Alasbimn Journal 11 (45) July 2009

Transcripción

1 11 (45) July 2009 Perera Pintado, Alej andro 1 Paredes Zaldív ar, Mayté 1 Kumar Mishra, Anil 2 Iznaga Escobar, Normando 3 Prats Capote, Anaís 1 Hernández Cairo, Abel 1 1. Centro de Investigaciones Clínicas, Ciudad de La Habana, Cuba 2. Department of Radiopharmaceutical Chemistry, Institute of Nuclear Medicine and Allied Sciences, Nueva Delhi, India 3. Centro de Inmunología Molecular, Ciudad de La Habana, Cuba Correspondencia: Alejandro Perera Pintado; Master en Ciencias Químicas, Especialista en Radiofarmacia: Centro de Investigaciones Clínicas 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfono: (537) Fax: (537) E- mail:alejandro.perera@infomed.sld.cu. Marcaje indirecto de anticuerpos monoclonales empleando la N2-dietilentriamino-pentaacetil lisina amida como agente quelatante del 99mTc. / Indirect labeling of monoclonal antibodies employing N2- diethylentriamine-pentaacetil lysine amide as 99mTc chelating agent. AJ45-2. Resumen Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos marcados se han empleado ampliamente en el diagnóstico y seguimiento de diferentes tipos de neoplasias. El objetivo del trabajo fue desarrollar una metodología para el marcaje indirecto de anticuerpos con 99m Tc, partiendo de la N 2 -dietilentriamino-pentaacetil lisina amida como agente quelatante. Mediante reacción con un exceso molar de 2-iminotiolano (1:200) y reducción con un exceso de 2-mercaptoetanol (1:2000) se generaron en el anticuerpo 3.5 ± 0.6 y 5.8 ± 0.5 grupos SH, respectivamente, por lo que se continuó el trabajo con la segunda metodología. Se incubó el h-r3 reducido durante 12 h con N6-ciclohexilmaleimido-N2-dietilentriaminopentaacetil lisina amida, obtenida previamente mediante la reacción de la N 2 - dietilentriamino-pentaacetil lisina amida con sulfosuccinimidil 4(N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato de sodio. La eficiencia de marcaje con 99m Tc del anticuerpo monoclonal h-r3 modificado según este método fue de (98.6±1.4) %, manteniendo una estabilidad satisfactoria hasta 24 h frente al exceso de L-cisteína (1:300). Conclusiones: La metodología desarrollada permitió el marcaje indirecto del anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 con 99m Tc de forma satisfactoria, empleando la N 2 -dietilentriaminopentaacetil lisina amida como agente quelatante bifuncional. Palabras claves: Anticuerpos monoclonales, 99m Tc, marcaje indirecto. Cita / Reference: Perera Pintado, Alejandro. Marcaje indirecto de anticuerpos monoclonares empleando la N 2 -dietilentriamino-pentaacetil lisina amida como agente quelatente del 99m Tc. Alasbimn Journal 11 (45):July Article N AJ Abstract Labeled monoclonal antibodies and their fragments are been widely employed for the diagnosis and follow up of different kinds of neoplasm. The aim of the present work was to develop a method for indirect labeling of antibodies with 99m Tc, using N 2 - diethylentriamine-pentaacetil lysine amide as chelating agent. By reactions with a 200-fold molar excess of 2-iminothiolane, and the reduction using a 2000-fold molar excess of 2-mercaptoethanol, 3.5 ± 0.6 and 5.8 ± 0.5 sulfhydril groups, respectively, were generated in the antibody. Thus, work was continued using the second procedure. Reduced h-r3 was incubated for 12 h with N6- cyclohexylmaleimide-n 2 -diethylentriamine-pentaacetil lysine amide, previously obtained by the reaction of N 2 -diethylentriaminepentaacetil lysine amide with sodium sulfosuccinimidyl 4(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate. Labeling efficiency of h-r3 monoclonal antibody, modified by this method with 99m Tc, was (98.6 ± 1.4) %. A satisfactory stability of the label was observed up to 24 h in presence of a 300-fold molar excess