LA BIOGÉNESIS DEL QUISTE DE GIARDIA DUODENALIS COMO MODELO DE DIFERENCIACIÓN UNICELULAR

Transcripción

1 Bustos Jaimes I, Castañeda Patlán C, Oria Hernández J, Rendón Huerta E, Reyes Vivas H, Romero Álvarez I, (eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXXII. Depto de Bioquímica, Fac de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF, MÉXICO (2008). ( (ISSN X) LA BIOGÉNESIS DEL QUISTE DE GIARDIA DUODENALIS COMO MODELO DE DIFERENCIACIÓN UNICELULAR María Luisa Bazán-Tejeda, Raúl Argüello-García y Guadalupe Ortega-Pierres Departamento de Genética y Biología Molecular. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, México, D.F. gortega@cinvestav.mx Resumen Giardia duodenalis es un parásito de divergencia evolutiva temprana y uno de los principales agentes etiológicos causantes de infecciones entéricas en humanos y en otros vertebrados. Este protozoario sufre cambios complejos durante el enquistamiento, considerado como el proceso de diferenciación de trofozoíto a quiste que le permite sobrevivir fuera del intestino de su huésped. En el caso de Giardia, el enquistamiento ha sido crucial para sobrevivir exitosamente como parásito ya que el estadio de quiste es una entidad debidamente adaptada para su transmisión a un nuevo huésped y probablemente represente una forma de adaptación ancestral a ambientes adversos. El estudio del proceso de diferenciación a quiste resulta muy importante no solo por el impacto de este parásito en la salud humana sino también por su relevancia para entender la evolución de los mecanismos de diferenciación eucariótica. Así, el enquistamiento ha sido considerado como un modelo de estudio útil a nivel básico. A pesar de que se han reportado varios estudios sobre el enquistamiento en este parásito, aún no se conocen por completo los procesos moleculares por lo cuales el trofozoíto se enquista. En esta revisión, se discuten las evidencias moleculares y celulares conocidas hasta ahora respecto a la biogénesis del quiste de Giardia, incluyendo un análisis de su impacto potencial en epidemiología, profilaxis y diseño de fármacos para el control de la giardiasis. Palabras clave: Giardia duodenalis, enquistamiento, mecanismos moleculares, diferenciación en eucariontes. 25

2 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) Abstract The early divergent parasite Giardia duodenalis is a major cause of enteric disease that infects humans and other vertebrates. This protist undergoes a series of complex changes to survive outside the intestine of its host by differentiating into infective cyst. The process of encystment in Giardia is crucial for successfully live as parasite since the cyst is highly adapted to very hostile environments and it can easily be transmitted to a new host. This may represent an ancestral response for adaptation to non-favorable environments. The study of Giardia encystment is important due to the impact of the infection caused by this parasite on human health and also this may help to understand evolutionary mechanisms occurring in eukaryote differentiation. In spite of extensive studies on Giardia encystment, the molecular events involved in the encystment of trophozoites have not yet been fully defined. In this review we discuss cellular and molecular events concerning biogenesis of Giardia cysts, including a global overview of its impact on other studies. Keywords: Giardia duodenalis, encystment, molecular mechanisms, eukaryote differentiation. Introducción Giardia duodenalis (sinónimos: Giardia lamblia, Giardia intestinalis) es el agente etiológico causante de la Giardiosis. Esta infección es una enteropatía mundialmente endémica y ocasionalmente epidémica que afecta particularmente a la población pediátrica de países en vías de desarrollo [1]. La infección por Giardia puede ser asintomática o presentar diversos síntomas como la pérdida del apetito, diarreas agudas o crónicas y síndrome de malabsorción lo cual se ha asociado al retardo en el crecimiento y en consecuencia con cuadros de desnutrición [2]. El estudio de este parásito es importante tanto por su impacto sobre la salud humana como por su relevancia en el conocimiento de la evolución de los eucariontes, debido a que se ha considerado que Giardia tuvo una divergencia temprana en la escala evolutiva considerando estudios filogenéticos del RNA ribosomal, ATPasa vacuolar y del factor de elongación 2 [3]. Sin embargo su posición evolutiva aún es controversial debido a que recientemente se identificaron en Giardia diversas proteínas mitocondriales y