas. En la primera etapa, el suero del paciente se diluye en PBS. El suero diluido se añade a los pocillos apropiados del porta en contacto con el sustrato y se incuba. Tras la incubación, el porta se lava con PBS para eliminar los anticuerpos del suero sin unir. En el segundo paso, cada pocillo con los antígenos se cubre de anticuerpos anti IgA humana marcados con fluoresceína. El porta se incuba permitiendo que los complejos antígeno-anticuerpo reaccionen con los anticuerpos anti IgA marcados con fluoresceína. Tras el lavado, secado y montaje del porta, se examina utilizando un microscopio de fluorescencia. Las reacciones positivas aparecen como CEs fluorescentes brillantes verde manzana con una matriz de fondo de saco vitelino. En las determinaciones semi cuantitativas el título del punto de corte se obtiene realizando diluciones seriadas de las muestras positivas. PRESENTACION El ensayo de Focus Diagnostics, incluye los reactivos necesarios para la realización de 120 determinaciones. Portas substrato de Chlamydia para MIF REF IF1201 Ag (Chlamydia MIF Substrate Slide) Diez portas con doce pocillos cada uno. Cada pocillo incluye cuatro zonas: un área de saco vitelino que se utiliza como control y tres áreas antigénicas individuales que consisten en Cuerpos Elementales (CE) diluidos en una matríz de saco vitelino. Almacenar el envase con los portas sin abrir de 2 a 8 C. Los portas dentro del envase sin abrir son estables hasta la fecha de caducidad indicada en su etiqueta. Para evitar la condensación, permitir que los envases de los portas alcancen la temperatura ambiente antes de su apertura.

3 Página 3 Nota: La mayoría de los microscopios fluorescentes invierten la imagen del portaobjetos. Cuando se visualicen a través del microscopio, los antígenos aparecerán tal como se muestra a continuación. Conjugado de IgA dual para ambas especies, 3,5 ml REF IF1209 CONJ IgA (IgA Conjugate-Dual Species) Un vial de anticuerpos de cabra frente a IgA humana marcados con fluoresceína, específico para la cadena alfa, mezclado con anticuerpos de cabra frente a IgG de ratón marcados con fluoresceína. El anti-igg de ratón ha sido standardizado para proporcionar un control de la especificidad frente al antígeno. Contiene el colorante Azul de Evan, un estabilizador de proteínas y conservante. Listo para usar. Estable hasta la fecha de caducidad indicada en su etiqueta si se conserva de 2 a 8 C. No se recomienda su utilización si se observa turbidez, pérdida de color u otros indicios de contaminación bacteriana. Permitir que alcance la temperatura ambiente antes de su utilización. Control detectable polivalente, 0,30 ml REF IF1214 CONT > (Polyvalent Detectable Control) Un vial de anticuerpos monoclonales murinos envasado a la dilución de trabajo. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de caducidad indicada en su etiqueta si se conserva de 2 a 8 C. No se recomienda su utilización si se observa turbidez, pérdida de color u otros indicios de contaminación bacteriana. Permitir que alcance la temperatura ambiente antes de su utilización. No debe pretratarse ni diluirse. Control no detectable, 0,25 ml REF IF1213 CONT < (Non-Detectable Control) Un vial de suero humano envasado a la dilución de trabajo. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de caducidad indicada en su etiqueta si se conserva de 2 a 8 C. No se recomienda su utilización si se observa turbidez, pérdida de color u otros indicios de contaminación bacteriana. Permitir que alcance la temperatura ambiente antes de su utilización. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación ya que pueden resultar perjudiciales. No debe pretratarse ni diluirse. Medio de montaje, 2,5 ml REF IF0007 REAG MONT (Mounting Medium) Un frasco con gotero que contiene glicerol en tampón fosfato a ph 7,2 ± 0,1. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de caducidad indicada en su etiqueta si se conserva de 2 a 8 C. Permitir que alcance la temperatura ambiente antes de su utilización. PBS REF IF0005 BUF (PBS) Un vial de tampón fosfato (PBS) en polvo. Reconstituir con 1 litro de agua destilada (o purificada). La solución reconstituida es un tampón 0,01M con un ph 7,2 ± 0,1. Almacenar de 2 a 8 C antes y después de la reconstitución. Permitir que alcance la temperatura ambiente antes de su utilización. No se recomienda su utilización si se observa turbidez, pérdida de color u otros indicios de contaminación bacteriana. MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN 1. Cubres de 24 X 50 mm 2. Tubos de ensayo y gradillas, tubos de microcentrifuga o placa de microtítulación para la realización de las diluciones del suero. 3. Centrifuga. 4. Incubador de 35 a 37 C o baño para la incubación de los portas. 5. Nevera de 2 a 8 C 6. Frasco lavador de plástico. 7. Pipetas calibradas o de pistón con puntas desechables 8. Jarra de Coplin o cubeta de tinción con soporte para portas 9. Matraz o probeta calibrada de 1 litro 10. Cámara húmeda para la incubación de los portas 11. Agua destilada o purificada 12. Temporizador. 13. Papel absorbente para el secado de los portas 14. Microscopio de fluorescencia. Parámetros recomendados Filtro de Excitación nm Filtro Barrera nm Fuente de Luz HBO 100W, mercurio Objetivo 20 40X, calidad de fluorescencia, muy seco ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Este prospecto es sólo para exportación y no para su distribución en Estados Unidos. Fuera de los Estados Unidos, la clasificación de este producto es para utilización en el diagnóstico in vitro. 2. Todos los reactivos derivados de la sangre deben manipularse como potencialmente infecciosos. La materia prima utilizada para la fabricación de los componentes (incluyendo los controles) ha sido analizada con métodos aprobados por el FDA con resultados negativos, a la presencia de antígenos de superficie de hepatitis B, anticuerpos de hepatitis C y de VIH-1/2 (SIDA). Sin embargo, como ningún método conocido puede garantizar con un 100% de seguridad que los productos derivados de sangre humana no transmitirán esos u otros agentes infecciosos, todos los controles, muestras de suero y el material que entre en contacto con estas muestras, deberá ser considerado como potencialmente infeccioso y descontaminarse o desecharse tomando las precauciones

4 Página 4 de bioseguridad necesarias. El CDC y los institutos nacionales de la salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos estén manejados en el nivel 2 de Biosafety. 2,21,24 3. El azul de Evan es cancerígeno; no obstante, su concentración en este producto es inferior al umbral notificable (inferior al 0,1 %). 4. No sustituir o mezclar reactivos de diferentes lotes o fabricantes. 5. Utilizar únicamente los protocolos incluidos en este manual de instrucciones. La utilización de temperaturas o tiempos de incubación diferentes a los especificados, puede conducir a resultados erróneos. 6. La contaminación cruzada entre muestras de pacientes diferentes dentro de un mismo porta, puede conducir a resultados erróneos. Añadir las muestras y manipular los portas con cuidado para evitar que se mezclen los sueros de pocillos adyacentes. 7. La contaminación bacteriana de las muestras de suero o de los reactivos, puede conducir a resultados erróneos. Utilizar las técnicas asépticamente para evitar la contaminación microbiana. 8. Realizar la prueba a temperatura ambiente (rango aproximado: 20 a 25 C). 9. Para asegurar resultados óptimos y reproducibles, deben emplearse las técnicas de pipeteo adecuadas, manteniendo un ritmo uniforme de pipeteo durante todo el procedimiento. 10. El medio de montaje contiene entre 30 y 60% de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto, deben tomarse inmediatamente medidas de primeros auxilios. ESTABILIDAD Y MANIPULACION 1. Los kits son estables hasta el último día del mes indicado en la fecha de caducidad si se almacenan entre 2 y 8 C. 2. No utilizar el kit ni los reactivos después de la fecha de caducidad. 