of L-cysteine. Conclusions: Developed procedure allowed satisfactory indirect labeling of the humanized monoclonal antibody h-r3 with 99m Tc, using N 2 - diethylentriamine-pentaacetil lysine amide as bifunctional chelating agent. Key words: Monoclonal antibody, 99mT c, indirect labeling. Introducción En los últimos años los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos marcados se han empleado ampliamente en el diagnóstico y seguimiento de diferentes tipos de neoplasias. [1, 2, 3, 4] Con este fin uno de los radioisótopos más usados ha sido el 99m Tc, debido a las ventajas que ofrece por sus propiedades físicas y su disponibilidad a un bajo costo a partir de generadores de 99 Mo/ 99m Tc. [5, 6] Para marcar las inmunoglobulinas con este isótopo, muchos autores prefieren usar agentes quelatantes bifuncionales, capaces de enlazarse por uno de sus extremos a la proteína y por el otro acomplejar con elevada estabilidad al metal. [6, 7] A través del tiempo se han empleado diferentes derivados del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) como agentes quelatantes bifuncionales, [8, 9] pero la baja estabilidad del complejo que forman con el 99m Tc unos y lo difícil de la obtención de otros, no ha 1/6 permitido la amplia difusión del empleo de estas moléculas para estos fines. [6] La N 2 -dietilentriamino-pentaacetil lisina amida (NH 2 -Lys-DTPA) puede ser obtenida de forma relativamente barata mediante síntesis en fase sólida. Además, la presencia de los grupos donantes de electrones de la lisina pudiera ayudar a aumentar la constante de estabilidad del quelato formado por esta molécula con el tecnecio. No se han encontrado aún reportes del empleo de este compuesto para el marcaje indirecto de proteínas.

2 El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una metodología para el marcaje indirecto de anticuerpos partiendo de la N2- dietilentriamino-pentaacetil lisina amida como agente quelatante del 99m Tc. Materiales y métodos Anticuerpo Monoclonal h-r3 El anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 es una IgG1, que reconoce con elevada afinidad el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (Kd=10-9 M). Este fue suministrado por el Centro de Inmunología Molecular, Ciudad de La Habana, Cuba, en viales que contenían la proteína a una concentración de 5 mg/ml en buffer fosfato salino (PBS) a ph= N 2 -dietilentriamino-pentaacetil lisina amida (NH 2 -Lys-DTPA) La NH 2 -Lys-DTPA obtenida por síntesis en fase sólida a partir de la reacción del grupo amino primario del aminoácido L-lisina con el dianhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético, fue suministrada por el Instituto de Medicina Nuclear y Ciencias Afines (Institute of Nuclear Medicine and Allied Sciences), Nueva Delhi, India. Generación de grupos sulfihidrilos en la molécula de h-r3 La generación de grupos sulfihidrilos en la molécula del anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 se realizó por dos vías: 1. Reacción con 2-iminotiolano (2IT): Se realizó partiendo de la metodología reportada por Tesic M. y cols. [10] Se hizo reaccionar el anticuerpo (5 mg/ml) con 2-iminotiolano (Sigma, EEUU) a una concentración de 2 mg/ml durante 30 min a temperatura ambiente. Se utilizó una relación molar h-r3:2it de 1:200. De esta manera se obtuvieron cadenas laterales de 1- imino-4-mercaptobutilo unidas a los grupos aminos primarios de los residuos de lisina y arginina, tal como se representa en la fig. 1. Fig. 1. Reacción del 2-iminotiolano con los grupos aminos de una inmunoglobulina. 