también se detectaron estructuras similares a las mitocondrias a las que se les dió el nombre de mitosomas [4,5]. De acuerdo con estas evidencias se ha sugerido que Giardia surgió de un ancestro más evolucionado de lo que se había considerado, o que al menos Giardia presenta tanto características ancestrales como altamente evolucionadas que van de acuerdo con su actual condición de parásito. Ciclo de vida Este parásito tiene un ciclo de vida directo simple con dos estadios que permiten su sobrevivencia en dos tipos de ambiente desfavorables. La entidad patogénica o vegetativa conocida como trofozoíto se adhiere a las células del intestino ocasionando los síntomas de la giardiosis, en tanto que el quiste constituye la entidad infectiva. Así, este parásito presenta dos procesos de diferenciación que se llevan a cabo en el hospedero: el desenquistamiento y el enquistamiento. La infección se inicia mediante transmisión fecal-oral directa por la ingestión del 26

3 Bazán-Tejeda y cols. quiste que se encuentran en agua o alimentos contaminados. Una vez que el quiste se localiza en el estómago del hospedero se inicia el desenquistamiento desencadenado por la actividad de las enzimas hidrolíticas pancreáticas así como por el medio ácido de este órgano. Este proceso culmina en el duodeno y finaliza cuando se rompe la pared quística y emerge del quiste una masa tetranucleada de protoplasma denominada excizoíto [6]. A partir de un quiste se generan cuatro trofozoítos que se adhieren a las microvellosidades intestinales del duodeno y se dividen por fisión binaria, colonizando profusamente la mucosa intestinal. El enquistamiento se realiza principalmente en el yeyuno, probablemente por la acción de la bilis y productos de lipólisis [7]. Los quistes son expulsados por el huésped y permanecen en estado de latencia en el medio ambiente, teniendo una baja actividad fisiológica [8]. Debido a las características, particularmente de la pared del quiste, puede sobrevivir en el medio externo aún y cuando se presentan variaciones drásticas de ph y de tipo osmótico [9]. Asimismo, la eficiencia de la transmisión de Giardia depende en forma decisiva de la formación adecuada de esta estructura. En el proceso de enquistamiento de Giardia se distinguen cuatro fases: (a) Inducción y transducción del estímulo de enquistamiento, (b) Expresión diferencial de genes estadioespecíficos, (c) Síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste, y (d) Ensamblaje de la pared celular. Inducción y transducción de estímulos en el enquistamiento Aún no se han determinado en su totalidad cuáles son los estímulos inductores del enquistamiento in vivo, sin embargo existen evidencias de cuál sería la naturaleza de éstos debido a que este proceso de diferenciación ha sido reproducido in vitro siguiendo diversas estrategias que incluyen: (a) empleo de una atmósfera de de N 2 /CO 2 en una proporción de 90:10, (b) uso de altas concentraciones de sales biliares en el medio de cultivo y (c) empleo de medios deficientes en colesterol [10,11,12]. El segundo método ha sido el más reproducible y eficiente, por lo que ha sido empleado en la mayor parte de los estudios reportados en relación con el enquistamiento de este parásito. Así, se han logrado rendimientos de hasta 4 X 10 5 quistes/ml [13]. Aún cuando el enquistamiento de Giardia se puede reproducir in vitro, no se han dilucidado por completo las bases moleculares que activan la expresión diferencial de genes en este proceso. En otros eucariontes, la regulación de las interacciones tan complejas que ocurren tanto en la diferenciación como en la proliferación, está mediada en parte por redes de fosforilación de proteínas, las cuales son moduladas por cinasas y fosfatasas. En Giardia no se tiene información detallada sobre las bases moleculares de la fase inductiva del enquistamiento, aunque se han identificado algunos elementos de señalización que posiblemente participen en la inducción del enquistamiento. En cuanto a la asociación de la inducción del enquistamiento por ausencia de colesterol, recientemente se identificó en G. duodenalis el receptor denominado C k y la proteína de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP) los cuales participan en el control de la homeostasis celular del colesterol. En trofozoítos, se ha sugerido que el receptor C k funciona como un sensor de colesterol. La inactivación de este receptor trae como consecuencia el incremento de proteínas de la pared del quiste (CWP, específicamente la CWP1), sugiriendo que este receptor regula de manera negativa el enquistamiento. Así, la presencia del colesterol podría estar inhibiendo el proceso de diferenciación [14]. Al respecto, aun es necesario caracterizar la ruta de señalización que activa directamente el enquistamiento. Las cinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (conocidas como ERK1 y ERK2) también han sido identificadas en Giardia. De estas cinasas, se ha reportado que principalmente ERK1 presenta cambios de expresión y actividad durante el enquistamiento, por lo que se ha 27

