HAV IgG. Imuno-ELISA E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones

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1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Stapleton, J.T.: Hepatitis A Virus. In: Spencer, S. editor. Viral Hepatitis Diagnosis, Therapy, and Prevention. Human Press, New Jersey, 7-33, Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: The Enteric Hepatitis Viruses: HAV and HEV. In Viral Hepatitis. BIOS, United Kingdom, 62-88, Bower, W.A., Nainan, O.V., Han, X., et al.: Duration of viremia in hepatitis A virus infection. J Infect Dis, 182:12 17, Clemens, S., Fonseca, J., Azevedo, T., Cavalcanti, A., Silveira, T., Castilho, M., Clemens, R.: Hepatitis A and hepatitis B seroprevalence in four centers in Brazil. Rev Soc Bras Med Trop, 33:1-10, Sagnelli, E., Coppola, N., Marrocco, C. et al.: HAV replication in acute hepatitis with typical and atypical clinical course. J. Med. Virol.: 71(1): 1-6, Rezende, G., Roque-Afonso, A.M., Samuel, D. et al.: Viral and clinical factors associated with the fulminant course of hepatitis A infection. Hepatology, 38 (3): , Turgeon, M.L.: Viral Hepatitis. Immunology & Sorology In Laboratory Medicine, 3rd Ed., Mosby: , Jacobsen, K.H., Koopman, J.S.: Declining hepatitis A seroprevalence: a global review and analysis. Epidemiol. Infect., 132(6): , 04. Jacobsen, K.H., Koopman, J.S.: Declining hepatitis A seroprevalence: a global review and analysis. Epidemiol Infect.,132(6): , 04. MS Imuno-ELISA HAV IgG Kit para determinação qualitativa de Anticorpos Anti-Vírus da Hepatite A, classe IgG, no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative detection of Anti-HAV (Hepatitis A Virus) Antibody, IgG Class, in human serum or plasma, by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit para determinación cualitativa de Anticuerpos Anti-Virus de la Hepatitis A, classe IgG, en suero o plasma humano, por enzimainmunoensayo (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 05/13 EC R E P WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax Obelis S.A. Boulevard Général Wahis Brussels, BELGIUM Phone. +(32) Fax : +(32) SAC

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA A Hepatite A é causada por um vírus RNA não envelopado, de única fita, pertencente à família Picornaviridae. A principal via de transmissão é a fecal-oral, por contato inter-humano ou por meio de água e alimentos contaminados. A transmissão parenteral é rara, mas pode ocorrer se o doador estiver na fase de viremia do período de incubação. A disseminação da doença está relacionada com o saneamento básico e a aspectos ligados às condições de higiene. Portanto, a prevalência da doença é mais alta em países em desenvolvimento, onde muitas crianças estão expostas à infecção pelo HAV. Adultos são mais afetados em países desenvolvidos, devido às melhores condições de higiene na infância. As crianças são frequentemente assintomáticas ou apresentam quadro clínico leve, enquanto os adultos são mais sintomáticos. O quadro clínico da infecção inclui febre, náusea, dor abdominal, perda do apetite, urina escura e icterícia. Na maioria dos casos, a doença é autolimitada e benigna, sendo que a insuficiência hepática aguda grave ocorre em menos de 1% dos casos. Este percentual é maior em pacientes acima dos 65 anos. O período de incubação é de 2 a 6 semanas. Sorologicamente, anti-hav IgG e IgM são detectados no início dos sintomas, embora o vírus pode ser encontrado no sangue e nas fezes em 10 a 12 dias após a infecção. Anti-HAV IgM pode ser detectado em indivíduos infectados por 2 a 9 meses, após o que ele desaparece. A presença do anticorpo anti-hav IgM caracteriza infecção recente pelo vírus da hepatite A, enquanto que se somente anti-hav IgG está presente, indica infecção pregressa e imunidade ao vírus A por toda a vida. O Imuno-ELISA HAV-IgG da WAMA é um teste imunoenzimático, tipo competição, que utiliza antígenos do vírus da hepatite A altamente purificados, para detectar a presença de anticorpos IgG anti-vírus da hepatite A no soro ou plasma humano, com a finalidade de monitorar ou auxiliar no diagnóstico clínico da infecção pelo vírus da Hepatite A. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados do vírus da hepatite A (fase sólida). Quando anticorpos IgG anti-hav estão presentes na amostra de soro ou plasma, eles competem com anticorpos monoclonais IgG anti-hav marcados com peroxidase para ligarem-se aos antígenos purificados do vírus A fixados à fase sólida. Após um período de incubação, o material não ligado é removido por lavagem. Um substrato cromógeno (TMB e peróxido de hidrogênio uréia) é adicionado, o qual revelará uma cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente. Uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática é adicionada, a qual mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos IgG anti-hav é inversamente proporcional a intensidade da cor da reação, ou seja, a ausência ou baixa intensidade de cor desenvolvida sugere a presença de anticorpos anti-hav, de classe IgG. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos purificados do vírus A (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Tampão de lavagem X (1x50ml) 3. Conjugado anticorpos monoclonais IgG anti-hav marcada com peroxidase (1x6ml) 4. Substrato cromogênico Solução A (Peróxido de Hidrogênio Uréia) (1x7ml) 5. Substrato cromogênico Solução B (TMB) (1x7ml) 6. Solução stop (1x7ml) 7. Soro controle negativo (1x0,5ml) 8. Soro controle positivo (1x0,5ml) 9. Instruções para Uso materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión 14 y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No usar reactivos después de la fecha de validez. 13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos. 14. Descartar el material conforme a las reglamentaciones locales. 15. Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, manipulación y descarte de los materiales. HEPATITIS A - Interpretación de los Resultados Serológicos Interpretación Anti-HAV Total Anti-HAV IgM No Inmune (-) (-) Infección Reciente (+) (+) Infección Previa (+) (-) TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio de este conjunto diagnóstico, siempre y cuando esté dentro del plazo de validez y sea comprobado por su asesor técnico que no hubo fallas en la ejecución, manejo y conservación de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabilizan por fallas en el kit bajo estas condiciones.

