T4. Métodos para cuantificar la variación genética. Marcadores moleculares

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1 T4. Métodos para cuantificar la variación genética. Marcadores moleculares Haplotipo(HT): combinación única de marcadores genéticos que se hallan en un cromosoma. Por ej: las distintas secuencias de bases de un segmento de ADN corresponden con distintos haplotipos. Individuos con el mismo HT e individuos con HT Para cuantificar la variabilidad al nivel de secuencias de ADN utilizamos dos medidas poblacionales: Polimorfismo nucleotídico = PN = θ s Diversidad nucleotídica = DN = π s Polimorfismo nucleotídico = PN = θ s Estima la proporción de sitios nucleotídicos que se espera sean polimórficos en una población. Se da por sitio Necesitamos conocer: L = longitud de la secuencia analizada (en pares de bases = pb) S = proporción de sitios polimórficos observados en la muestra S = nº de sitios polimórficos / L θ = S/a 1 a 1 = 1/i (i = 1 a n 1) n = nº de secuencias analizadas V(θ) = θ/(l.a 1 ) + a 2 θ 2/ a 1 2 a 2 = 1/i 2 s = V(θ) No de HT, sino de secuencias = nº de individuos ó nº de cromosomas analizados Ejemplo: DATOS vistos cuando la secuenciación Sec. 1 TGGC 4969 Tabla pob. pob. Sec. 2 CA.. Haplotipo A TGGC A 3 0'375 Sec. 3 C..T Haplotipo B CA.. B 1 0'125 Sec. 4.A.T Haplotipo C C..T C 1 0'125 Sec. 5.A.T Haplotipo D.A.T D 2 0'250 Sec Haplotipo E..A. E Sec. 7..A. Sec L = longitud de la secuencia analizada = 20 (20 posiciones analizadas) n = nº de secuencias analizadas = 8 S = proporción de sitios polimórficos observados en la muestra = 4/20 = 0'2 θ = S/a 1 = 0'2/2 593= a 1 = 1/i (i = 1 a n 1 = 1 a 7) = 1/1 + 1/2 + 1/3 + ¼ + 1/5 + 1/6 + 1/7 = a 2 = 1/i 2 = 1/1 + 1/4 + 1/9 + 1/16 + 1/25 + 1/36 + 1/49= 1'5118 V(θ) = θ/(l.a 1 )+ a 2 θ 2/ a 12 = 0'0771/(20 x 2 593) + (0' x 1'5118)/( ) = X 10 3 s = V(θ) = 0'0531 θ = PN = 0'0771 0'0531 1

2 T4. Métodos para cuantificar la variación genética. Marcadores moleculares DN = nº de diferencias promedio que espero encontrar entre 2 secuencias, tomadas al azar de: la población (intrapoblacional) 2 poblaciones, una de cada población, (interpoblacional) = promedio de diferencias entre dos secuencias = número medio de sustituciones por sitio. = diferencias /(C * L) Diferencias = suma de las diferencias entre las comparaciones de secuencias (2 a 2). C = nº de comparaciones realizadas L = longitud (en pb) de la secuencia analizada Estima de C: n= nº de secuencias, es decir, nº individuos o nº de cromosomas, pero no nº de HT diferentes a) intrapoblacional: C a = n(n 1)/2 comparaciones dos a dos b) interpoblacional: C e = n 1 x n 2 comparaciones dos a dos n 1 = nº de secuencias en la 1ª población. n 2 = nº de secuencias en la 2ª población. Estimas de la suma de diferencias: 2 métodos: 1º) comparar dos a dos todas las posibles parejas (C comparaciones) entre las secuencias, anotar las diferencias que hay entre ellas (M i ) y sumarlas = ( M i )/(L.C) a) Secuencias : M i Sec1 Sec2 Sec3 Sec4 Sec5 Sec6 Sec7 Sec8 Sec Sec Sec Sec Suma = 49 Sec Sec6-1 0 Sec7-1 Sec8 - b) Haplotipos: A B C D E Frecuencia Suma = 2x3x1 + 2x3x1 + 2x3x2 + A x3x1 + 2x1x1 + 2x1x2 + B x1x1 + 2x1x2 + 3x1x1 + C x2x1 = 49 D 2-3 E 1 - Diferencias = 49 n = secuencias = = 8 C = comparaciones = n(n 1)/2 = 8.7/2 = 28 = ( M i )/(L.C) pi = 49/(20x28) = 0'0875 V( ) = (b 1 /L). + b 2. 2 b 1 = (n+1)/(3(n 1)) b 2 = 2(n 2 + n +3)/(9n(n 1)) s = V( ) 2