4 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) sugerido que participa directamente en este proceso. Así mismo, se ha sugerido la participación de la proteína cinasa B o Akt (PKB), identificada recientemente empleando un anticuerpo que reconoce a un homólogo de mamífero [15]. La cinasa PKB presenta un aumento en su expresión durante el enquistamiento, por lo que se ha asociado a la inducción de este proceso [15,16]. Otra proteína implicada en el enquistamiento, que pertenece al grupo de las AGC cinasas en el cual también se incluye PKB es la proteína cinasas C (PKC). En Giardia duodenalis se han identificado las isoformas de PKC beta, delta, epsilon, theta y zeta. De manera interesante, estas proteínas mostraron diferentes patrones de expresión durante el enquistamiento y el inhibidor general de PKC, bisindolilmaleimida I, redujo significativamente este proceso sugiriendo su participación durante el enquistamiento. En este contexto, la única isoforma dependiente de Calcio, la PKC beta, presentó actividad de cinasa dependiente de los cofactores de PKC y de manera notable se redistribuyó hacia la membrana plasmática a los 10 min post-inducción de enquistamiento, indicando la posible activación de esta enzima durante la fase temprana del enquistamiento [17]. En este contexto, es importante señalar que homólogos de ERK y de PKC beta están involucradas en la vía de señalización que activa el proceso de formación de la pared celular en levaduras [18], lo cual sugiere que esta vía de señalización podría estar conservada en eucariontes con una función similar. En relación con PKB, en G. duodenalis se han identificado homólogos de varios elementos de señalización vinculados con PKB como la fosfatidil-inositol-3-cinasa ó PI3K (PI3K1 y PI3K2), el blanco de rapamicina (gtor), el factor de iniciación de la elongación 4E (eif4e) y la cinasa dependiente de fosfoinosítidos ó PDK1 [19,20]. Sin embargo, se requiere definir si la vía en la que participan estas moléculas activa la proliferación o la diferenciación. De hecho esta vía podría regular negativamente el enquistamiento mediante la actividad de TOR, ya que se ha reportado que en levaduras al inhibirse la actividad de TOR se induce la activación de la vía de señalización asociada con PKC1 que participa en el mantenimiento de la pared celular en estos organismos [21,22] (Figura 1). Por otra parte, recientemente se reportó que la subunidad regulatoria de la PKA de Giardia disminuye su expresión durante el enquistamiento [23], mientras que la subunidad catalítica se sobre expresa [24], lo cual pone de manifiesto su papel en los procesos de diferenciación de este parásito. En un estudio reciente se reportó que la proteína adaptadora , implicada en el reclutamiento de elementos de señalización, migra al núcleo durante el enquistamiento de G. duodenalis, indicando que probablemente se encuentra activada durante esta fase de diferenciación [25]. Finalmente, se ha caracterizado una serina/treonina fosfatasa 2 A (PP2A) que puede participar en la modulación de las vías de transducción durante la diferenciación, debido a que se sobre-expresa durante el enquistamiento tardío y al inicio del desenquistamiento; mostrando una distribución peculiar en la célula, ya que se ha detectado asociada al citoesqueleto de este parásito [26]. 28

5 Bazán-Tejeda y cols. Sensor de nutrientes o RTK? Receptor ó Sensor de nutrientes (Ck?) GiPI3K1 P K B PDK-1 PLC DAG? gpkc activa IP3 gpkc inactiva? gtor? ERK1 Proliferación? Síntesis de Proteínas? (Activación de eie4e ) [Ca +2 ] i PI(3,4,5)P 3 ó PI(4,5)P 2 ENQUISTAMIENTO Sales Biliares DAG Figura 1. Modelo hipotético de las vías de señalización asociadas al enquistamiento de G. duodenalis. En este esquema se muestran las vías de señalización propuestas que integran los elementos de transducción que a la fecha han sido caracterizados en G. duodenalis. El signo? indica que no se tienen evidencias bioinformáticas ni experimentales sobre las interacciones y efectos indicados en su caso. Expresión diferencial