1. Reducción con 2-mercaptoetanol (2ME): Con el fin de reducir los puentes disulfuros de la proteína, el h-r3 se incubó durante 30 min. a temperatura ambiente con exceso molar de 1:2000 de 2-mercaptoetanol (Sigma, EEUU), de forma similar a lo publicado por otros autores. [11, 12] Posteriormente, la proteína se purificó por cromatografía de filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25M (PD-10, Pharmacia, Suiza), empleando PBS 0.05 M ph= , previamente gaseado con nitrógeno, como fase móvil. Se colectaron fracciones de 500 μl en viales (Eppendorf), a las que se les determinó la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm en un espectrofotómetro UV-Visible (Ultrospec III, Pharmacia LKB, Suiza). Se empleó como blanco la solución de PBS. Se unieron en un vial las fracciones de mayor absorbancia. La concentración final de h-r3 se determinó midiendo la absorbancia a la misma longitud de onda de 280 nm de una muestra diluida 20 veces, tomando como coeficiente de extinción µ= Determinación de los grupos sulfihidrilos generados en la molécula de IgG La cantidad de grupos sulfihidrilos obtenidos por molécula de proteína se determinó por el método de Ellman. [13, 14] El reactivo de Ellman se preparó disolviendo 39.6 mg de ácido 5,5 -ditiobis-(2-nitrobenzoico) (Sigma, EEUU) en 10 ml de PBS 0.1 M ph=7.0. Se tomaron 200 µl de muestra y se le adicionaron 2.0 ml de PBS 0.1 M ph=8.0, 20 µl de reactivo de Ellman y 8.0 ml de solución salina. Se agitó en un vortex (ET MS2, Poly Labo, Francia), se incubó durante 10 min a temperatura ambiente y se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 412 nm en un espectrofotómetro UV-visible (Ultrospec III, Pharmacia LKB, Suiza). Se preparó una curva de calibración con soluciones de glutatión (Sigma, EEUU) a las siguientes concentraciones (en µg/ml): 12.3, 24.6, 49.2, 98.4, Se empleó como blanco una solución de PBS 0.02 M ph=8.0. Todas las mediciones espectrofotométricas se efectuaron antes de que transcurrieran 30 min después de adicionado el reactivo de 2/6

3 Ellman. Preparación del N6-ciclohexilmaleimido-N2-dietilentriaminopentaacetil lisina amida (CHM-Lys-DTPA) Se tomó 1 mg de NH2-Lys-DTPA y se disolvió en 500 μl de PBS 0.1 M ph=7.5, previamente nitrogenado. A esta solución se le adicionó suficiente sulfosuccinimidil 4(N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato de sodio (SMCC) (Pierce, EEUU). La relación molar empleada de NH 2 -Lys-DTPA:SMCC fue de 1:2. La solución obtenida se agitó en un vortex (ET MS2, Poly Labo, Francia) y se incubó durante 1h a temperatura ambiente. La reacción de obtención de la N6-ciclohexilmaleimido-N 2 -dietilentriaminopentaacetil lisina amida se representa por la ecuación química de la fig.2. Fig. 2. Síntesis de la CHM-Lys-DTPA a partir de la reacción entre la N2-dietilentriaminopentaacetil lisina amida y el sulfosuccinimidil-4-(n-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato. Obtención del conjugado de h-r3 con CHM-Lys-DTPA Se tomaron 2 mg de h-r3, al cual se le habían generado previamente grupos tioles a partir de las metodologías ya descritas, y se le adicionaron 25 μl de la solución de CHM-Lys-DTPA, preparada según el paso anterior. Se agitó en vortex (ET MS2, Poly Labo, Francia) y se incubó a 4ºC durante 12 h. El anticuerpo se purificó por intercambio iónico, utilizando una resina SP Sepharose (Pharmacia, Suiza). Para fijar la proteína se adicionó 1mL de buffer acetato 50 mm ph=5 y se mantuvo en agitación durante 30 min. Transcurrido este tiempo se centrifugó a 2000 rpm por 5 min., se desechó el sobrenadante y se lavó la resina varias veces con el buffer acetato. El h-r3 se extrajo en 1 ml de PBS 0.05M ph=6.5 gaseado con nitrógeno, agitando durante 1 hora. Posteriormente, se determinó la concentración del anticuerpo, midiendo la absorbancia de una muestra diluida 20 veces a la longitud de onda de 280 nm (coeficiente de extinción µ=0.712) y se dispensó en viales al vacío. La representación esquemática de la reacción química que debió ocurrir se muestra en la fig. 3. 3/6

