Bioquímica y Patología Clínica Asociación Bioquímica Argentina ISSN (Versión impresa): ARGENTINA

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1 Bioquímica y Patología Clínica Asociación Bioquímica Argentina info@aba-online.org.ar ISSN (Versión impresa): ARGENTINA 2006 Orlando Gabriel Carballo ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS CÍCLICOS CITRULINADOS (ANTI-CCP) EN ARTRITIS REUMATOIDEA Bioquímica y Patología Clínica, año/vol. 69, número 003 Asociación Bioquímica Argentina Buenos Aires, Argentina pp Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal Universidad Autónoma del Estado de México

2 Anticuerpos Anti-Péptidos Cíclicos Citrulinados (anti-ccp) en Artritis Reumatoidea Orlando Gabriel Carballo Bioquímico. Especialista en Inmunología. Lugar de Trabajo Unidad Inmunología Hospital C.G.Durand Laboratorio Manlab Enviar Correspondencia a: Orlando Gabriel Carballo : gabriel@carballo.com.ar RESUMEN La Artritis Reumatoidea (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica poliarticular, inflamatoria, crónica, que afecta al 1 2 % de la población mundial, caracterizada por múltiples deformidades y asociada con una considerable morbilidad y mortalidad. Aunque la etiología exacta de la AR no se conoce, existen fuertes evidencias de su naturaleza autoinmune ya que distintos autoanticuerpos están asociados con la enfermedad. Durante el primer tiempo de la enfermedad, raramente se reúnen los criterios de la Colegio Americano de Reumatología revisados en El curso impredecible y altamente variado de la enfermedad sugiere la necesidad de pruebas diagnósticas altamente sensibles y específicas. La AR está clasificada entre la enfermedades autoinmunes debido a la presencia de factor reumatoideo (FR). Sin embargo, el FR no es muy específico y puede ser hallado en otros desordenes reumáticos, infecciones y en individuos sanos. Además del FR, otro grupo de autoanticuerpos ha sido detectado recientemente en el suero de pacientes con AR: anticuerpos anti-péptidos cíclicos citrulinados. Estos autoanticuerpos fueron reportados como poderosos marcadores serológicos para el diagnóstico temprano de la AR y el pronóstico de la destrucción del tejido sinovial. Esto sugiere la posibilidad que la citrulinación de proteínas intraarticular puede ser el evento inicial que lleve a la producción de autoanticuerpos. Otro hecho a considerar es el factor genético, como ser el polimorfismo genético de la enzima Peptidil Arginina Deaminasa que podría estar asociado a la ruptura de los mecanismos de tolerancia e inducción de la autoinmunidad. Palabras Clave anticuerpos anti-péptidos cíclicos citrulinados, filagrina, factor perinuclear, Artritis Reumatoidea. SUMMARY Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN Código Bibliográfico: RByPC Trabajo Recibido: Aceptado: Rheumatoid Arthritis is a systemic, chronic, inflammatory autoimmune polyjoint disease, characterized by multiple deformities and associated with a considerable morbidity and mortality, affecting 1 2% of the world population. Although the precise etiology of RA remains unknown, there is strong evidence for the autoimmunity nature, since several autoantibodies are associated with the disease. During the first time of the disease, the 1987 revised criteria of the American College of Rheumatology (ACR) are rarely met. The highly variable and unpredictable course of the disease suggests the need for highly sensitive and specific diagnostic tests. RA is categorized among systemic autoimmune disease because of the presence of rheumatoid factor (RF). However RF are not very specific for this disease and can also be found in other rheumatic disorders, infections and in healthy individuals. Besides the rheumatoid factor (RF), another group of autoantibodies has recently been detected in serum of patients with RA: the anti-cyclic citrullinated peptide antibodies. These autoantibodies have reported to be a powerful serologic marker for early diagnostic of RA and