de genes estadio-específicos Durante la fase temprana de enquistamiento en este parásito, se induce la expresión de genes involucrados en la síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste. Algunos de los productos codificados por estos genes corresponden a las CWPs. Hasta el momento se han identificado CWP1, 2, 3 y la proteína del quiste no variante rica en cisteína ó HCNCp como las proteínas que forman parte de la pared del quiste. Las CWPs presentan dominios similares a un péptido señal amino terminal de secreción y repetidos en tandem que son ricos en leucina (LRRs) [27-30]. Por otro lado, la HCNCp tiene similitud con las proteínas variables de superficie (VSPs), las cuales pueden participar en mecanismos de evasión de la respuesta inmune conocidos como variación antigénica que presentan los trofozoítos [31]. Las CWPs se diferencian entre sí debido a que CWP2 tiene un dominio carboxilo terminal básico de 121 aminoácidos y CWP3 presenta solamente 4 repetidos ricos en leucina, mientras que CWP1 y CWP2 tienen 5 LRRs [28]. Estas proteínas se unen entre sí mediante sus LRRs formando 29

6 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) complejos estables de heterodímeros y mediante estudios de microscopía electrónica se ha observado que estas proteínas se localizan en la pared quística formando parte de los filamentos [9,32]. Las CWPs incrementan su expresión inmediatamente después de la inducción del enquistamiento al igual que otras proteínas como la glucosamina-6-fosfato isomerasa (GLN6PIb), la proteína BiP, Myb2, GLP1 y ENC6. Esta última fue identificada mediante una búsqueda en el transcriptoma de Giardia como una proteína que se sobre-expresa a partir de las 5 h postinducción del enquistamiento, y aún cuando no presentó homología con alguna proteína reportada, su identificación ha sido útil para estudiar las características estructurales del material genético de este parásito así como en la identificación de la región consenso de poliadenilación [33]. La proteína GLN6PI-b es la primera enzima involucrada en la síntesis de la N-acetil galactosamina [34]. BiP actúa como chaperona y se encontró unida a CWP1 en las vesículas específicas de enquistamiento (ESVs), por lo que se sugiere que impide las uniones prematuras de estas proteínas dentro de estas estructuras [35]. Myb2, GLP1, GARP y garid son factores de transcripción que han sido clonados y caracterizados en G. duodenalis, que se unen a las regiones promotoras de genes que se sobre-expresan durante el enquistamiento tales como CWP1, 2, 3 y gln6pi-b e incluso se ha reportado que Myb2 regula su propia expresión [36,37]. Además, se ha determinado que estos factores de transcripción incrementan su expresión durante la fase inductiva del enquistamiento [36-39]. A pesar de que se han reportado esta serie de evidencias aún no se conoce con detalle el orden secuencial de activación de genes y la forma exacta en la que operan estos factores de transcripción in vivo. Síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste Con respecto a los mecanismos implicados en el transporte de proteínas durante el enquistamiento, se ha observado que durante este proceso las células pierden su capacidad de adhesión, se redondean y comienza una vacuolización profusa. Estas vesículas son en parte las vesículas específicas de enquistamiento (ESV). Las ESVs transportan a las CWPs y otros elementos implicados en formación de la pared del quiste a la periferia de trofozoítos inducidos a enquistamiento [40,41]. En la Figura 2 se observan a las ESVs identificando a CWP1 a través de inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos que reconocen a esta proteína [42]. En esta figura se observa que las ESVs son específicas del enquistamiento, ya que en trofozoitos bajo crecimiento vegetativo no fue posible identificar a estas vesículas (Figura 2A) mientras que en los trofozoítos inducidos a enquistamiento se detectó inmunorreactividad que corresponde a las estructuras conocidas como ESVs (Figura 2B). Por otra parte, también se ha reportado que existe una relación estrecha entre las ESVs y las CWPs, debido que se determinó que la expresión y agregación de CWP1 recombinante induce la formación de las ESVs [43] sugiriendo que la formación y maduración de estas estructuras está condicionada al incremento y oligomerización de las CWPs durante el enquistamiento. Esta observación fue sustentada al determinar que las ESVs se desensamblan cuando son tratadas con el reductor DTT, lo cual podría ser consecuencia de la monomerización de las CWPs [44]. 30

