TAXONOMÍA MOLECULAR TAXONOMÍA MOLECULAR

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Gonzalo Rodríguez Ruiz
hace 7 años
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1 TAXONOMÍA MOLECULAR TAXONOMÍA MOLECULAR Microbiología a General Área Micología Dra. Alicia Luque CEREMIC

2 Taxonomía clásica Carecen de reproducibilidad: los caracteres fenotípicos pueden variar con las condiciones ambientales. PLEOMORFISMO Debido al bajo poder discriminatorio y a la frecuente incongruencia de los datos morfológicos y fisiológicos el sistema diagnóstico se hace bastante complicado.

3 Taxonomía molecular Se han desarrollado un gran número de técnicas moleculares para la identificación de hongos filamentosos y levaduras debido a: Rapidez y grado de simplicidad de las habilidades requeridas. Sensibilidad. Reproductibilidad.

4 Taxonomía molecular Los sistema de clasificación de levaduras y hongos filamentosos, en la actualidad se basan en establecer las diferencias existentes entre algunas de las moléculas de estos organismos: composición de la pared celular (HPLC, cromatografía de intercambio iónico) clasificación de quinonas de la cadena de transporte electrónico (cromatografía, HPLC, espectroscopia) comparación de patrones electroforéticos de enzimas varios métodos basados en la comparación del DNA.

5 Taxonomía molecular Caracterización de ácidos nucleicos. El estudio del DNA de los hongos se complica por el hecho de que estas poseen un genoma complejo, consistente en DNA nuclear (ndna), DNA mitocondrial (mtdna) y en algunos casos DNA plasmídico. Hibridación DNA/DNA porcentaje G+C Métodos actuales son: restricción del ADN mitocondrial polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR (RAPD-PCR) electroforesis de campo pulsante amplificación y restricción del DNA ribosomal secuenciación de genes nucleares y mitocondriales

RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Características del ADN mitocondrial Estructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtdna está compensada por la gran complejidad estructural de algunas

6 RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Características del ADN mitocondrial Estructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtdna está compensada por la gran complejidad estructural de algunas regiones intergénicas y también por la presencia de intrones (contribuyen en gran manera a incrementar las diferencias inter- e intraespecíficas existentes en los genomas mitocondriales ) Restricción del ADN mitocondrial Digestión del mtdna con endonucleasas de restricción, que nos permitan generar polimorfismos en el tamaño de los fragmentos (RFLP).

7 RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Análisis de los resultados

8 RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Ventajas y desventajas de la técnica. Ventajas: 1.- Repetitiva en cualquier circunstancia. El patrón de restricción no cambia a menos que cambie la secuencia del mtdna que reconoce el enzima de restricción. 2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del género que estemos estudiando. Es una ventaja cuando tenemos gran variabilidad entre cepas de la misma especie y queremos discriminar entre ellas (patrón de cepa). A veces no se puede distinguir entre cepas de la misma especie, entonces nos sirve para identificar nuevos aislados de esa especie (patrón de especie). Desventajas: 1.- Se necesita DNA de gran calidad, libre de restos celulares, proteínas y RNA. Requiere un proceso de extracción de DNA, el cual puede no ser necesario utilizando otras técnicas de tipificación molecular. 2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del género que estemos estudiando.

9 POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR) Utilizando un único cebador de secuencia arbitraria y corta (normalmente de pb) y una baja temperatura de hibridación, que produce polimorfismo entre los patrones del DNA amplificado.

10 POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR) Ventajas 1.- La mayor ventaja es que no necesitamos ninguna información previa del organismo de que se trata, ya que sirve para cualquier organismo. Tampoco necesitamos conocer la secuencia del DNA que vamos a amplificar. 2.- Es una técnica muy sencilla y rápida. 3.- Requiere cantidades muy pequeñas de DNA, y tampoco es necesario que la calidad del DNA sea muy buena, aunque esto último afecta a la reproducibilidad. 4.- Es un marcador molecular muy bueno, ya que el cambio en un solo nucleotido puede significar la unión o no del cebador, y por tanto la presencia o no de una banda en el producto de amplificación. Inconvenientes 1.- Presenta un gran inconveniente: su reproducibilidad no siempre es la adecuada, siendo los patrones, en muchos casos, dependientes no sólo de las condiciones de amplificación sino de las condiciones del laboratorio donde se realicen. Actualmente es muy empleada, aunque se suele utilizar junto con otras técnicas de tipado más reproducibles para comparar los resultados.