3. No exponga los reactivos a poderosas fuentes de luz durante el almacenamiento o incubación. 4. Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su utilización. RECOGIDA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS El tipo de muestra recomendado es el suero. No se ha realizado ninguna prueba para evaluar la compatibilidad del ensayo con otros tipos de muestra. Debe evitarse la utilización de sueros con elevado contenido en lípidos, hemolízados, inactivados por calor o contaminados; ya que podrían conducir a resultados erroneos. Recogida y manipulación de las muestras Obtenga muestras de sangre asépticamente mediante técnicas de venopunción aprobadas y efectuadas por personal capacitado. 21 Permita que las muestras de sangre se coagulen a temperatura ambiente antes de su centrifugación. Transfiera asépticamente el suero a un recipiente estéril con cierre hermético para su almacenamiento a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C. Si el análisis se pospone más de 5 días, la muestra debe ser congelada a una temperatura de -20 C o inferior. Descongele y mezcle bien las muestras antes de su uso. Preparación de las muestras La dilución de trabajo para las muestras de suero es 1:16 en PBS. Para la determinación del título del punto de corte, utilizar PBS para realizar las diluciones en serie a partir de la dilución de trabajo. PROCEDIMIENTO (Incubación a 37 C) 1. Sacar los portas de la nevera. Para evitar la condensación, permitir que alcancen la temperatura ambiente antes de la apertura del envase. 2. Añadir 25 µl de Control detectable, tal como viene en el vial, al pocillo apropiado del porta. 3. Añadir 25 µl del Control no detectable, tal como viene en el vial, al pocillo apropiado del porta. 4. Para cada muestra a evaluar, añadir aproximadamente 25 µl de la muestra diluida (ver sección anterior de Preparación de la Muestra), al pocillo apropiado del porta. Realizar las anotaciones oportunas para la identificación posterior de los pocillos cuando se realice la lectura de los resultados. 5. Incubar los portas en una cámara húmeda durante 30 ± 2 minutos a C. 6. Sacar los portas de la cámara húmeda y enjuagar cada uno de ellos con un chorro suave de PBS. No dirigir el chorro directamente sobre los pocillos del porta. Enjuaguar una fila cada vez para evitar que se mezclen las muestras. Lavar los portas sumergiéndolos en una jarra de Coplin o de tinción con PBS durante 10 minutos. 7. Sumergir brevemente los portas lavados en agua destilada o purificada y permitir que se sequen al aire. 8. Añadir aproximadamente 25 µl de Conjugado de IgA dual para ambas especies a cada pocillo del porta. 9. Incubar los portas en una cámara húmeda durante 30 ± 2 minutos a C. 10. Repetir los pasos de lavado 6 y Añadir sobre el porta unas gotas de Medio de montaje y cubrir con un cubre de 24 X 50 mm. Eliminar cualquier posible burbuja, así como el exceso de medio de montaje con papel absorbente. 12. Examinar los pocillos a un aumento final de 400 X utilizando un microscopio de fluorescencia equipado adecuadamente. Para optimizar la fluorescencia los portas deberían leerse en el mismo día de la realización del ensayo. Si esto no fuese posible, los portas deberían guardarse de 2 8 C en oscuridad hasta un máximo de 24 horas. PROCEDIMIENTO (Incubación a temperatura ambiente) 1. Sacar los portas de la nevera. Para evitar la condensación, permitir que alcancen la temperatura ambiente antes de la apertura del envase. 2. Añadir 25 µl de Control detectable, tal como viene en el vial, al pocillo apropiado del porta. 3. Añadir 25 µl del Control no detectable, tal como viene en el vial, al pocillo apropiado del porta. 