7 Bazán-Tejeda y cols. Figura 2. Identificación de los las proteínas de la pared del quiste mediante inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos policlonales dirigidos contra las proteínas que forman esta estructura. (A) Trofozoítos en proliferación, (B) Detección de ESVs transportando los elementos de la pared del quiste en trofozoítos inducidos a enquistamiento durante 18 h. (C) Inducción de enquistamiento durante 90h. En la parte inferior se observa un trofozoíto enquistante con parches de material de la pared del quiste en la superficie, y en la parte superior se observan dos quistes morfológicamente distinguibles con tinción uniforme en la superficie. En los paneles del lado izquierdo se muestran fotomicrografías en campo claro y en los paneles del lado derecho los campos correspondientes con la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Tomado de Castillo- Figueroa (1997) (ref. 43). Mediante estudios de microscopía electrónica se observó la aparición de las ESVs desde las 6 h post-inducción de enquistamiento con una apariencia electrón-densa y se determinó que estas vesículas surgen del retículo endoplásmico [45]. Diversas evidencias experimentales sugieren que las ESVs representan un organelo similar al Aparato de Golgi, a pesar de que estas vesículas no poseen la forma aplanada o de cisterna típica del organelo de eucariontes 31

8 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) superiores. Estas estructuras presentan marcadores clásicos del Aparato de Golgi tales como coatómeros (Gi COP), BiP1, YIP1 (GiYip1) y ARF que es una proteína de unión a GTP [46,47]. Las ESVs también presentan propiedades funcionales de Aparato de Golgi, ya que el transporte de CWP1 es inhibido en presencia de Brefeldina A, el cual es un metabolito fúngico que actúa como bloqueador del intercambio de nucleótidos de guanina de ARF, lo que ocasiona el desensamble del Aparato de Golgi en eucariontes al prevenir la unión de ARF y coatómeros [46]. Las estructuras que corresponden al Aparato de Golgi se han observado conspicuas durante el enquistamiento de G. duodenalis, aunque también se han detectado estructuras con características de Aparato de Golgi en los trofozoítos que no han sido inducidos a enquistamiento [40]. El Aparato de Golgi se ha observado mediante el marcaje con NBDceramida tanto en las membranas de las ESVs como en la periferia nuclear de los trofozoítos que no son inducidos a enquistamiento (46,48). Esta evidencia sugiere que probablemente el Aparato de Golgi en este parásito es críptico, incipiente o en ocasiones ausente en los trofozoítos que no enquistan [40,46,48]. En cambio, durante el enquistamiento esta estructura se hace más evidente por los requerimientos propios del estadio como son: un transporte exhaustivo de los elementos necesarios para la formación de la pared del quiste, la maduración o modificaciones post-traduccionales de estos elementos y el ensamblaje de la pared quística. Por otra parte, también se ha determinado que en G. duodenalis ciertas funciones del retículo endoplásmico y Golgi co-localizan o se yuxtaponen espacialmente y temporalmente en una novedosa vía de secreción que está regulada [45]. En su conjunto, estos datos enfatizan que este parásito posee características muy particulares, las cuales probablemente derivan de su divergencia evolutiva temprana o tal vez sean una consecuencia de la co-evolución que experimentaron como consecuencia de la relación huésped-parásito. Ensamblaje de la pared quística En relación con la composición de la pared quística, se ha determinado que está integrada por una porción interna membranosa y una externa filamentosa de μm [49]. La pared filamentosa externa esta compuesta de proteínas (37%) y de filamentos del carbohidratos (63%), principalmente de un homopolímero de N-acetil galactosamina [50-52]. El precursor de este homopolímero es la UDP-N-acetilgalactosamina (UDP GlcNAc), la cual se sintetiza a partir de glucosa por una vía de enzimas que se sobre-expresan durante el enquistamiento [53]. Estas enzimas son: glucosamina-6-fosfato isomerasa, glucosamina-6-fosfato N-acetilasa, fosfoacetilglucosamina mutasa, UDP-GlcNAc pirofosforilasa y UDP-GlcNAc 4 epimerasa [54]. El UDP-GalNAc se convierte posteriormente en un homopolímero de (1-3)-D-GalNAc por la actividad la enzimática tentativamente llamada sintasa de la pared del quiste [55,56]. En cuanto al depósito de los elementos que forman la pared del quiste aparentemente éstos son liberados en la periferia de los trofozoítos por las ESVs mediante exocitosis; al respecto se ha observado que las membranas de las ESVs presentan continuidad con la membrana plasmática [40, 13]. La secreción de los elementos de la pared de quiste, de las ESVs hacia la periferia celular, se observó al utilizar el trazador catiónico Rojo de Rutenio (RR) que presenta 6 cargas positivas que le permiten unirse a los extremos de las proyecciones fibrilares en proceso de polimerización (Figura 3A) [9]. 32

