Inmunohistoquímica antígenos anticuerpos

Transcripción

1 Inmunohistoquímica Inmunohistoquímica es toda técnica que permite detectar in situ componentes celulares y extracelulares (antígenos) mediante anticuerpos específicos.

2 Metas Demostrar la presencia real y específica de un antígeno. Que se vea muy lindo! - Preservar la morfología del tejido. - Nada de fondo (background). Mitocondrias y actina

3 Antígeno Es la molécula que queremos detectar en el corte histológico. La sustancia que queremos detectar debe ser capaz de generar una respuesta inmune cuando es inyectada en un animal de experimentación. Epitopes continuos o discontinuos.

4 Anticuerpos

5 Anticuerpos IgM e IgG son las que se encuentran en el suero. IgM penetra peor en la muestra.

6 Anticuerpos Unión reversible con una afinidad y avidez determinada.

7 Cómo se generan los anticuerpos? Anticuerpos policlonales. anticuerpos monoclonales. Anticuerpos o sueros policlonales Mezcla de Igs con diferentes especificidades, sintetizadas por distintos clones de células plasmáticas.

8 Ventajas: Alta avidez y sensibilidad. Al detectar varios epitopes suelen ser más seguros. Menor costo. Desventajas: Mayor incidencia de reacciones cruzadas (inespecificidad) Background. Puede eliminarse con cromatografía de afinidad. El lote de cada anticuerpo es irreproducible. Puede contener impurezas (Ig contra impurezas del antígeno).

9 Anticuerpos monoclonales Técnica del hibridoma Cada clon aislado puede cultivarse: In vivo: trasplantando el cultivo a la cavidad peritoneal de un ratón y obteniéndose el anticuerpo a partir del líquido ascítico. In vitro: cultivando los clones como líneas celulares y obteniéndose el sobrenadante. César Milstein. Premio Nobel de Medicina y Fisiología 1984.

10 Ventajas: Especificidad. Disponibilidad. Reproducibilidad. Desventajas: Menor sensibilidad. Reconoce sólo 1 epitope de todo el antígeno. Posibilidad de falsos negativos. Menor estabilidad al ph y concentración salina. Más caro.

11 Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica La fijación y el pretratamiento de la muestra deben cumplir criterios mutuamente contradictorios: Retener antígenos. Preservar la antigenicidad. Preservar la estructura. Permitir la interacción de los anticuerpos con los antígenos tisulares. Los antígenos son químicamente diferentes No existe un tratamiento universal para la inmunohistoquímica

12 Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica Muestras fijadas químicamente (fijadores) Parafina (implica pasaje por calor y solventes) Crióstato Muestras fijadas físicamente (agentes criogénicos y congelación) Crióstato Vibrátomo Resinas no hidrofóbicas. Aptas para IHQ

13 Inmunohistoquímica in toto (whole mount)

14 Procesamiento de las muestras para inmunohistoquímica Fijadores reticulantes o aditivos: Formaldehído, Paraformaldehído. Forman puentes metileno (CH=CH) entre los aminoácidos y se adicionan a los tejidos. Penetran rápidamente y preservan la morfología. Estabilizan las proteínas. Glutaraldehído. Gran capacidad de «cross-linking» y preservación. Preserva la ultraestructura celular. Excelente para MET pero NO aconsejable para inmunohistoquímica. Tiempo, concentración y mezclas fijadoras.

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16 Recuperación antigénica Parámetros experimentales a poner a punto para un buen desenmascaramiento: Buffer de incubación y ph Método de calentamiento Tiempo y temperatura Aumenta la especificidad y disminuye la tinción inespecífica. Cómo se restaura la inmunorreactividad? Se desconoce Rotura de enlaces producidos por formol Recuperación de cargas electrostáticas Extracción de proteínas bloqueantes difusibles Movilización de restos de parafina por el calor

17 Métodos de detección de antígenos Cómo se detecta el complejo antígeno-anticuerpo en el preparado histológico? Según la manera de visualizarlo: Por reacción enzimática. Por fluorocromo.