4. Para cada muestra a evaluar, añadir aproximadamente 25 µl de la muestra diluida (ver sección anterior de Preparación de la Muestra), al pocillo apropiado del porta. Realizar las anotaciones oportunas para la identificación posterior de los pocillos cuando se realice la lectura de los resultados. 5. Incubar la(s) lámina(s) durante 60 ± 2 minutos a temperatura ambiente, cubiertas. 6. Sacar los portas de la cámara húmeda y enjuagar cada uno de ellos con un chorro suave de PBS. No dirigir el chorro directamente sobre los pocillos del porta. Enjuaguar una fila cada vez para evitar que se mezclen las muestras. Lavar los portas sumergiéndolos en una jarra de Coplin o de tinción con PBS durante 10 minutos. 7. Sumergir brevemente los portas lavados en agua destilada o purificada y permitir que se sequen al aire. Nota: si se usa un instrumento para automatizar el proceso de lavado, tal vez no pueda dejarse que las láminas se sequen al aire antes de la adición del conjugado. 8. Añadir aproximadamente 25 µl de Conjugado de IgA a cada pocillo del porta. 9. Incubar las láminas durante 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente, cubiertas. 10. Repetir los pasos de lavado 6 y Añadir sobre el porta unas gotas de Medio de montaje y cubrir con un cubre de 24 X 50 mm. Eliminar cualquier posible burbuja, así como el exceso de medio de montaje con papel absorbente. 12. Examinar los pocillos a un aumento final de 400 X utilizando un microscopio de fluorescencia equipado adecuadamente. Para optimizar la fluorescencia los portas deberían leerse en el mismo día de la realización del ensayo. Si esto no fuese posible, los portas deberían guardarse de 2 8 C en oscuridad hasta un máximo de 24 horas.

5 Página 5 CONTROL DE CALIDAD En cada uno de los ensayos (en el que se procesa un único porta, o un grupo de portas) deberían incluirse tanto el control detectable como el no detectable. Validez del ensayo 1. El control detectable debería exhibir una fluorescencia de 2+ a 4+ en todas cuerpos elementales y una reactividad inapreciable con el control de saco vitelino. 2. El control no detectable no debe mostrar reactividad con los cuerpos elementales. Si no se observan estos resultados para los Controles, los resultados de las muestras no deberían considerarse como válidos y debería repetirse el ensayo. Los controles detectables y no detectables tienen por objeto detectar fallos sustanciales de los reactivos. El control detectable se ha diseñado utilizando anticuerpos de ratón y no anticuerpos humanos. El control detectable asegura únicamente la funcionalidad del reactivo. Pueden utilizarse controles adicionales de acuerdo con la normativa local, y/o con las directrices marcadas por los organismos acreditados. Validez de la muestra Fluorescencia de fondo. De forma puntual, una muestra puede reaccionar con el diluyente del saco vitelino. En este caso, si el título de anticuerpos anti-saco vitelino es igual o superior al título de anticuerpos anti-chlamydia, el ensayo no debería interpretarse. Esta reacción anti-saco vitelino se puede confirmar analizando el área del control del saco vitelino. La fluorescencia en este área indica (non-chlamydia) reactividad inespecífica. Continuar examinando todas las diluciones del suero del paciente. Si el título de anticuerpos anti-saco vitelino es superior o igual que cualquiera de los títulos de anticuerpos anti-chlamydia, el resultado no es interpretable y no debe ser divulgado. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS El sistema óptico del microscopio, así como el tipo y las características de la fuente de luz determinarán la intensidad de la fluorescencia y el título del punto de corte. En cada determinación deben leerse primero los pocillos de los controles para asegurar una interpretación correcta de los resultados. Lectura de los portas Leer la intensidad de fluorescencia de los cuerpos elementales (consulte la siguiente nota Cuerpos elementales y partículas fluorescentes verdes) y valorar la fluorescencia de la siguiente forma: 2 a 4+ Fluorescencia verde manzana de moderada a intensa. 