9 Bazán-Tejeda y cols. A ESV 0.1 μm B C 0.1 μm D 0.1 μm E F 1 μm 1 μm 1 μm Figura 3. Identificación del ensamble extracelular de la pared del quiste de Giardia mediante la tinción con Rojo de Rutenio (RR). (A) Estructuras fibrilares en formación detectadas en la superficie dorsal de los trofozoítos mediante el marcaje con RR (cabezas de flechas). (B) Depósito de la malla fibrilar sobre la región dorsal del trofozoíto positiva a RR mostrando pliegues en la superficie celular (flechas). (C) Pared del quiste completamente ensamblada, mostrando las capas fibrilar (OCW) y membranosa (ICW) la cual es refractaria a la tinción con RR, indicando un posible cambio en los sitios de unión o en la carga neta del heteropolímero. (D) Detección de ESVs (flechas) en trofozoítos inducidos a enquistamiento durante 18 h. (E) Identificación de vesículas periféricas en un quiste en el cual se está efectuando la formación del espacio peritrópico (cabezas de flecha). (F) Quiste maduro de Giardia que presenta 4 núcleos, pared quística y espacio peritrópico (cabezas de flecha) completamente conformados. N, Núcleo; Ad, disco adherente; OCW, porción externa de la pared del quiste; ICW, porción interna de la pared del quiste; ESVs, vesículas específicas de enquistamiento. Tomado de Argüello-García (2003) (ref. 13). 33

10 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) Así, se ha sugerido que durante la formación de la pared, los polipéptidos como las CWPs son transportados por las ESVs a la periferia celular (Figura 3A y 3D) y se depositan inicialmente en la superficie del trofozoíto, mientras que los precursores de N- acetilgalactosamina se integran posteriormente a la pared del quiste para finalmente copolimerizarse y formar la malla fibrilar. Al respecto, la CWP1 se ha identificado en las ESVs desde las 5.5 h post-inducción de enquistamiento; en cambio, la identificación de N- acetilgalactosamina mediante la tinción con RR sobre la superficie de trofozoítos enquistantes se observó hasta las 9-10 h post-inducción [9]. La formación de la pared del quiste se realiza por regiones, debido a que se encuentran parches de malla fibrilar dispersos en la superficie de los trofozoítos inducidos a enquistamiento (Figura 2C), los cuales son más evidentes a las h post-inducción. Estos parches aparecen al azar y al multiplicarse se unen entre sí y en ocasiones se sobrelapan engrosando la malla fibrilar. Esta condición le proporciona a la membrana del trofozoíto una apariencia rugosa durante esta fase extracelular del enquistamiento. Al terminar el ensamblaje de la pared del quiste, esta estructura se torna lisa y homogénea (Figura 2C y 3C). En estas circunstancias, la pared del quiste presenta tinción negativa a RR porque probablemente ya no expone los sitios de unión a este compuesto o porque la carga neta del polímero ha cambiado [9]. En cuanto a la estructura membranal interna de la pared del quiste, se ha sugerido que se forma por la fusión de las vesículas periféricas (PV). Estas últimas presentan características de endosomas tempranos y tardíos que van a formar los lisosomas en Giardia [57]. La unión de las membranas de las vesículas periféricas y la formación del espacio peritrópico se observó mediante el análisis de las células en proceso de enquistamiento empleando microscopía electrónica, lo que sugiere que mediante este proceso se forma la bicapa lipídica de la porción interna membranosa de la pared del quiste y el espacio peritrópico, que es el espacio que encuentra entre ambas membranas [58]. Impacto y relevancia del estudio del enquistamiento El conocimiento de los mecanismos del enquistamiento ha sido muy relevante en el diseño de vacunas [59] ya que se propone emplear en el diseño de fármacos con el propósito de interrumpir la transmisión de G. duodenalis [60]. En este contexto, recientemente se produjo una vacuna de DNA que contiene la secuencia de CWP2 expresada en Salmonella thypimurium. Mediante el empleo de este vector en la inmunización de modelos experimentales previo a la infección con G. duodenalis se observó una reducción del 