3 17 02 Verdaderos Positivos RESULTADO 61 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,6 ESPECIFIDAD ANALÍTICA No se observó reacción cruzada con sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis B, vírus de la hepatitis C, citomegalovírus, HIV y Treponema pallidum. No se observó interferencia con factor reumatoide a la concentración de U/ml. Durante las pruebas, sin efecto "Hook" a concentraciones elevadas de anticuerpos fueron observados. Las características de rendimiento de la prueba no es afectada por las altas concentraciones de bilirrubina y hemoglobina. PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y replica bajo, en replicas. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 0,37 Desviación Estándar 7,09% 26% b. Precisión Interensayo La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y replica bajo, en replicas. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 0,42 Desviación Estándar 0,02 0,01 5,23% 13,49% LIMITACIONES DE USO La prueba Imuno-ELISA HAV-IgG de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Es de destacar también que los anticuerpos pueden ser indetectables en las etapas iniciales de la enfermedad y en algunos individuos inmunosuprimidos. Resultados repetidamente reactivos siempre se deben interpretar con información clínica del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de validez corresponde al último día del mes señalado en la etiqueta de los frascos y de la caja del kit 3. Se debe evitar exponer los reactivos a temperaturas elevadas, así como directamente al sol. 4. No congele cualquier reactivo, pues esto causará deterioro irreversible. 5. Lo Imuno-ELISA HAV IgG contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, anti-h y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como R E F E determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos purificados do vírus A (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Tampão de lavagem X (2x50ml) 3. Conjugado anticorpos monoclonais IgG anti-hav marcada com peroxidase (2x6ml) 4. Substrato cromogênico Solução A (Peróxido de Hidrogênio Uréia) (2x7ml) 5. Substrato cromogênico Solução B (TMB) (2x7ml) 6. Solução stop (2x7ml) 7. Soro controle negativo (2x0,5ml) 8. Soro controle positivo (2x0,5ml) 9. Instruções para Uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. TAMPÃO DE LAVAGEM x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph=7,4, contendo Tween- como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada (diluição 1:). Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µL. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO ANTICORPOS MONOCLONAIS IgG ANTI-HAV MARCADOS COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO URÉIA) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 2,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SORO CONTROLE NEGATIVO (7): soro humano diluído em tampão estabilizador de proteínas, negativo para HAV-IgG. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. SORO CONTROLE POSITIVO (8): soro humano diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para HAV-IgG. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 50µl e ponteiras.