18 La detección del antígeno puede ser: Directa. Es costoso y complejo. Baja sensibilidad. Indirecta: con un anticuerpo secundario conjugado.

19 Métodos de detección indirectos PAP (peroxidasa anti-peroxidasa) Cromógeno: tetraclorhidrato de 3,3 diaminobenzidina (DAB) Precipitado marrón insoluble en alcohol.

20 Métodos de detección indirectos Ventajas de la peroxidasa: Enzima estable. Tamaño pequeño que no interfiere con la unión de los anticuerpos. Desventajas de la peroxidasa: Peroxidasas endógenas. Principalmente en órganos hemopoyéticos, hígado, músculo y riñón. La presencia de peroxidasas endógenas se detecta incubando los cortes con H 2 O 2 y DAB. (Control negativo). Se pueden bloquear con H 2 O 2 al 3% en agua destilada. Antes o después del anticuerpo primario??

21 Métodos de detección indirectos Método ABC: complejo avidina-biotina. Conjugado a una enzima. Ventajas: Aumenta la sensibilidad porque amplifica la marca. La unión biotina-estreptavidina es muy fuerte. La biotina se conjuga fácilmente a enzimas, anticuerpos y fluorocromos también.

22 Métodos de detección indirectos Método ABC: complejo avidina-biotina. Conjugado a una enzima. Desventajas: Biotinas endógenas. En estructuras ricas en mitocondrias: hepatocitos, túbulos renales, conductos salivales, células de Sertoli, etc. Se pueden bloquear las biotinas endógenas con avidina/biotina. Kits comerciales. Caros!

23 Métodos de detección indirectos Otras enzimas utilizadas son: Fosfatasa alcalina. MÉTODO DE LA FOSFATASA ALCALINA ANTI FOSFATASA (APAAP). sustrato cromógeno Glucosa oxidasa y beta-d-galactosidasa.

24 Métodos de detección indirectos EL USO DE POLÍMEROS

25 Métodos de detección indirectos Doble inmunotinción simultanea

26 Fondo (background) Cómo disminuir la inmunotinción inespecífica? Los anticuerpos se unen a sitios inespecíficos a través de cargas elestrostáticas e interacciones hidrofóbicas. Para disminuir estas interacciones es fundamental: Una buena dilución del anticuerpo. Controlar el tiempo de la reacción del marcador. Bloquear con suero, leche o albúmina. Buenos lavados. Bloquear las enzimas o biotinas endógenas. Que nunca se sequen los cortes.

27 Controles Positivos: Negativos: Interno: estudiar la inmunotinción de un antígeno conocido en cortes seriados para evaluar si el órgano fue fijado y procesado correctamente. Externo: estudiar la presencia del antígeno de interés en cortes que presentan el antígeno y con buena preservación. Inmunotinción en tejidos que carecen del antígeno. Demostrar ausencia de inmunotinción al omitir alguna de las etapas esenciales de la técnica.

28 Controles Negativos: Omisión del anticuerpo 1rio. Preadsorción del anticuerpo 1rio con el antígeno. Enzimas endógenas: omitir todos los pasos excepto el que pone en evidencia la enzima. Biotina endógena: estreptavidina + enzima + cromógeno. Cuidado con la especie en la cual está hecho el anticuerpo 1rio. No puedo usar cortes de conejo y usar un anticuerpo secundario anti-conejo!!!

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31 Anti-tirosina hidroxilasa Glándula adrenal de ratón. Glándula interrenal de sapo.

32 Control biotina endógena - Desenmascaramiento. - Bloqueo de peroxidasas con H 2 O 2. - Bloqueo de sitios inespecíficos con leche. - sin ac 1rio. - sin ac 2rio. - Streptavidina-HRP. - Revelado con DAB.

33 Control peroxidasas endógenas - Desenmascaramiento. - Bloqueo de peroxidasas con H 2 O 2. - Bloqueo de sitios inespecíficos con leche. - sin ac 1rio. - sin ac 2rio. - sin Streptavidina-HRP. - Revelado con DAB.