60% en la liberación de quistes en los modelos experimentales empleados debido a la estimulación de la respuesta inmune mucosal [59]. Esta respuesta se caracterizó por un incremento de células T CD4 + tanto a nivel mucosal como sistémico así como por un incremento de IL4 e IFN en células de bazo y de nódulos linfáticos mesentéricos en los modelos experimentales inmunizados, siendo estas condiciones del sistema inmune análogas a las que se presentan durante la eliminación de Giardia [61,62]. En cuanto al diseño de fármacos se pretende llevar a cabo inserciones de secuencias de nucleótidos que presentan los diversos genes que codifican a las proteínas involucradas en el enquistamiento ya que estas secuencias diferenciales se pueden utilizar para el diseño racional de fármacos. Entre estos elementos se encuentran algunas proteínas de señalización como la PKC y GiPI3K [17,19]. Asimismo, algunos inhibidores de PKC se están estudiando para fines terapéuticos, 34

11 Bazán-Tejeda y cols. entre éstos se encuentran las bisindolilmaleimidas Enzastaurina (LY HCl) y Ruboxistaurina (LY333531) para el tratamiento de neoplasias o diabetes, respectivamente [63,64]. Por otro lado, se tienen evidencias sobre el efecto de fármacos dirigidos contra PKCs de otros eucariontes patógenos, a este respecto se ha determinado que la Cercosporamida, un fármaco que se emplea exitosamente en el tratamiento de la infección por Candida albicans, es un inhibidor especifico de la CaPKC1p. De manera interesante, este compuesto no se une a las PKCs de mamífero [65] lo cual hace posible su empleo efectivo en el control de la infección por este organismo. Asimismo, la síntesis de la N-acetilgalactosamina también puede ser interrumpida al inhibir la actividad de alguna de las enzimas implicadas en la vía de síntesis lo cual ya se esta llevando a cabo en levaduras patógenas. En este contexto, en levaduras se ha puesto especial atención en el desarrollo de inhibidores de la sintasa de glucano (1-3) debido a que esos compuestos pueden interrumpir la formación de la pared celular [66]. Finalmente el estudio del enquistamiento de G. duodenalis presenta ventajas adicionales debido a la posición filogenética muy particular de este parásito. Así, el conocimiento de los mecanismos implicados en el enquistamiento de Giardia permitirá emplear a este parásito como un modelo para establecer similitudes y diferencias del enquistamiento en otros parásitos protozoarios e incluso en la diferenciación de eucariontes. Agradecimiento Este trabajo fue financiado en parte por CONACyT proyecto No M. Referencias 1. Lane, S., y Lloyd, D. (2002) Crit. Rev. Microbiol. 28, Huang, D. B., y White, A. C. (2006) Gastroenterol. Clin. North Am. 35, Lloyd, D., y Harris, J. C. (2002) Trends Microbiol. 10, Sogin, M. L., Gunderson, J. H., Elwood, H. J., Alonso, R. A., y Peattie, D.A. (1989) Science 243, Tovar, J., León-Avila, G., Sánchez, L. B., Sutak, R., Tachezy, J., van der Giezen, M., Hernández, M., Muller, M., y Lucocq, J. M. (2003) Nature 426, Bernander, R., Palm, J. E., y Svärd, S.G. (2001) Cell Microbiol. 3, Gillin, F. D., Reiner, D. S., y Boucher, S. E. (1988) Infect. Immun. 56, Jarroll, E. L., Macechko, P. T., Steimle, P. A., Bulik, D., Karr, C. D., van Keulen, H., Paget, T. A., Gerwig, G., Kamerling, J., Vliegenthart, J., y Erlandsen, S. (2001) J. Eukaryot. Microbiol. 48, Argüello-García, R., Argüello-López, C., González-Robles, A., Figueroa, A. M., y Ortega-Pierres, M. G. (2002) Parasitology 125, Sterling, C. R., Kutob, R. M., Gizinski, M. J., Verastegui, M., y Stetzenbach, L. (1988) En Advances in Giardia Research (ed. Wallis, P. M. y Hammond, B. R.), University of Calgary Press, Calgary 11. Gillin, F. D., Reiner, D. S., Gault, M. J., Douglas, H., Das, S., Wunderlich, A., y Sauch, J. F. (1987) Science 235, Luján, H. D., Mowatt, M. R., y Nash, T. E. (1997) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61, Argüello-García R. (2003) Tesis de Doctorado. CINVESTAV-IPN. México 14. Kaul, D., Rani, R., y Sehgal, R. (2001) Mol. Cell Biochem. 225, Ellis, J. G., M, y Chakrabarti, R. (2003) J. Biol. Chem. 278, Kim, K. T., Mok, M. T., y Edwards, M. R. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, Bazán-Tejeda, M. L., Argüello-García, R., Bermúdez-Cruz, R. M., Robles-Flores, M., y Ortega-Pierres, G. (2007) Arch. Microbiol. 187, Levin, D. E. (2005) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69, Cox, S. S., van der Giezen, M., Tarr, S. J., Crompton, M. R., y Tovar, J. (2006) BMC Microbiol. 6, 45 35