prognostic of joint destruction. Anti-citrullinated protein antibodies are locally produced in RA joints, and are localized in synovial tissue. This suggests a possibility that local citrullination of intraarticular proteins might be the initial event leading to autoantibody production. The genetic factor is another issue to be considered, like the gene polymorphism of the Peptidyl Arginine Deiminase, that might be associated with the breakage of self-tolerance and induction of autoimmunity. Keywords Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, filaggrin, perinuclear factor, Rheumatoid Arthritis

3 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 69 Nº Artículo: págs Pág INTRODUCCION La Artritis Reumatoidea (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica articular, inflamatoria, crónica, que afecta al 1 2 % de la población mundial, caracterizada por múltiples deformidades y asociada con una considerable morbilidad y mortalidad. Aunque no se conoce la etiología precisa de la enfermedad hay fuertes evidencias de su origen autoinmune ya que existe una elevada asociación entre la aparición de autoanticuerpos y la enfermedad. El diagnóstico de la AR se basa principalmente en manifestaciones clínicas con un limitado soporte serológico 2/3. La única prueba serológica mencionada entre los criterios diagnósticos de AR es la determinación de factor reumatoideo (FR) en suero, un autoanticuerpo dirigido contra la región constante (Fc) de la inmunoglobulina G, realizado por cualquier método en el que se demuestre un valor predictivo negativo igual o mayor al 95 %. Las técnicas utilizadas van desde la aglutinación de glóbulos rojos de carnero 4 (Rose-Waller en Inglaterra), la aglutinación de partículas de látex, hasta las nuevas técnicas de nefelometría y ELISA, ésta última permite evaluar las distintas clases de inmunoglobulina (FR-IgG, FR-IgA y FR-IgM). Habitualmente se determina el isotipo IgM (FR-IgM). Aunque tiene una sensibilidad del 70 a 80 % su especificidad es baja ya que es detectado en otras enfermedades del tejido conectivo 5, enfermedades crónicas hepáticas e infecciones y, dependiendo del sistema en estudio, hasta el 15 % de individuos sanos, aumentando la prevalencia de reacciones positivas con la edad. La injuria articular progresa dentro de los dos primeros años de la enfermedad, el diagnóstico temprano y el tratamiento agresivo puede evitar esta evolución. El FR ha fracasado como marcador temprano de enfermedad ya que usualmente esta ausente o es variable en AR de menos de un año de evolución. En los últimos años se han descrito nuevos de autoanticuerpos en AR y se ha discutido su importancia clínica y posible rol patogénico. Anticuerpos anti-keratina (AKA), Factor perinuclear (FAP) que reacciona con epitopes de la profilagrina y anticuerpos anti-filagrina (AFA) fueron los primeramente descritos. Estas proteínas siguen una vía común postraslacional que involucra la deaminación de péptidos que contienen arginina a través de la enzima Peptidil Arginina Deaminasa (PAD) a péptidos ciclicos citrulinados 6/7. Otros autoanticuepos son: anti-sa dirigido contra un antígeno abundante en tejido placentario y en la sinovial de pacientes con AR 8, anti-ra33 que reconoce la proteína A2, asociada al complejo de ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares 9, anti-ra1 dirigido contra los dominios 3 y 4 de la calpastatina, un inhibidor de la calpaina, miembro de las cisteínas proteinasas implicadas en el daño articular 10. En 1998 Schellekens 7 describe un anticuerpo contra péptidos ciclicos citrulinados en el suero de pacientes con AR y van Jaarsveld demostró su especificidad 11. Las determinación de anticuerpos anti-péptidos cíclicos citrulinados (anti-ccp), mediante la técnica de ELISA, se está imponiendo al resto debido a su razonable sensibilidad y elevada especificidad para el diagnóstico de AR. Aparece como un marcador temprano de enfermedad y un factor pronóstico de la destrucción