TECNICA DE INMUNOHISTOQUIMICA *IHQ*

Transcripción

1

2 Hospital General ISSS TECNICA DE INMUNOHISTOQUIMICA *IHQ* Tec. Delmy de Chávez Sep/2010

3 Estufa EQUIPO BASICO

4 Baño de María EQUIPO BASICO

5 Microscopio EQUIPO BASICO

6 Medidor de ph. EQUIPO BASICO

7 Refrigeradora exclusiva para IHQ EQUIPO BASICO

8 Bascula analítica EQUIPO BASICO

9 REACTIVOS BASICOS Descripción. PBS para Lavar TRIS Recuperador antigénico Hidróxido de sodio Alcohol acido Acetona Xilano Hematoxilina de Mayer Amoniaco (Toxico) Carbonato de litio Peroxido de Hidrogeno (toxico) DAB (carcinogénico)

10 TECNICA DE IHQ Para un proceso técnico de Inmunohistoquímica IHQ se requiere de la solicitud debidamente rotulada por el medico.

11 LAMINAS CON ADHESIVO Se clasifican en: Cargadas Xilanizadas (comerciales y preparadas en el laboratorio de IHQ) y de Poly-l-lisina Nota: Se rotulan las laminas con el numero de biopsia, anticuerpos a marcar y control positivo.

12

13 Controles positivos Importancia: Calidad de elaboración de técnica. Confirmación de diagnostico. Respaldo legal

14 CORTE Procedimiento Enfriar los bloques y cortar en el microtomo (de tres a cinco micras). Se utiliza cuchilla descartable. Cuidar que el corte sea liso y no presente pliegues. Se utiliza el baño de flotación a 45 grados centígrados de temperatura. Secar en la estufa por 30 minutos a 60 grados centígrados.

15 MICROTOMO

16 ESTUFA

17 RECUPERACION ANTIGENICA Se dividen en: Enzimática No Enzimática Enzimática: La temperatura optima y el tiempo de incubación dependerá del tiempo en que los tejidos hayan sido sometidos al tipo de fijador del antigeno buscado.

18 CONTINUACION RECUPERACION ANTIGENICA No Enzimática: Horno microondas. Su uso es un método muy eficiente para el tratamiento de la recuperación antigénica. Se recomienda estandarizar la cantidad de solución a usar, el numero de laminas a tratar y el tiempo de procesamiento; la potencia ideal del horno será aquella que haga ebullir la solución después de 2 a 3 minutos y que a final del ciclo retenga al menos al 70%.

19 CONTINUACION RECUPERACION ANTIGENICA (No Enzimática) Vaporera. También representa una buena alternativa y se puede combinar con el uso de microondas. Baño de María. tiene varias ventajas en general es accesible en cualquier laboratorio, fácil de utilizar y produce buenos resultados.

20 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS O TAMPON Estas soluciones cumplen una función muy importante en las técnicas de IHQ ya que son el medio en el cual se desarrolla el reconocimiento del antigeno por los anticuerpos así que debe de parecerse mucho a las condiciones normales que tiene en el organismo vivo (ph.7.3 a 7.4).

21 RECUPERACION ANTIGENICA EN SOLUCIONES AMORTIGUADORAS O TAMPON (ph. 7.6) Se calienta el Baño de María a grados centígrados con la solución recuperadora (Citrato de sodio con ph. 6.0 o recuperador antigénico.) Se colocan las laminas de 45 minutos a una hora y se dejan enfriar por 20 minutos. Colocar en PBS

22 BLOQUEO DE LA PEROXIDASA ENDOGENA Colocar las laminas en solución de peroxide de hidrogeno al 3% durante una hora (sirve para eliminar el exceso de sangre) Lavar rápidamente con agua destilada

23 Marcadores EPITELIALES: Citoqueratina Ag de membrana epitelial Ag carcinoembrionario LINFOCITOS: CD 45 (Ag común leucocitario) CD 20 (L26 Linfocitos B) CD 68

24 Marcadores MESENQUIMALES: Vimentina Desmina Actina Nota: Leer instructivo.

25 Preparación de Anticuerpos Primarios Colocar en PBS Preparar anticuerpos primarios

26 DILUCIONES 1: parte de anticuerpo y 19 partes de diluyente 1: parte de anticuerpo y 99 partes de diluyente 1: parte de anticuerpo y 499 partes de diluyente 1: parte de anticuerpo y 999 partes de diluyente Nota: los resultados dependen de cada laboratorio

27 INCUBACION Limpiar alrededor del tejido el exceso de PBS

28 Colocar el anticuerpo primario INCUBACION

29 INCUBACION Incubar con el anticuerpo primario en una cámara húmeda cuidando de que el nivel de agua sea adecuado y que este no se derrame tapar bien y evitar corriente de aire y luz mantener 45 minutos o durante toda la noche.

30 Autostainer plus

31 INCUBACION Lavar con PBS Incubar con el anticuerpo secundario durante 45 minutos

32 INCUBACION Lavar con PBS Incubar con el complejo AB durante 45 minutos Lavar con PBS Revelar con DAB

33 Revelado Incubar el tiempo necesario para que el color marrón aparezca, detener la acción reveladora con agua del chorro

34 Revelado Revisar en el microscopio la reacción

35 Contraste Lavar con agua Contrastar con hematoxilina de Mayer los citoplasmáticos con verde brillante los nucleares Secar en la estufa y montar

36 Finalización del Proceso

37 Gracias