4 Fig. 3. Representación esquemática de la reacción del CHM-Lys-DTPA con los grupos sulfihidrilos generados en el anticuerpo monoclonal humanizado h-r3. Marcaje del h-r3-chm-lys-dtpa con 99m Tc A 350 µg se le añadieron 33 μl de una solución de cloruro de estaño (II) de 2 mg/ml (Merck, Inglaterra) y 5 mci de pertecnetato de sodio. Se agitó fuertemente y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. La eficiencia de marcaje se determinó mediante cromatografía de papel ascendente, empleando como fase estacionaria tiras de 5 x 80 mm de papel Whatman 3MM. Como fases móviles se utilizaron: metiletilcetona y solución salina fisiológica. Después de la corrida, el papel se cortó a la mitad y la actividad de ambas mitades se midió en un radiómetro monocanal (SR8, NE Technology, Inglaterra). La cantidad de radiocoloides se valoró mediante cromatografía de filtración en gel en columnas de Sephadex G25M (Pharmacia, Suiza). Estabilidad del marcaje La estabilidad del anticuerpo marcado se valoró retando a éste contra un exceso molar de 1:300 de L-cisteína. Se tomaron muestras a los 30 min., 1h, 3h y 24h. La cantidad de 99mT c que se mantenía unida a la proteína se determinó mediante cromatografía de papel ascendente (como se describe anteriormente), empleando como fase móvil solución salina fisiológica. Resultados y discusión Obtención del conjugado El sulfosuccinimidil-4-(n-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) brinda la posibilidad de enlazar por uno de sus extremos a un grupo sulfihidrilo y por el otro, a un amino primario, actuando como puente de unión entre moléculas que presenten uno de estos grupos funcionales en su estructura. Anteriormente, ya había sido empleado este compuesto por Wang T.S.T. y cols. [15] con el objetivo de enlazar polilisina-dtpa a fragmentos F(ab ) 2 del anticuerpo monoclonal murino TP41.2. Como primer paso para poder lograr el conjugado, resultaba necesario generar en la proteína a marcar una cantidad suficiente de grupos sulfihidrilos capaces de reaccionar con la porción maleimido del SMCC. Con este fin se evaluaron dos técnicas descritas en la literatura: 1. reacción con 2-iminotiolano y 2. reacción con 2-mercaptoetanol. El 2-iminotiolano fue propuesto por Goedemans W.T. y Panet K.J. a finales de la década de los 80, [16] para obtener cadenas laterales de 1-imino-4-mercaptobutilo unidas a los grupos amino primarios de los residuos de lisina y arginina de las inmunoglobulinas. En la metodología reportada, estos autores disolvían el quelato bifuncional en dimetilsulfóxido, ya que en medio acuoso este reactivo se hidrolizaba. No obstante, no fue posible aplicar el procedimiento de este modo, ya que el anticuerpo h-r3 se desnaturaliza al adicionarle a la solución pequeñas cantidades de dimetilsulfóxido o N,N -dimetilformamida, cosa que no ocurría con su antecesor murino. Por esta razón, se decidió emplear una solución acuosa de 2IT y aumentar el exceso molar del agente quelatante bifuncional, tal como plantean otros autores. [10] La generación de grupos tioles endógenos en los anticuerpos mediante la reducción de los puentes disulfuros con 2ME fue propuesta por Schwarz A. y Steinstrasser A. en 1987 [11] y ha sido empleada por diferentes autores para marcar el h-r3 por vía directa tanto con 99mTc [17, 18], como con 188Re. [19, 20] Con el fin de determinar la cantidad de grupos sulfihidrilos desarrollados en la estructura de la inmunoglobulina, a partir de los dos procedimientos descritos con anterioridad, se empleó el procedimiento de Ellman. [13, 14] Thakur M.L. y DeFulvio J.D. [14] habían reportado el empleo de soluciones acuosas de cisteína para la preparación de la curva de calibración. La desventaja de este proceder consiste en