articular. Como ventaja adicional el ELISA es una prueba de fácil realización en un laboratorio de rutina y automatizable. En este trabajo se discutirá la naturaleza de éstos autoantígenos, importancia clínica y posible significado etiopatogénico de los autoanticuerpos anti-ccp en pacientes con AR. Identificación de las proteínas Citrulinadas como autoantígenos específico de la AR y su significado etiopatogénico El FAP, descrito por Nienhuis y Mandema en , reacciona con gránulos de keratohialina perinucleares distribuídos alrededor del núcleo de las células de la mucosa bucal, identificados por inmunofluorescencia indirecta (IFI) (Foto 1). Su sensibilidad se encuentra entre el 49 y el 91 % de los pacientes con AR y su especificidad entre el 73 y el 99 %. Esta determinación presenta diversos inconvenientes metodológicos, por ejemplo sólo el 5 al 10 % de los donantes de células de mucosa bucal presentan estos gránulos de keratohialina alrededor del núcleo. La dependencia en la disponibilidad de dadores y los inconvenientes en la realización de la IFI son las principales razones por las cuales esta determinación no es rutinariamente usada. Los AKA, determinados por IFI, están dirigidos contra el estrato corneo del tercio medio del esófago de la rata (Foto 2), fueron originalmente descriptos por Young en , presentando una buena especificidad (88 al 99%) y una pobre sensibilidad (35 al 59 %) 14. Aunque se utilizó el término de anti-keratina, debido a que la reacción positiva coloreaba la estructura cornificada del epitelio del esófago, el autoantígeno no había sido identificado en aquel momento. Nuevamente, esta técnica Foto 1. Factor perinuclear (FAP). Inmunofluorescencia indirecta en células de mucosa bucal, se observa el núcleo coloreado con bromuro de etidio y la coloración positiva en los gránulos de keratohialina alrededor del núcleo.

4 Anticuerpos Anti-Péptidos Cíclicos Citrulinados (anti-ccp) en Artritis Reumatoidea Foto 2. Anticuerpos anti-keratina. Corte criostático de esófago de rata donde se observa la positividad en el estrato corneo. Figura 1. Cambios postraslacionales de la Filagrina por acción del estrés oxidativo por la enzima Peptidil Arginino Deaminasa (PAD) no se impuso entre los estudios rutinarios de laboratorio debido al inconveniente de la disponibilidad de sustrato y la técnica de IFI, para la cual se necesita un especialista en la interpretación de las imágenes. Se ha propuesto una relación inmunológica entre FAP y AKA debido a la fuerte correlación de positividad entre estos dos anticuerpos en el suero de pacientes con AR. Los anticuerpos anti-fap y un anticuerpo monoclonal específico para profilagrina humana producen patrones idénticos en la inmunofluorescencia indirecta 12. Simon y colaboradores 15 identificaron como una isoforma de la filagrina, un extracto proteico de 40 KD proveniente de epidermis humana, que reacciona específicamente con suero de pacientes con AR en western blots. Una fracción de la IgG purificada por afinidad de sueros de pacientes usando esta proteína de 40 KD fue reactiva en ambos pruebas, FAP y AKA 16. Todas estas experiencias indican que los dos anticuerpos, al menos en parte, reaccionan con los mismos epitopes. Su elevada especificidad, elevador valor predictivo positivo y el hecho de ser un marcador diagnóstico temprano, son indicativos del posible rol de estos anticuerpos en la patogénesis de la AR. Estos anticuerpos se unen a determinantes antigénicos que contienen un aminoácido inusual, la citrulina, formado por modificaciones postraslacionales de residuos de arginina por la PAD, dando lugar a péptidos citrulinados. (Figura 1). De esta manera se destruyen puentes salinos, interfiriendo en la formación de puentes de H, con pérdida de carga positiva, lo que interfiere en la formación de filamentos intermedios. Existen cinco isotipos altamente conservados en todas las especies de mamíferos (PAD1 a PAD 4 y PAD 6). La principal diferencia entre los isotipos es su expresión