4 03 16 Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Lavadora de microplaca. Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o soro controle negativo (7) e 2 cavidades para o soro controle positivo (8). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (5). 2. Dispensar 50 µl dos soros controles positivo e negativo (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1. Dispensar 50µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 3. Dispensar 50µL do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante. 7. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar ao conteúdo da microplaca, dispensar 350µL de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade, aguardar segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 50µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 C por 15 minutos, protegendo da luz. 11. Bloquear a reação dispensando 50µl da solução stop (7) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 5 minutos. NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank cuando se utiliza un unico filtro. Si la lectura se realiza con doble longitud de onda, no sustraer la D.O. del blanco de los D.Os. de muestras y controles. Determinar el valor del Cut-off: Cut-off = promedio de la D.O. de los Controles Negativos x 0,5 Atención: Si el valor de D.O. en uno de los controles negativos no atender la pista del control especificado para validar el ensayo, la D.O. de este control debe ser desechada. Si más de un control negativo no pasó, la prueba debe considerarse inválida y deberá repetirse. Ejemplo de cálculo do valor de lo Cut-off: Valor promedio de la D.O. de los Controles Negativos = 1,800 Entonces, CUT-off = 1,800 x 0,5 = 0,900 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: Stop, es inferior que 0,080 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de los controles negativos deben ser igual o mayor a 0,800 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". Lo valor de la D.O. de los controles positivos deben ser inferior a 0 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Dividir lo valor de D.O. de la muestra de paciente por lo valor de Cut-off. Lo test es considerado: REACTIVO : valor menor que 0,9. DUDOSO (Borderline) : valor está entre 0,9 e 1,1. NO REACTIVO :valor mayor que 1,1. ADVERTENCIA: ES SIEMPRE RECOMIENDADO REPETER LO TEST EN LAS MUESTRAS REACTIVAS. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 300 muestras de suero obtenidas de un Laboratorio de referencia, de los cuales 61 eran positivos y 239 negativos se determinó la sensibilidad y la especificidad del kit Imuno-ELISA HAV IgG da WAMA. Sensibilidad = Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos) x 100

5 Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante. 7. Lavar la placa 6 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2) en cada pocillo, esperar segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima peroxidasa. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 15 minutos, proteyendo de la luz. 11. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. La solución se tornará amarilla. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 5 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Pipetear 50 μl de los control negativo (7) (3 pocillos) y controles positivo (8) (2 cavidades). Use 1 cavidad para el blank Pipetear 50 μl de la muestra en otros pocillos. 2. Pipetear 50μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.. 3. Homogeneizar por 30 segundos y incubar a 37 C por 60 minutos. 4. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 5 vezes con solución de lavado (2). 5. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 6. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 7. Homogeneizar por 30 segundos y incubar, en la oscuridad, a a 37 C por 15 minutos. Protegido de la luz 8. Pipetear 50 μl de la solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. El color de la solución se volverá amarillo. 9. Homogeneizar por 30 segundos. 10. Leer la D.O. en un lector de microplacas con filtro de 450 nm, contra el blank, o en duplo comprimiento de onda (450/630nm), dentro de 5 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 50µl dos controles negativos (7) (3 cavidades) e controles positivos (8) (2 cavidades). Usar 1 cavidade para o Blank. Pipetar 50µl da amostra nas outras cavidades. 2. Pipetar 50µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto Blank. 3. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 4. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2). 5. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 6. Pipetar 50µl do Substrato Cromógeno Solução A (4) e 50µl do Substrato Cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank. A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. 7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 15 minutos. Protegendo da luz. 8. Pipetar 50µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no Blank. A cor da solução ficará amarela. 9. Homogeneizar por 30 segundos. 10. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 5 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle Neg. Controle Neg. Controle Pos. Controle Pos. A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank quando utilizar um único filtro. Se a leitura é realizada com duplo comprimento de onda, não subtrair a D.O. do blank das D.Os. das amostras e controles. Determinar o valor do Cut-off: Cut-off = média da D.O. dos Controles Negativos x 0,5 Atenção: Se o valor da D.O. de um dos controles negativos não atender a faixa controle especificada para validação do teste, a D.O. deste controle deveria ser descartada. Se mais do que um controle negativo não atender, o teste deve ser considerado inválido e deve ser repetido. Exemplo: Valor Médio da D.O. dos Controles Negativos = 1,800 Então, CUT-off = 1,800 x 0,5 = 0,900 VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, é menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. dos controles negativos é igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. dos controles positivos é menor do que 0 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank.