12 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) 20. Morrison, H. G., Zamora, G., Campbell, R. K., y Sogin, M. L. (2002) Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 133, Krause, S. A., y Gray, J. V. (2002) Curr. Biol. 12, Torres, J., DiComo, C. J., Herrero, E., y De La Torre-Ruiz, M. A. (2002) J. Biol. Chem. 277, Gibson, C., Schanen, B., Chakrabarti, D., y Chakrabarti, R. (2006) Int. J. Parasitol. 36, Abel, E. S., Davids, B. J., Robles, L. D., Loflin, C. E., Gillin, F. D., y Chakrabarti, R. (2001) J. Biol. Chem. 276, Lalle, M., Salzano, A. M., Crescenzi, M., y Pozio, E. (2006) J. Biol. Chem. 281, Lauwaet, T., Davids, B. J., Torres-Escobar, A., Birkeland, S. R., Cipriano, M. J., Preheim, S. P., Palm, D., Svärd, S. G., McArthur, A. G., y Gillin, F. D. (2007) Mol. Biochem. Parasitol. 152, Mowatt, M. R., Luján, H. D., Cotten, D. B., Bowers, B., Yee, J., Nash, T. E., y Stibbs, H. H. (1995) Mol. Microbiol. 15, Luján, H. D., Mowat, M. R., Conrad, J. T., Bowers, B., y Nash, T. E. (1995) J. Biol. Chem. 270, Davids, B. J., Reiner, D. S., Birkeland, S. R., Preheim, S. P., Cipriano, M. J., McArthur, A. G., y Gillin, F. D. (2006) PLoS ONE. 1, e Sun, C. H., McCaffery, J. M., Reiner, D. S., y Gillin, F.D. (2003) J. Biol. Chem. 278, Nash, T. E. (2002) Mol. Microbiol. 45, Erlandsen, S. E., Macechko, P. T., Van Keulen, H., y Jarrol, E. L. (1996) J. Eukaryot. Microbiol. 43, Que, X., Svärd, S. G., Meng, T. C., Hetsko, M. L., Aley, S. B., y Gillin, F. D. (1996) Mol. Biochem. Parasitol. 81, Knodler, L. A., Svärd, S. G., Silberman, J. D., Davids, B. J., y Gillin, F. D. (1999) Mol. Microbiol. 34, Luján, H. D., Mowatt, M. R., Byrd, L. G., y Nash, T. E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, Sun, C. H., Palm, D., McArthur, A. G., Svärd, S. G., y Gillin, F. D. (2002) Mol. Microbiol. 46, Yang, H., Chung, H. J., Yong, T., Lee, B. H., y Park, S. (2003) Mol. Biochem. Parasitol. 128, Sun, C. H., Su, L. H, y Gillin, F. D. (2006) Mol. Biochem. Parasitol. 146, Wang, C. H., Su, L. H., y Sun, C. H. (2007) J. Biol. Chem. 282, Reiner, D. S., McCaffery, M., y Gillin, F.D. (1990) Eur. J. Cell Biol. 53, Faubert, G., Reiner, D. S., y Gillin F. D. (1991) Exp. Parasitol. 72, Castillo-Figueroa, A. M. (1997) Tesis de licenciatura. CINVESTAV-IPN. Morelia, Mich. 43. Gottig, N., Elías, E. V., Quiroga, R., Nores, M. J., Solari, A. J., Touz, M. C., y Luján, H. D. (2006) J. Biol. Chem. 281, Reiner, D. S., McCaffery, J. M., y Gillin, F. D. (2001) Cell Microbiol. 3, Lanfredi-Rangel, A., Attias, M., Reiner, D. S., Gillin, F. D., y De Souza, W. (2003) J. Struct. Biol. 143, Luján, H. D., Marotta, A., Mowatt, M. R., Sciaky, N., Lippincott-Schwartz, J., y Nash, T. E. (1995) J. Biol. Chem. 270, Marti, M., Li, Y., Schraner, E. M., Wild, P., Köhler, P., y Hehl, A. B. (2003) Mol. Biol. Cell 14, Lanfredi-Rangel, A., Kattenbach, W. M., Diniz, J. A. Jr, y De Souza, W. (1999) FEMS. Microbiol. Lett. 181, Erlandsen, S. L., Bemrick, W. J., y Pawley, J. (1989) J. Parasitol. 75, Jarroll, E. L., Manning, P., Lindmark, D. G., Coggins, J. R., y Erlandsen, S. L. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 32, Manning, P., Erlandsen, S. L., y Jarroll, E. L. (1992) J. Protozool. 39, Gerwig, G. J., van Kuik, J. A., Leeflang, B. R., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F., Karr, C. D., y Jarroll, E. L. (2002) Glycobiology 12, López, A. B., Sener, K., Trosien, J., Jarroll, E. L., y van Keulen, H. (2007) J. Eukaryot. Microbiol. 54, Macechko, P. T., Steimle, P. A., Lindmark, D. G., Erlandsen, S. L., y Jarrol, E. L. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, Jarrol, E. L, y Paget, T. A. (1995) Folia Parasitol. (Prague) 42, Karr, C. D., y Jarroll, E. L. (2004) Microbiology 150, Lanfredi-Rangel, A., Attias, M., de Carvalho, T. M., Kattenbach, W. M., y De Souza, W. (1998) J. Struct. Biol. 123, Chávez-Munguía, B., Cedillo-Rivera, R., y Martínez-Palomo, A. (2004) J. Eukaryot. Microbiol. 51, Abdul-Wahid, A., y Faubert, G. (2007) Vaccine 25, Jarroll, E. L., y Sener, K. (2003) Drug Resist Updat. 6,

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14 MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008) en la patogenia de la giardiosis. Así mismo, estudia los mecanismos que participan en la activación de respuestas inmunes protectoras a nivel intestinal en infecciones experimentales con Trichinella spiralis con la finalidad de identificar antígenos que puedan ser empleados en la prevención de la triquinelosis y lleva a cabo la identificación de moléculas de importancia biológica durante el desarrollo del parásito adulto. 38