específica de tejido. Todos los sustratos de las enzimas PAD son proteínas que tiene una función estructural, por ejemplo filamentos intermedios, histonas, keratina, fibrina 17. Esta enzima requiere elevadas concentraciones de calcio para su actividad (10-5 mol/l). Normalmente la concentración de calcio intracelular es mucho menor (10-7 mol/l) y la enzima se activa durante determinados eventos que llevan a la elevación de la concentración de calcio, como ser durante la muerte celular o la inflamación 18. La filagrina es producida durante el último estadío de diferenciación de las células epiteliales de los mamíferos. Ésta, es sintetizada como una proteína precursora fuertemente fosforilada, la profilagrina, de aproximadamente 400 kda, formada por 10 a 12 filagrinas repetidas de 324 secuencias de aminoácidos. La profilagrina es depositada en gránulos, y la filagrina es liberada por proteólisis durante la diferenciación celular. Durante este estado, la proteína es defosforilada y aproximadamente un 20 % de los residuos de arginina son convertidos en citrulina. La gran heterogeneidad en la secuencia de aminoácidos de la filagrina (30 a 40 % de los residuos de aminoácidos de las unidades repetidas de filagrina son variables) y la citrulinación de los residuos de arginina dan como resultado una gran heterogeneidad en la carga 19. Es interesante discutir el efecto que tiene la citrulinación de la proteína. Mientras la arginina tiene carga positiva, la citrulina tiene carga neutra, esto lleva a una disminución en la carga neta de la proteína. Como resultado la proteína adopta una estructura alterada, generalmente mas abierta. Este cambio puede provocar una alteración en la función de la proteína y mostrar epitopes crípticos que pueden llevar a la ruptura de la tolerancia y la respuesta autoinmune. El rol de los autoanticuerpos anti-ccp en la patogénesis de la AR es poco claro aún. Posiblemente existan distintos hechos que asocien los anticuerpos anti-ccp con la AR, la muerte celular, la inflamación, el aumento en la concentración de calcio, la asociación a factores genéticos, pueden llevar a un incremento de la citrulinación de proteínas con la consiguiente producción de autoanticuerpos previo a la manifestación de los síntomas

5 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 69 Nº Artículo: págs Pág clínicos específicos para la enfermedad. Se podría plantear un paralelismo entre la AR y la enfermedad celíaca. La enfermedad celíaca es una enfermedad crónica intestinal causada por una respuesta inmune a antígenos del gluten luego que la transglutaminasa actúa sobre la gliadina, generando un neoantígeno que es presentado, en el contexto de moléculas HLA específicas, al sistema inmune, que lo desconoce como propio generando una respuesta autoinmune. En la AR la citrulinación puede llevar a la modificación de un autoantígeno desenmascarando un epitope críptico que se une a moléculas de HLA clase II iniciando una respuesta autoinmune. IMPORTANCIA CLÍNICA DEL ANTICUERPO ANTI-CCP El requerimiento más importante para un buen marcador diagnóstico es su especificidad para la enfermedad, y que sea positivo en un porcentaje relativamente elevado de pacientes. Distintos trabajos han demostrado que el anticuerpo anti-ccp muestra un buen balance entre sensibilidad y especificidad 20/21. Los primeros equipos para determinar anticuerpos anti-ccp utilizaban como antígeno distintas variantes lineales de filagrina. La sensibilidad mejoró con la introducción de cambios cíclicos del péptido en la cual residuos citrulinados eran expuestos a la unión del anticuerpo, esto dio origen a la primera generación de anti-ccp 22. Sin embargo, como la filagrina no se proponía como agente desencadenante de la autoinmunidad ya que no estaba presente en la articulación, de una librería peptídica se seleccionaron algunos más específicos. Esto dio origen a la segunda generación de equipos para la determinación de anti-ccp 23, que demostró tener un muy