6 05 14 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado: REAGENTE : se valor menor do que 0,9. DUVIDOSO (Borderline) : se valor entre 0,9 e 1,1. NÃO REAGENTE : se valor maior do que 1,1. ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 300 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 61 eram positivas e 239 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ELISA HAV IgG da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos RESULTADO 61 Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Negativos Negativos ,6 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, citomegalovírus, HIV e Treponema pallidum. Nenhuma interferência foi verificada com fator reumatóide até a concentração de U/mL. Durante os testes realizados, nenhum efeito Hook para altas concentrações de anticorpos foi observado. A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina. PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 0,37 Desvio Padrão 7,09% 26% b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 0,42 Desvio Padrão 0,02 0,01 5,23% 13,49% LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA HAV-IgG da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios iniciais da doença e em alguns indivíduos imunossuprimidos. Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias estabilizado y listo para usar Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar SUSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN B (TMB) (5): solución estabilizada de tetrametilbenzidina Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar La TMB no es ni mutagénica ni carcinogénica. SOLUCIÓN STOP (6): listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 2,0 M. Manipular con cuidado. Es corrosivo. En caso de contacto con la piel lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. SUERO CONTROL NEGATIVO (7): control diluido en buffer estabilizador de proteínas, negativos para HAV-IgG. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,1% como conservante. SUERO CONTROLE POSITIVO (8): suero humano diluído en buffer estabilizador de proteínas, positivo para HAV-IgG. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,1% como conservante. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). MUESTRAS Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Durante un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO Micropipeta (50μl) y puntas de pipeta. Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de micro placa con filtro de 450 nm Lavador de microplaca. Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para el suero control negativo (7) y 2 pocillos para el suero control positivo (8). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50μl delsustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5). 2. Dispensar 50μl de los sueros controles positivo y negativo (sin diluir) conforme a lo establecido en el ítem 1. Dispensar 50μl de las muestras en los otros pocillos que serán testeados. Mediante la adición de la muestra, la color verde del conjugado se vuelve azul. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteado, evitando la contaminación. 3. Dispensar 50μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 60 minutos.

7 13 06 Lo Imuno-ELISA HAV-IgG de WAMA es un inmunoensayo, tal como "competición," que utiliza antígenos de los virus de la hepatitis A altamente purificados para detectar la presencia de anticuerpos IgG para virus de hepatitis A en suero o plasma humano, para ayudar en el diagnóstico clínico de la infección virus de hepatitis A. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con antígenos purificados del virus de la hepatitis A (fase sólida). Cuando anticuerpos anti-hav IgG están presentes en el suero o plasma, ellos compiten con el anticuerpo monoclonal IgG anti-hav marcado con peroxidasa para ligarse a antígenos purificados del virus A unido a la fase sólida. Después de un período de incubación, material no ligado se elimina mediante lavado. Un sustrato (TMB + peróxido de hidrogênio urea) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente. Una solución stop ácida de bloquear la reacción enzimática se añade, que cambiará el color de la solución a amarillo. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración de IgG anti-hav es inversamente proporcional a la intensidad del color de la reacción, es decir, la ausencia o la baja intensidad de color desarrollado sugiere la presencia de anticuerpos anti-hav, de clase IgG PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplaca con pocillos recubiertos con antígenos purificados de lo virus A(12 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Tapón de lavaje - X (1x50ml) 3. Anticuerpos monoclonales conjugados anti-hav IgG marcada con peroxidasa (1x6ml) 4. Sustrato cromogénico - Solución A (peróxido de hidrógeno urea) (1x7ml) 5. Sustrato cromogénico - Solución B (TMB) (1x7ml) 6. Solución stop (1x7ml) 7. Suero control negativo (1x0,5 ml) 8. Suero Control Positivo (1x0,5 ml) 9. Instrucciones para Uso R E F E determinaciones 1. Microplaca con pocillos recubiertos con antígenos purificados de lo virus A(24 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Tampón de lavaje X (2x50ml) Sustrato cromogénico - Solución A (peróxido de hidrógeno urea) (2x7ml) 5. Sustrato cromogénico - Solución B (TMB) (2x7ml) 6. Solución stop (2x7ml) 7. Suero control negativo (2x0,5 ml) 8. Suero Control Positivo (2x0,5 ml) Instrucciones para Uso razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA HAV IgG contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-h e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirirem a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar as cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. HEPATITE A Interpretação dos Resultados Sorológicos Interpretação Anti-HAV Total Anti-HAV IgM Não Imune (-) (-) Infecção Recente (+) (+) Infecção Pregressa (+) (-) TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS MICRO PLACA (1): Retirar del envelope la cantidad de tiras que se utilizarán y dejar que alcancen la temperatura ambiente (-25 ºC). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con disecante, y deben mantenerse entre 2-8 ºC. SOLUCIÓN DE LAVADO X concentrado (2): tampón fosfato salino (PBS), ph=7,4, conteniendo Tween como detergente. Diluir el volumen del concentrado completando para 1000 ml con agua destilada o deionizada (diluición 1:). Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente, 350μl de tampón diluido. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25ºC) antes de usar. Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO UREIA) (4):