1+ Fluorescencia definida, pero débil. Negativo Sin fluorescencia o con fluorescencia igual a la observada en el área del control de saco vitelino o en el pocillo de control no detectable Cuerpos elementales y partículas fluorescentes verdes. Lea sólo la fluorescencia de los cuerpos elementales. Los cuerpos elementales tienen un tamaño homogéneo, con una densidad de distribución uniforme por toda la banda antigénica. Las partículas fluorescentes verdes sin una distribución uniforme e irregulares (si las hay) no deben interpretarse como una reactividad positiva. Interpretación de los resultados de las muestras de los pacientes El título de suero que se corresponde con la dilución más elevada que muestre una fluorescencia verde manzana definida (1+), se denomina título de punto de corte. A diluciones inferiores de las muestras, se pueden observar reacciones cruzadas con las tres especies de Chlamydia. Para determinar la especie que desencadena la respuesta inmune predominante, realizar diluciones seriadas de la muestra hasta el título del punto de corte. Para realizar un diagnóstico, se deben combinar los resultados serológicos con la evidencia clínica de los pacientes. 1:16 Un título de punto final 1:16 para C. trachomatis en una muestra individual debe considerarse como indicio de infección en un momento indefinido. La interpretación más completa dependerá de las manifestaciones clínicas del paciente y de los resultados obtenidos para la IgG y la IgM. Los títulos elevados de IgA en ausencia de títulos de IgM pueden indicar una reinfección o una infección crónica, mientras que los títulos positivos de IgA en presencia de títulos positivos de IgM pueden indicar una infección primaria. <1:16 No se detectan anticuerpos Reactividad intra-género El MOMP de clamidia contiene antígenos específicos de especie y de género, y se pueden observar reacciones serológicas cruzadas en muestras de la faseaguda y de la convalecencia. Las manchas de antígenos de C. psittaci y de C. trachomatis, proporcionadas como controles de la especiación de Chlamydia, tienen el fin de proporcionar ayuda para interpretar la especificidad de la reacción serológica de C. pneumoniae. Cuando se observen reacciones cruzadas, interprete la especificidad de la inmunorespuesta con precaución. En la mayoría de los casos, una reacción específica para C. pneumoniae tendrá títulos de punto final de una magnitud dos veces superior, o incluso mayor, con respecto a los observados con las otras dos manchas de antígenos de clamidia. Para determinar si C. pneumoniae produce la respuesta inmune predominante, diluya en serie especímenes hasta el título de punto final. Combine los resultados serológicos con los datos clínicos para facilitar el diagnóstico. Las manchas de antígenos de C. psittaci y de C. pneumoniae, proporcionadas como controles de la especiación de Chlamydia, tienen el fin de proporcionar ayuda para interpretar la especificidad de la reacción serológica de C. trachomatis. Cuando se observen reacciones cruzadas, interprete la especificidad de la inmunorespuesta con precaución. En la mayoría de los casos, una reacción específica para C. trachomatis producirá titulaciones de punto final por lo menos dos veces mayores que las titulaciones observadas con las otros dos manchas del antígeno de clamidia. Para determinar si C. trachomatis produce la respuesta inmune predominante, diluya en serie especímenes hasta el título de punto final. Combine los resultados serológicos con los datos clínicos para facilitar el diagnóstico. LIMITACIONES 1. La interpretación de los resultados de la IgA depende del cuadro clínico inicial de cada paciente: es muy importante relacionar todos los estudios serológicos de la Chlamydia con los antecedentes clínicos y otros datos de los que disponga el facultativo. 