que este aminoácido se oxida con relativa facilidad, pasando a formar la cistina. Este proceso de oxidación es menos acentuado en el caso del glutatión (γ-glutamilcisteinilglicina), por lo que se decidió preparar las soluciones patrones con este tripéptido. La curva obtenida se ajustó por regresión lineal, empleando el mètodo de los mínimos cuadrados a la siguiente ecuación: A 412 = -(5.4±4.6) (0.254±0.014)C Donde, A 412 es la absorbancia de la muestra medida a una longitud de onda de 412 nm y C es la concentración de glutatión en µm. Se determinó que la cantidad de grupos sulfihidrilos insertados en la estructura del anticuerpo mediante la reacción con 2- iminotiolano fue de 3.5 ± 0.6, mientras que se generaron 5.8 ± 0.5 grupos tioles a partir de la reducción de los puentes disulfuros de esta inmunoglobulina con 2-mercaptoetanol. Según los datos reportados en la literatura, mediante el empleo de cualquiera de estos métodos era de esperar que se obtuvieran entre 4 y 6 grupos tioles por cada molécula de anticuerpo. [6] En el presente estudio no ocurrió así; ya que la cantidad de cadenas laterales de 1-imino-4-mercaptobutilo unidas a los grupos amino primarios de la proteína resultó ser ligeramente inferior, a lo reportado por Goedemans W.T. y Panet K.J. [16] Es posible que esto se deba a la hidrólisis del 2- iminotiolano. Por su parte, Tesic M. y cols., [10] que emplean un procedimiento similar al propuesto en el presente trabajo, no reportan la cantidad de grupos sulfihidrilos, unidas al anticuerpo. Wang T.S.T. y cols. [15] emplearon una relación F(ab ) 2 : 2IT de 1:3, por lo que obtuvieron sólo 1.3 cadenas laterales de1-imino-4-mercaptobutilo enlazadas a la proteína, inferior a lo reportado en este trabajo. Estos resultados sugieren que sería necesario emplear un exceso molar mayor de 2IT para aumentar la cantidad de grupos tioles insertados en la proteína por este procedimiento. No obstante, el aumento de la relación molar h-r3:2it, podría afectar la inmunorreactividad del anticuerpo, provocado por la unión del reactivo a las regiones hipervariables 4/6

5 Al emplear la reducción con 2-mercaptoetanol la cantidad de grupos sulfihidrilos se encontraba en el rango descrito en la literatura [6] y se diferenciaba estadísticamente de los obtenidos mediante la reacción con 2IT (test de Student de dos colas, p=0.0258). Además, este proceder resultaba más sencillo, barato y rápido de hacer, por lo que se decidió continuar el procedimiento de conjugación a partir del anticuerpo reducido. Marcaje con 99m Tc Se considera que para poder ser administrado a un paciente, la pureza radioquímica de una inmunoglobulina marcada con 99m Tc debe ser superior al 90%, con un contenido de radiocoloides menor del 5%. El porciento de marcaje con 99m Tc del anticuerpo monoclonal h-r3 conjugado fue de (98.6 ± 1.4) % (n=3), con un rango de variación de 97.0 a 99.6 %, lo cual puede considerarse satisfactorio. En investigaciones realizadas con el anticuerpo FO23C5 marcado con 99m Tc se comprobó que, después de su administraciòn endovenosa, la L-cisteína (L-cys) marcada con 99mTc era la especie más abundante encontrada en la orina de animales [21] y pacientes. [22] Este aminoácido está presente en elevadas concentraciones en plasma y tejidos, y había sido capaz de transquelatar al tecnecio que se encontraba unido a la inmunoglobulina. Por esta razón, se recomienda en la literatura realizar los retos contra L- cisteína a diferentes concentraciones con el objetivo de predecir la transquelación in vivo. [23] En el presente estudio se empleó un exceso molar de L-cisteína de 300 respecto al anticuerpo, de forma similar a lo hecho por Hnatowich D.J. y cols. [7] Esta relación supera en varias veces la concentración de este aminoácido en sangre y tejidos