buen valor predictivo positivo (50 %) y valor predictivo negativo (75 %). En un estudio multicéntrico 79 % de los pacientes con AR, 0 % de los normales y 5 % de los pacientes con enfermedad control dieron el ensayo positivo 24. Mientras que en otro estudio, utilizando anti-ccp de segunda generación, dieron positivos el 82 % de AR crónica, 1 % de individuos sanos, y 2 % de pacientes con enfermedad control 25. En uno de los primeros trabajos donde se utilizó un equipo de anti-ccp de segunda generación se demostró un valor diagóstico adicional de este anticuerpo, el 38,4 % de los pacientes con AR seronegativos para el FR dieron positivos para anticuerpos anti-ccp 26. Una significante proporción de individuos que padecen hepatitis a virus C (HCV) sufren una forma de poliartritis simétrica que recuerda a la AR, ya que la mayoría de ellos dan positivos para el FR, éste no sirve para discriminar la artritis asociada a HCV de la AR. En cambio los anti-ccp discriminaban entre AR y artropatías asociada a HCV 27. Del mismo modo cuando un paciente con lupus eritematoso sistémico tiene asociado un fenómeno de poliartritis puede confundirse con AR. En un trabajo realizado con una gran cohorte de pacientes (n=231) con lupus eritematoso sistémico (LES), 10 tenían enfermedad articular erosiva, de los cuales 6 tenían FR positivo mientras que solo 2 presentaban valores positivo para anti-ccp. De los pacientes con LES que no presentaban artritis erosiva solo el 0,5 % dio anti-ccp positivo, contrastando con un 18 % de FR 28. Todos estos estudios confirman que la determinación de anti- CCP es una herramienta muy importante en el diagnóstico de AR. Diagnóstico temprano de la AR En la mayoría de las enfermedades, uno de los principales objetivos de los médicos es hacer un diagnóstico temprano para iniciar el tratamiento y conseguir una mejor evolución. En la AR se pueden evidenciar daños radiográficos significativos dentro de los primeros dos años de la enfermedad. En la mayoría de los casos de AR, los síntomas clínicos de comienzo son suaves y no específicos y, generalmente, los pacientes no completan los criterios de la clasificación de la ACR 2/3. Desde hace muchos años los investigadores han estado buscando un autoanticuepo que sea un marcador temprano de AR. Los anti-ccp pueden ser detectados en cerca del % (sensibilidad) de los pacientes con AR temprana, usualmente después de 3 6 meses de la aparición de los primeros síntomas 29. La especificidad de los anticuerpos anti-ccp es, aproximadamente del % con respecto a las formas de artritis indiferenciadas que no desarrollan AR. El Factor Reumatoideo IgM específico es frecuentemente encontrado en estos pacientes pero con menor especificidad para AR. El diagnóstico diferencial entre la Artritis Reumatoidea de reciente comienzo y la Polimialgia Reumática (PMR) puede ser difícil debido a la ausencia de marcadores séricos. La presencia de anticuerpos anti-ccp en pacientes con síntomas de PMR, puede ser interpretado como altamente sugestivo de AR de reciente comienzo 30. Los Anti-CCP pueden predecir el desarrollo de AR por años 31. Un estudio utilizando un ensayo de anti-ccp de segunda generación encuentra que el 93 % de los pacientes con anti-ccp positivo con formas indiferenciadas de poliartritis progresa a AR, mientras que sólo el 25 % de los pacientes con poliartritis indiferenciada con anti-ccp negativo evolucionan a AR después de los 3 años de seguimiento. La presencia de anticuerpos anti- CCP daba una odd ratio del 37.8 en predecir el desarrollo de AR dentro de los tres años 32. Los anticuerpos anti-ccp aparecen como un nuevo marcador inmunológico sensible y específico para el diagnóstico de la AR, especialmente útil en las formas iniciales de la enfermedad. Además de sus propiedades diagnósticas, algunos autores también han sugerido que los anticuerpos anti-ccp tienen valor pronóstico basados en estudios que muestran una asociación de los mismos con las formas erosivas de la enfermedad.