11 AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL Están presentes en todos los organismos celulares y por tanto comparten un origen evolutivo común. Las comparaciones del rdna, han demostrado su utilidad para valorar la relación tanto entre organismos alejados como entre organismos próximos. IGS NT S 5S NT S ET S 18S ITS 1 5.8S ITS 2 26S ETS IGS Esquema de los diferentes componentes que constituyen cada unidad de DNA ribosomal. IGS: intergenic spacer; NTS: non-transcribed spacer; 5S: gen del RNA ribosomal 5S; ETS: external transcribed spacer; 18S: gen del RNA ribosomal 18S; ITS1: internal transcribed spacer 1; 5.8S: gen del RNA ribosomal 5.8S; ITS2: internal transcribed spacer 2; 26S: gen del RNA ribosomal 26S. Amplificación de diferentes zonas del complejo ribosomal por PCR Restricción del producto de amplificación

12 AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL Ventajas: 1.- Técnica universal: utilidad para comparar cualquier levadura u hongo filamentoso, el nivel de resolución dependerá del grupo estudiado y de los enzimas utilizados. 2.- PCR - RFLPs rápidos, fáciles y reproducibles. Se pueden crear bases de datos de utilización general. Inconvenientes: 1.- La comparación del tamaño de los RFLPs de la región ITS-5.8S RNA con los patrones de las cepas de referencia, puede ser complicada debido a las escasas diferencias que pueden existir entre los patrones obtenidos para especies próximas (diferencias en pocos pares de bases no son apreciables en una electroforesis). A veces se necesita utilizar alguna otra técnica para confirmar la identificación.

13 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE Caracterización del DNA cromosómico: separación de los cromosomas intactos mediante electroforesis en campo pulsante en gel de agarosa La electroforesis en campo pulsante se ideó para separar fragmentos de DNA de elevado tamaño molecular. La alternancia en la dirección del campo eléctrico producida entre pares de electrodos, hace posible que los cromosomas de levaduras y hongos filamentosos se vayan orientando según cambia la dirección del campo eléctrico, y se muevan, en función de su tamaño, a diferentes velocidades a través de los poros del gel de agarosa.

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE El análisis de los cariotipos electroforéticos nos permite estimar número y tamaño de los cromosomas al compararlos con los marcadores de peso

14 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE El análisis de los cariotipos electroforéticos nos permite estimar número y tamaño de los cromosomas al compararlos con los marcadores de peso molecular. Los polimorfismos en el número y tamaño de los cromosomas son comunes en hongos filamentosos y levaduras, no solo entre distintas especies, sino entre cepas de la misma especie

15 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE Ventajas:.- Podemos detectar traslocaciones y variaciones en el número de cromosomas..- Fotografía del número y tamaño real de los cromosomas. No se genera polimorfismo, sino que se observa el existente..- Elevada variabilidad, por lo que es un buen marcador molecular para establecer diferencias entre levaduras u hongos filamentosos a muy diferentes niveles. Inconvenientes:.- Sistemas electroforéticos y material de trabajo muy caro..- Protocolo largo y delicado..- Probar varias condiciones para resolver completamente los cromosomas con diferentes tamaños. Condiciones de electroforesis largas y complicadas..- Solo se pueden resolver cromosomas relativamente pequeños (20 Mb).

16 MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE LA PCR Dermatofitos PCR y PCR-RFLP usando como blanco el gen de la Quitina Sintasa I (CHSI)

PCR-fingerprinting Fusarium 21226 5000 4900 2000 1900 1500 947 831 564 PCR-fingerprinting con (GACA) 4.

17 PCR-fingerprinting Fusarium PCR-fingerprinting con (GACA) 4. Calles: M, marcador de PM; 1-5 F. oxysporum; 6 F. proliferatum, 7 F. oxysporum; 8 F. oxysporum; 9 F. proliferatum; F. verticillioides.

PCR-fingerprinting Fusarium 21226 5000 4900 2000 1500 1300 947 831 PCR-fingerprinting de 9 especies de Fusarium

18 PCR-fingerprinting Fusarium PCR-fingerprinting de 9 especies de Fusarium Calles: M, marcadori; 1-4 F. oxysporum; 5 F culmorum; 6 F. tricinctum; 7 F. anthophilum; 8 F. graminearum; 9 F. graminearum.

19 Taxonomía molecular El empleo de técnicas moleculares en complemento con métodos fenotípicos, es necesario para los aislamientos atípicos o dificultosos Se puede obtener otra información : relaciones filogenéticas, estudios epidemiológicos, emplearse como métodos de referencia para la identificación a nivel de especie, etc.

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