que oscila entre 10 y 100 µm. Los resultados de la estabilidad del enlace del 99m Tc al anticuerpo se muestran en la fig. 4. Fig. 4. Estabilidad del anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 en solución reguladora de fosfato 0.05M ph 6.5 (control) y en presencia de un exceso molar de L-cisteína de 300 veces. Para la relación molar AcM:L-cys de 1:300 el porciento de disociación del 99m Tc reportado por Hnatowich D.J. y cols. [7] fue de 50% y 80% a las 4 y 24 h, respectivamente, mientras que Stalteri M.A. y Mather S.J. [24] obtuvieron a los mismos tiempos 10% y 60%. Está descrita en la literatura una estabilidad superior para los anticuerpos marcados con 99m Tc de forma indirecta con quelatos bifuncionales, con relación al marcaje que se produce de forma directa. [6, 7] Como se aprecia en la figura 5, en este trabajo no se detectó diferencia significativa en cuanto al porciento de disociación del radioisótopo de la proteína entre la muestra control y la que se encontraba en presencia de L-cisteína en los primeros puntos (30 min., 1 h y 3 h). A las 24 h de incubación se observó una transquelación significativa hacia el aminoácido (p= ). 5/6 Está reportado que al reaccionar el anhídrido del DTPA con la proteína, uno de los grupos carboxilo del agente quelatante es destinado a formar el enlace con uno de los aminos primarios, lo cual influye negativamente en la estabilidad de los complejos que forma este conjugado con los iones metálicos. [6, 9] Esta situación ha llevado al estudio de otros derivados como el 1-(p-isocianatobencil)-DTPA, [9] en el que los 5 carboxilos quedan disponibles para quelatar al metal, con el consiguiente incremento de la constante de estabilidad del complejo. La desventaja mayor de este compuesto es que resulta extremadamente caro adquirirlo, ya que su síntesis involucra una gran cantidad de pasos (más de 10) y los rendimientos finales son bajos. La NH 2 -Lys-DTPA es un derivado del DTPA, que por su obtención mediante síntesis en fase sólida es posible aumentar el rendimiento de la reacción (en un sólo paso) y se facilita su purificación, lo cual abarata el proceso. Es posible que la presencia de los grupos donantes de electrones (amino y amida) de la lisina, contribuya a disminuir la carga del agente quelatante, estabilizando de esta forma el complejo con el catión metálico, lo cual podría explicar el bajo porciento de transquelación al efectuar los retos contra cisteína. Resultados similares han sido obtenidos por Mishra A.K. y cols. (comunicación personal), al marcar péptidos que contenían Lys-DTPA en uno de sus extremos

6 La mayor limitante que presenta el empleo de la NH 2 -Lys-DTPA está dada por la cantidad de pasos involucrados en el enlace de esta molécula a la proteína, que implica varias etapas de purificación y encarece el proceso de escalado para obtener kits fríos liofilizados. Conclusiones La metodología desarrollada permitió el marcaje indirecto del anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 con 99m Tc de forma satisfactoria, empleando la N 2 -dietilentriaminopentaacetil lisina amida como agente quelatante bifuncional. 1. [ Simms M.S., Perkins A.C., Price M.R., Scholfield D.P., Bishop M.C. 99mTechnetium-C595 radioimmunoscintigraphy: A potential staging tool for bladder cancer. BJU Int. 2001; 88: Volver. Libutti S.K., Alexander H.R. Jr, Choyke P., Bartlett D.L., Bacharach S.L., Whatley M., et al. A prospective study of 2- [18F] fluoro-2-deoxy-d-glucose/ positron emission tomography scan, 99mTc-labeled arcitumomab (CEA-scan), and blind second-look laparotomy for detecting colon cancer recurrence in patients with increasing carcinoembryonic antigen levels. Ann Surg Oncol. 