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The Hepatitis A is caused by an non-enveloped RNA virus, single strand, that belongs to the Picornaviridae family. The main route of transmission is fecal-oral contact, through inter-human or through contaminated water and food. The parenteral transmission is rare, but can occur if the donor is in viremea phase of the incubation period. The dissemination of the disease is related to the sewage disposal and to conditions of hygiene. Therefore, the predominance of the ilness is higher in developing countries, where many children are exposed to the infection by the HAV. Adults are more affected in developed countries, due to better hygiene conditions in their childhood. Children are often asymptomatic or have mild clinical condition, while adults are more symptomatic. The clinical picture of the infection include fever, nausea, abdominal pain, loss of appetite, dark urine and jaundice. In most cases, the disease is self-limiting and benign, where the serious acute liver failure occurs in less than 1% of the cases. This percentage is higher in patients older than 65 years. The incubation period is 2 to 6 weeks. Serologically, anti-hav IgG and IgM are detected at the onset of symptoms, although the virus can be found in the blood and feces 10 to 12 days after infection. Anti-HAV IgM can be detected in individuals infected for 2 to 9 months, after which it disappears. The presence of anti-hav IgM antibody characterizes recent infection by the hepatitis A virus, while if only anti-hav IgG is present, indicates previous infection and immunity to the A virus for the whole life. The Imuno-ELISA HAV-IgG from WAMA is an immunoenzymatic test, competition type, that uses highly purified Hepatities A virus antigen, to detect the presence of anti-hepatitis A virus IgG antibodies in serum or plasma of humans, with the goal of aiding in the clinical diagnosis of infection by hepatitis A virus. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with the purified antigens of the Hepatities A virus (solid phase). When anti-hav IgG antibodies are present in the serum or plasma sample, they compete with monoclonal anti-hav IgG antibodies labeled with peroxidase to bind to the purified antigen of the virus A bound to the solid phase. After an incubation period, the unbound material is removed through washing. A substrate (TMB and urea hydrogen peroxide) is added, which will develop a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present. An acidic stop solution to block the enzymatic reaction is added, which will change the color of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450 nm. The concentration of anti-hav IgG antibodies is inversely proportional to the intensity of the reaction color, which is, the abscence of low intensity of the developed color suggests presence of anti-hav antibodies, IgG class. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified antigens of the A virus (12 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Buffer X (1x50ml) 3. Monoclonal anti-hav IgG antibody conjugate labeled with peroxidase (1x6ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Urea Hydrogen Peroxide) (1x7ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (1x7ml): 6. Stop Solution (1x7ml) 7. Negative serum control (1x0,5ml) 8. Positive serum control (1x0,5ml) 9. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplate with wells coated with purified antigens of the A virus (24 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Buffer X (2x50ml) negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-h and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. HEPATITIS A - Interpretation of Serological Results Interpretation Anti-HAV Total Anti-HAV IgM Not immune (-) (-) Recent Infection (+) (+) Previous Infection (+) (-) WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA La hepatitis A es causada por un virus ARN sin envoltura, cinta única, perteneciente a la familia Picornaviridae. La principal vía de transmisión es fecal-oral, por contacto interhumano o através del agua y alimentos contaminados. La transmisión parenteral es raro, pero podría ocurrir si el donante es de viremia durante el periodo de incubación. La propagación de la enfermedad está relacionada con el saneamiento y aspectos relacionados con la higiene. Por lo tanto, la prevalencia de la enfermedad es mayor en países en desarrollo, donde muchos niños están expuestos a la infección por VHA. Los adultos son los más afectados en los países desarrollados debido a mejores condiciones de higiene en la infancia. Los niños suelen asintomáticos o tienen cuadro clínico leve, mientras que los adultos son más sintomáticos. Las manifestaciones clínicas de la infección incluyen fiebre, náuseas, dolor abdominal, pérdida del apetito, orina oscura e ictericia. En la mayoría de los casos, la enfermedad es benigna y autolimitante, con insuficiencia hepática aguda grave ocurre en menos del 1% de los casos. Este porcentaje es mayor en pacientes mayores de 65 años. El período de incubación es de 2 a 6 semanas. Serológicamente, anti-hav IgG e IgM se detectaron en el inicio de los síntomas, aunque el virus puede encontrarse en la sangre y las heces en 10 a 12 días después de la infección. Anti-HAV IgM puede ser detectado en individuos infectados 2-9 meses, después de lo cual desaparece. La presencia de anticuerpos anti-vha IgM caracteriza infección reciente con hepatitis A, mientras que se solamente anti-vha IgG se presenta, indica una infección pasada e inmunidad al virus de por vida.