3 2º) Calcular, para cada sitio, el nº de diferencias al comparar 2 a 2 las secuencias. Sumar los valores obtenidos para cada sitio (T j ) = ( T j )/(L.C) n Haplotipo A T G G C 3 Haplotipo B C A.. 1 Haplotipo C C.. T 1 Haplotipo D. A. T 2 Haplotipo E.. A. 1 L = 20 n = =8 Diferencias: Sitio 4 : T (3+2+1) = 6 C (1+1) = 2 aporta 6*2 = 12 Sitio 9 : G ( + + ) = A ( + ) = aporta 5*3 = 15 Sitio 16 = 7*1 sitio 19 = 5*3 T j = = 49 = ( T j )/(L.C) = 49/(20x28) = 0'0875 b 1 = (n+1)/(3(n 1)) = 9/3x7 = b 2 = 2(n 2 + n +3)/(9n(n 1)) = 2(64+8+3)/(72x7)= 150/504 = 0'2976 V( ) = (b 1 /L). + b 2. 2 = (0'0875x0'4286)/20 + (0'2976 x 0' ) = ( )x 10 3 = x 10 3 s = V( ) = 0' = DN = 0'0875 0'0644 T 1 C 1 C 2 A 3 A Ejemplos de cálculo de diferencias si se trata de 2 poblaciones 1 er método: G H I J K A B C D E F x2x1 + 0x2x3 + 1x2x7 + 1x2x5 + 3x2x2 + 1x1x1 + 1x1x3 + 2x1x7 + 2x1x5 + 1x1x2 + 2x1x1 + 1x1x3 +. = 261 Comparaciones = ( ) x ( ) = 18 x 21 = 378 = 261/(378 x L) 3

4 Nº de secuencias = Rosa = = 17 Azul = = 20 Rosa = 17*16/2 = 136 Azul = Rosa * azul = Rosa = Posición 16 : 14 x 3 = 42 Posición 49 :: 9*8+5*3 = 87 Posición 150 : Posición 270 : Posición 321 : Posición 476 : Suma = 345 Suma = 582 Azul = Posición 16 : 13 x 7 = 91 Posición 49 : 15*5 = 75 Posición 150 : 8*12 = 96 Posición 270 : 8*12 = 96 Posición 321 : 13 * 7 = 91 Posición 476 : 6*14+7*7 = 133 Nº de secuencias = Rosa = = 17 Azul = = 20 Rosa = 17*16/2 = 136 Azul = 20*19/2 = 190 Rosa * azul = 17*20 = 340 Suma = 345 Suma = 582 interpoblacionales Posición 16 : 14*7 + 14* 1+ 3*12+ 3*1 = 14*8 + 3*13 = 151 Posición 49 : 5*15+9*5+3*20 = 180 Posición 150 : 12*8+5*12 = 156 Posición 270 : 17*8 = 136 Posición 321 : 10*7+7*13 = 161 Posición 476 : 8*20+2*14+7*13 = 279 Suma =

5 Rosa = 136 Azul = 190 Rosa * azul = 340 Suma = 345 Suma = 582 Suma = 1063 : 345/(136x500) = 5 07 x /(190*500) =6 13 x /(340*500) = 6 25 x 10 3 b 1 = (n+1)/(3x(n 1)) = 18/(3x16) = b 2 = 2(n 2 +n+3)/(9n(n 1)) = V( ) = b 1. /L + b 2. 2 = 1 03 x ,38 x 10 5 σ = 3,21 x ,71 x 10 3 = (5,07 3,21) x 10 3 (6,13 ± 3,71) x

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