2001; 8: Volver. Matsumura H., Otsuji E., Kobayashi S., Okamoto K., Toma A., Yamagishi H. Potential usefulness of 99mTclabeled monoclonal antibody A7 for immunoscintigraphy of human pancreatic carcinoma. Anticancer Res. 2001; 21: Volver. Kalofonos H.P., Karamouzis M.V., Epenetos A.A. Radioimmunoscintigraphy in patients with ovarian cancer. Acta Oncol. 2001; 40: Volver. Hnatowich D.J. Is technetium-99m the radioisotope of choice for radioinmunoscintigraphy?. J Nucl Biol Med 1994; 38 (suppl 1): Volver. 6. Perera A., Pérez C. Radiomarcaje de anticuerpos con tecnecio-99m. Rev Esp Med Nucl 1998; 17: Volver Bibliografía Hnatowich D.J., Mardirossian G., Rusckowski M., Forgarosi M., Virzi F., Winnard P. Directly and indirectly labeled antibodies: a comparison of in vitro and animal in vivo properties. J Nucl Med 1993; 34: Volver. Hnatowich D.J., Layne W.W., Childs R.L. The preparation and labeling of DTPA-coupled albumin. Int J Appl Radiat Isot 1982; 33: Volver. Brechbiel M.W., Gansow O.A., Atcher R.W. Synthesis of 1-(p-isothio-cyanato-bensyl) derivates of DTPA and EDTA. Antibody labeling and tumor imaging studies. Inorg Chem 1986; 25: Volver. Tesic M., Sheldon K.M., Ballinger J.R., Boxen I. Labelling small quantities of monoclonal antibodies and their F(ab )2 fragments with technetium-99m. Nucl Med Biol 1995; 22: Volver. Schwarz A., Steinstrasser A. A novel approach to 99mTc-labelled monoclonal antibodies. J Nucl Med 1987; 27: 721. Volver. Mather JS, Ellison D. Reduction-mediated technetium-99m labeling of monoclonal antibodies. J Nucl Med 1990; 31: Volver. Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman s reagent. Anal Biochem 1968; 25: Volver. Thakur M.L., DeFulvio J.D. Determination of reduced disulfide groups in monoclonal antibodies. BioTechniques 1990; 8: Volver. Wang T.S.T., Fawwaz R.A., Alderson P.O. Reduced hepatic accumulation of radiolabeled monoclonal antibodies with indium-111-thioether-poly-l-lysine-dtpa-monoclonal antibody-tp41.2f(ab )2. J Nucl Med 1992; 33: Volver. Goedemans W.T., Panet K.J. A new simple method for labeling of proteins with 99mTc. J Nucl Med Allied Sci 1989; 33: 286. Volver. Morales-Morales A., Duconge J., Caballero-Torres I., Nunez-Gandolff G., Fernandez E., Iznaga-Escobar N. Biodistribution of 99mTc-labeled anti-human epidermal growth factor receptor (EGF-R) humanized monoclonal antibody h-r3 in a xenograft model of human lung adenocarcinoma. Nucl Med Biol 1999; 26: Volver. Morales A.A., Duconge J., Alvarez-Ruiz D., Becquer-Viart M.L., Nunez-Gandolff G., Fernandez E., et al. Humanized versus murine anti-human epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies for immunoscintigraphic studies. Nucl Med Biol 2000; 27: Volver. Perera A, Leyva R, Gamboa R, Alberdi L, Xiques A. Marcaje del anticuerpo monoclonal humanizado h-r3 con 188Re. Nucleus 2003; 33: Volver. Torres LA, Coca MA, Batista JF, Casacó A, Lopez G, Garcia I. Biodistribution and internal dosimetry of the 188Re labeled humanized monoclonal antibody anti-epidermal growth factor receptor nimotuzumab in the locoregional treatment of malignant gliomas. Nucl Med Comm (in press). Volver. Mardirossian G., Wu C., Rusckowski M., Hnatowich D.J. The stability directly labelled to an Fab antibody via stannous ion and mercaptoethanol reduction. Nucl Med Commun 1992; 13: Volver. Hnatowich D.J., Mardirossian G., Rusckowski M. Pharmacokinetics of the FO23C5 antibody fragment labelled with 99mTc and 111In, a comparison in patients. Nucl Med Commun 1993; 14: Volver. Hnatowich D.J., Virzi F., Fogarasi M., Rusckowski M., Winnard P. Jr. Can a cysteine challenge assay predict the in vivo behavior of 99mTc labeled to antibodies?. Nucl Med Biol 1994; 21: Volver. Stalteri M.A., Mather S.J. Technetium-99m labelling of the antitumour antibody PR1A3 by photoactivation. Eur J Nucl Med 1996; 23: Volver Alasbimn Journal 6/6