6 Anticuerpos Anti-Péptidos Cíclicos Citrulinados (anti-ccp) en Artritis Reumatoidea ANTI-CCP COMO FACTOR PREDICTOR DE ENFERMEDAD SEVERA Distintas observaciones indican que la presencia de anticuerpos anti-ccp en la AR se asocia al desarrollo de una enfermedad más erosiva 33/34. La probabilidad que la puntuación de Sharp (método para evaluar la afección articular en pacientes con AR) aumente luego de seis meses, fue significativamente mas alta en los pacientes con anti-ccp positivos que en los pacientes con FR IgM positivos, por lo tanto, los anticuerpos anti-ccp se muestran como un factor predictor independiente de daño radiológico y progresión de la enfermedad 35. Sin embargo otros autores demostraron que la combinación del FR IgM y el anticuerpos anti-ccp tienen la capacidad de predecir la actividad erosiva y la progresión de la enfermedad 36. RELACIÓN DEL ANTI-CCP Y EL TRATAMIENTO Los reportes de respuesta de los anticuerpos anti-ccp a la terapia con anti-tnf son contradictorios. En un estudio de 62 pacientes con AR refractaria al tratamiento, tratados con anti- TNF se observaba una disminución en los títulos de FR sin una disminución de los anti-ccp (p = 0,240) Esto sugeriría que tanto el FR como los anti-ccp son dos sistemas independiente de anticuerpos en la AR 30. Otro estudio, sin embargo, demuestra que, en un grupo de pacientes tratados con anti-tnf, se podía constatar una disminución del título, tanto del FR como de los anticuerpos anti-ccp en aquellos pacientes que presentaban mejoría clínica, sugiriendo que estos anticuerpos podían ser una herramienta útil para medir la eficacia del tratamiento 37. Serán necesarios mas estudios, multicéntricos y controlados, para investigar la respuesta de los anti-ccp al tratamiento. CONCLUSION Los anticuerpos anti-ccp representan una gran promesa como marcador de enfermedad temprana, pueden predecir la evolución a AR de un paciente que presenta una artritis indiferenciada, y tienen la capacidad de distinguir la artritis erosiva de la no erosiva. Si el anti-ccp fuera utilizado en la rutina diaria para el diagnóstico de la AR juntamente con el FR, se debería considerar nuevos criterios diagnósticos y de clasificación para la Artritis Reumatoidea. En el tejido sinovial de la articulación de pacientes con AR se puede identificar fibrina citrulinada, esto conlleva a la síntesis local de autoanticuerpo anti-proteína citrulinada. Estos descubrimientos sugieren fuertemente la posibilidad que la citrulinación intraarticular de proteínas podría ser el evento inicial que guía a la producción de autoanticuerpos en la AR. Factores genéticos tales como el HLA y el polimorfismo de la enzima PAD pueden estar asociados a la ruptura de la tolerancia y la inducción de autoinmunidad contra proteínas citrulinadas. Muchas investigaciones se deben sumar con el fin de aclarar los mecanismos y el significado de la citrulinación de proteínas en la etiopatogenia de la Artritis Reumatoidea. BIBLIOGRAFIA 1 Pincus T. Long-term outcomes in rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol. 1995;34Suppl 2: Arnett, F. C.; Edworthy, S. M.; Bloch, D. A. et al. The ARA 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: pp Jacobsson, L. T. H.; Knowler, W. C.; Pillember, S. et al. A crosssectional and longitudinal comparison of the Rome criteria for active rheumatoid arthritis (equivalent to the American College of Rheumatology 1987 criteria for rheumatoid arthritis). Arthritis Rheum 1994; 37: pp Waaler E. 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