9 11 08 SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 300 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory, of which 61 were positive and 239 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA HAV IgG from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 61 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,6 ANALYTICAL SPECIFICITY There was no cross-reaction in sera of infected patients by the hepatitis B virus, hepatitis C virus, Cytomegalovirus, HIV, and Treponema pallidum. No interference was verified with rheumatoid factor until the 2,000 U/mL concentration. During the tests, no effect "Hook" for high concentrations of antibodies was observed. The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin. PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in replicates. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 0,37 Deviation Standard 7,09% 26% b. Inter-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in replicates. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 0,42 Deviation Standard 0,02 0,01 5,23% 13,49% LIMITATIONS OF USE The test Imuno-ELISA HAV-IgG from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and in some immunosuppressed individuals. Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA HAV IgG contains materials of human origin, which have been tested, with 3. Monoclonal anti-hav IgG antibody conjugate labeled with peroxidase (2x6ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Urea Hydrogen Peroxide) (2x7ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (2x7ml): 6. Stop Solution (2x7ml) 7. Negative serum control (2x0,5ml) 8. Positive serum control (2x0,5ml) 9. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature ( 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (x Concentrated) (2): Phasphate Buffered solution (PBS), ph=7,4, containing Tweene- as deterggent Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with distilled or deionized water (dilution 1:). If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each cavity should be supplemented with approximately 350µl. Let it reach room temperature (-25 C) before using. MONOCLONAL ANTI-HAV IGG ANTIBODY CONJUGATE LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION A (UREA HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready for use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains 2.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. NEGATIVE SERUM CONTROL (7): human serum diluted in proteins stabilizer buffer, negative for HAV-IgG. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. POSITIVE SERUM CONTROL (8): diluted human serum in stabilized protein buffer, positive for HAV-IgG. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipettes (50µl) and tips Deionized water for dilution of the wash buffer Microplate shaker. Incubator at 37 C. Microplate reader with 450nm filter. Microplate washer. Absorbent paper. Container for material disposal

10 09 10 PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum negative control (7) and 2 wells for the serum positive control (8). Use one cavity well for the blank, which will only have 50µl of the chromogen substrate solution A (4), and 50µl of chromogen substrate solution B (5). 2. Pipette 100µl of the positive and negative serum control (without diluting them) as instructed in step 1. Pipete 50µl of the samples to be tested into the other microplate wells. When adding sample, the green color of the conjugate will turn blue. Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 3. Pipete 50µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 60 minutes. 6. Discard the contents of the microplate in container with disinfecting solution. 7. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 9. Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 10. Cover the plate with adhesive sheet and incubate at 37 C for 15 minutes, protecting if from the light. 11. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (7) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 12. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 5 minutes. NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 50 µl of negative controls (7) (3 wells) and positive controls (8) (2 wells).wells). Use 1 well for the Blank. Pipette 50µl of the sample in other cavities. 2. Pipette 50µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 3. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 60 minutes. 4. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 5 times with wash solution (2). 5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 6. Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 7. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 15 minutes. Protected from light. 8. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank The color of the solution will turn yellow. 9. Mix for 30 seconds. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 5 minutes. A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD when using a single filter. If the reading is carried out with double wavelength, do not subtract the OD of the blank from the OD of the samples and controls. Determine the Cut-off value: Cut-off = average OD of Negative Control x 0.5 Warning: If the value of OD of one of the negative controls does not fall within the control range specified in the test validation, the OD of this this control should be discarded. If more than one negative control does not meet the specification, the test should be considered invalid and must be repeated. Example: : Vverage OD of Negative Control = Therefore, CUT-off = x 0.5 = TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and Stop Solution is less than at 450 nm. The O.D. value of the negative controls is greater than or equal to at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. The O.D. value of the positive controls is less than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. INTERPRETATION OF THE RESULTS Divide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered: REACTIVE : if value is less than 0.9. INDETERMINATE (Borderline) : if value is between 0.9 and 1.1. NOT REACTIVE : if value is greater than 1.1. WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES.

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