2. No se conoce el rendimiento de este ensayo sobre la población general, niños y ancianos. 3. No se conoce el rendimiento de este ensayo sobre matrices diferentes del suero. Analice solamente los tipos de muestra indicados. 4. No se conoce el rendimiento de este ensayo en el seguimiento terapéutico. 5. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de una infección activa en curso a. Se han publicado casos de individuos con cultivos positivos en los que no se detectan anticuerpos por MIF. Esta situación se presenta en los adultos en raras ocasiones, pero puede ocurrir más frecuentemente en niños pequeños. Además, las muestras obtenidas en un estadio muy temprano de infección primaria, podrían contener niveles de anticuerpo no detectables. Si se sospecha de una infección por Chlamydia, debería extraerse una segunda muestra transcurridos de 10 a 21 días desde la primera extracción, y ensayarse en paralelo con la muestra original. 6. El área de reacción para psittaci incluye dos cepas de C. psittaci (loro y periquito), pero no incluye todas las serovariantes de C. psittaci. Por lo tanto, puede que no se detecten algunas de las infecciones por C. psittaci. Sin embargo, se informan muy pocos casos de psitacosis (generalmente <50 por año en Estados Unidos) y siendo la mayoría de los casos originados por cepas de loros y periquitos. Suero procedentes de pacientes con sospecha de psitacosis deberían también analizarse utilizando la prueba de FC para la detección de antígenos de grupo de Chlamydia. 7. El valor predictivo de un resultado positivo o negativo depende de la prevalencia en la población y de la probabilidad de infección previa a la realización del ensayo.

6 Página 6 8. Durante una infección por Chlamydia, la respuesta de anticuerpos puede dar lugar a reacciones cruzadas con varias especies de Chlamydia. Una reacción cruzada también puede resultar de la exposición a más de una especie de Chlamydia. 9. Podrían detectarse anticuerpos específicos de especie debido a la exposición pasada o la reacción cruzada resultantes de infecciones por otras especies de Chlamydia. 10. Los resultados serológicos no se pueden utilizar para determinar el sitio de la infección. 11. Las pruebas serológicas pueden ser negativas en una persona infectada por clamidia debido a la diferentes características inmunogenéticas de las cepas y a la localización de las infecciones. RESULTADOS ESPERADOS Aproximadamente de un 40% a un 60% de la población adulta en el mundo presenta anticuerpos frente a C. pneumoniae, lo que sugiere que la infección muestra una prevalencia extraordinariamente elevada sobre la población y que la re-infección es común 15. Típicamente, Los casos informados de infección por C. psittaci en los Estados Unidos, se encuentran normalmente por debajo de 50 al año, con 16 casos informados en Además de las aves infectadas, se han identificado otras fuentes de infección por C. psittaci en humanos y que podrían ser más comunes de lo que hoy se reconoce 15. La prevalencia de las infecciones por C. trachomatis en mujeres adolescentes suele superar el 10%, y en algunas poblaciones puede alcanzar un 40%. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Para los clientes afuera de los Estados Unidos, las características del ensayo se suministran en una hoja seperada. REFERENCIAS 1. Schacter, J Chlamydiae (Psittacosis-Lymphogranuloma Venereum-Trachoma Group), In E. Lennette, A. Balows, W. Hausler, and H. Shadomy (ed.), Manual of Clinical Microbiology 4ed, ASM Press, Washington, D.C. 2. Smith, T Chlamydia, In N. Schmidt and R. Emmons (ed.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections 6th ed, APHA, Washington, D.C. 3. Black CM. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin Microbiol Rev Jan; 10(1): La Scolea, L The Value of Non-culture Chlamydial Diagnostic Tests. Clin. Micro. News Letter 13: Shor, A., C.C. Kuo, and D.L. Patton Detection of Chlamydia pneumoniae in coronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques. SAMJ 82: Kuo, C.C., A.Shor, L.A. Campbell, H. Fukushi, D.L. Patton, and J.T. Grayston Demonstration of Chlamydia pneumoniae in Atherosclerotic Lesions of Coronary Arteries. J. Inf. Dis. 167: Grayston, J.T., C.C. Kuo, S.P. Wang, and J. Altman The New Chlamydia psittaci Strain, TWAR, Isolated in Acute Respiratory Tract Infections. New Eng. J. Med. 315: Campbell, L.A., C.C. Kuo, S.P. Wang, and J.T. Grayston Serological Response to Chlamydia pneumoniae Infection. J. Clin. Micro. 28: Barnes, R.C Laboratory Diagnosis of Human Chlamydial Infections. Clin. Micro. Rev. 2: Gibson, J.P., R.M. Egerer, and D. L. Wiedbrauk Improved Isolation of Chlamydia trachomatis from Low-Prevalence Population by Using Polyethylene Glycol. J. Clin. Micro. 3 1: Troidle, K.M Characterization of a Genus-Specific Chlamydial Antigen. Doctoral Dissertation, University of Massachusetts. 12. Schacter, J Chlamydiae, In Rose, N.R., E.C. De Macario, J.L. Fahey, H. Friedman, G.M. Penn (ed.), Manual of Clinical Immunology, 4th ed, ASM Press. Washington, D.C. 13. Grayston, J.T., L.A. Campbell, C.-C. Kou, C.H. Mordhorst, P. Saikku, D. Thom, and S.-P. Wang A New Respiratory Pathogen: Chlamydia pneumoniae Strain TWAR. J.Inf.Dis. 161: Policy Guidelines for Prevention and Management of Pelvic Inflammatory Disease (PID). U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, National Center for Prevention Services, From MMWR Volume 40 (RR5) S. Bas et al, Chlamydial Serology: Comparative Diagnostic Value of Immunoblotting, Microimmunofluorescence Test, and Immunoassays Using Different Recombinant Proteins as Antigens. J Clin Microbiol April; 39(4): Mattila, A et al, Detection of Serum Antibodies to Chlamydia trachomatis in Patients with Chlamydial and Nonchlamydial Pelvic Inflammatory Disease by IPAzyme Chlamydia and Enzyme Immunoassay. Journal of Clinical Microbiology, Volume 31, No. 4, p (April 1993). 17. Theunissen JJ, Minderhoud-Bassie W, Wagenvoort JH et al: Chlamydia trachomatis - specific antibodies in patients with pelvic inflammatory disease: comparison with isolation in tissue culture or detection with polymerase chain reaction. Genitourin Med 1994; 70: Saikku, P., K. Mattila, M.S. Nieminen, J.K. Huttunen, M. Leinonen, M.-R. Ekman, P.H. Mäkelä, and V. Valtonen Serological Evidence of an Association of a Novel Chlamydia, TWAR, with Chronic Coronary Heart Disease and Acute Myocardial Infarction. Lancet. 2: Saikku, P., M. Leinonen, L. Tenkanen, E. Linnanmäki, M-R Ekman, V. Manninen, M. Mänttäri, M. H. Frick, J.K. Huttunen Chronic Chlamydia pneumoniae Infection as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study. Ann. of Int. Med. 116: M. Paldanius et al, Chlamydia pneumoniae antibody levels before coronary events in the Helsinki Heart Study as measured by different methods. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 56 (2006) NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2 nd Ed. (1999) 22. Peeling RW, Brunham, RC. Chlamydiae as Pathogens: New Species and New Issues. Emerg Infect Dis (4): CDC/MMWR Summary of Notifiable Diseases, United States, Morb Mort Weekly 48 (53): at 3. Apr 6, CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4 th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). El manual de instrucciones del kit está disponible en francés, alemán, italiano y español en y en otros idiomas de su distribuidor local.

7 Página 7 AUTORIZADO REPRESENTANTE mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71, Langenhagen-Hannover, Alemania INFORMACIÓN PARA COMPRAS Teléfono: (562) (International) Fax: (562) PI.IF1250A.OUS-ES Rev. S Escrito el día: 17 octubre 2016 ASISTENCIA TÉCNICA Teléfono: (562) (International) Fax: (562) Visite nuestra página de web en: Cypress, California 90630, U.S.A.

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