Bqca.. Esp. Marcela Alejandra Guastavino Dra. María a Mercedes Tiscornia

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Consuelo Barbero Cortés
hace 7 años
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1 Bqca.. Esp. Marcela Alejandra Guastavino Dra. María a Mercedes Tiscornia Cátedra de Biología Molecular y Genética

3 OBJETIVOS Comprender el fundamento teórico de las técnicas t básicas de aislamiento y separación n de macromoléculas, culas, sus variantes, aplicaciones y finalidad. Conocer las diferencias entre las distintas técnicas t de hibridación n y de inmunodetección n para la identificación n de macromoléculas. culas.

5 MACROMOLÉCULAS CULAS ÁCIDOS NUCLEICOS (ADN y ARN) PROTEÍNAS

7 PROTEÍNAS Electroforesis en gel de poliacrilamida ADN Electroforesis en gel de poliacrilamida Electroforesis en gel de agarosa ARN Electroforesis en gel de agarosa

8 TÉCNICAS DE INMUNODETECCIÓN TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Western Blot Inmunocitoquímica Inmunohistoquímica Southern Blot Northen Blot Microchips Fish

9 Inmunodetección

11 Sistema continuo la concentración del gel, el ph y la fuerza iónica quedan fijos. Sistema discontinuo Se utilizan dos geles, la concentración de los geles y los tampones que se usan para la preparación son diferentes. El primer gel (espaciador o stacking) asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocándose la acumulación de las mismas en el pocillo. Este gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un ph más ácido La separación se realiza en el segundo gel o gel de resolución.

12 Se extrae las proteínas totales de la muestra en estudio, teniendo en cuenta que localización celular tiene: Intracelular Cuantificación de proteínas totales: Método Bradford. Ventajas: Barato y solo se utiliza un reactivo el colorante Comassie Blue G-250. Sensible (1-100 µg). Rápido, la reacción finaliza a los 5 min. y es estable hasta una 1 hr. Sencillo. En el citosol En la membrana La Absorbancia se lee a 595 nm. Extracelular

13 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Electroforesis discontinua

14 Paso 3: Electrotransferencia-Ensamblado Ensamblado del sandwich para Western blot Mini Trans-Blot Transfer Cell

15 Se realiza una transferencia a un soporte de sólido (nitrocelulosa, nylon o PVDF). La transferencia se realiza por la aplicación de un campo eléctrico. Se realiza a un alto voltaje por 1 o 2 horas o bajo voltaje toda la noche. Se realizan controles de transferencia por ejemplo tinción del gel luego de transferir o la utilización de Pesos moleculares coloreados en la electroforesis.

16 Paso 3: Transferencia de las proteínas a membrana. 30 minutes 100V 10 hs 35-45V Electric Current

Control de transferencia: Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida La localización de una proteína en un gel puede realizarse tiñendo el gel con Coomassie Blue o con sales de plata.

17 Control de transferencia: Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida La localización de una proteína en un gel puede realizarse tiñendo el gel con Coomassie Blue o con sales de plata. La primera técnica de tinción es más fácil y rápida pero los métodos de tinción con plata son considerablemente más sensibles y por ello pueden utilizarse para detectar cantidades más pequeñas de proteínas. Sensibilidad: 0,1-0,5 µg Sensibilidad: 1-10 ng

18 Paso 4: Bloqueo de sitios no específicos en la membrana Remover la membrana desde el sandwich de blotting e incubarlo en solución de bloqueo. 5% non-fat milk: Previene el binding al azar del anticuerpo primario a la membrana Phosphate buffered saline (PBS): Provee el correcto ph y sales % Tween 20: detergente no iónico que previene el binding no específico de los anticuerpos a la membrana

19 Paso 5: Incubación n de la membrana con el Ac. primario Descartar la solución de bloqueo Incubar con el anticuerpo primario la membrana con agitación suave: 1-3 hs a 25 C o 12 hs a 4 C El anticuerpo primario se une (bind) a la proteína myosin light-chain Lavar rápidamente con 50 ml de buffer de lavado y descartar Adicionar 50 ml de buffer de bloqueo y lavar con agitación suave

20 Los anticuerpos son proteínas producidas en los vertebrados en respuesta a la exposición con estructuras extrañas denominadas antígenos.

21 MÉTODOS INMUNOCITOQUÍMICOS MICOS E INMUNOHISTOQUÍMICOS MICOS TÉCNICA DIRECTA El anticuerpo primario está conjugado con moléculas fluorescentes o enzimas TÉCNICA INDIRECTA El anticuerpo primario no estámarcado. Un segundo Ac dirigido contra el anticuerpo primario está marcado

22 Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo 1 Antígenos Anticuerpo 2 Anticuerpo 1 Antígenos Ventajas Se necesitan pocos pasos Menos problemas de background Posibilidad de doble marcación El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones Son comerciales Se evita la disminución n de afinidad del Ac 1 1 Desventajas Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1º) 1 Señal poco amplificada Es necesario purificar el Ac El Ac puede perder afinidad Se necesitan muchos pasos de tinción Con Ag múltiples m se necesita que los Ac 1º 1 sean de distintas especies

23 Paso 6: Detección n utilizando Ac. secundario marcado/ac. primario marcado Anticuerpo primario marcado Anticuerpo secundario marcado

25 env gag pol gp160 gp120 gp 41 p55 p18 p24 p65 p51 p31 -Se corren proteínas de HIV -Se transfieren a nitrocelulosa -Se incuba la membrana con suero del paciente -Se revela con anticuerpos secundarios Commercial Methods in Clinical Microbiology ASM Press.

Western blot for p27/kip1 on AtT-20 cell lysates treated with DMSO (CT), 1 nmol/l octreotide plus DMSO (Oct), 1 nmol/l rapamycin, and 1 nmol/l octreotide plus 1 nmol/l rapamycin for 24 h (A); SHP-1dn

27 Western blot for p27/kip1 on AtT-20 cell lysates treated with DMSO (CT), 1 nmol/l octreotide plus DMSO (Oct), 1 nmol/l rapamycin, and 1 nmol/l octreotide plus 1 nmol/l rapamycin for 24 h (A); SHP-1dn transfected (B) and Myr-Akt transfected (C) AtT-20 cell lysates treated with DMSO (CT), 1 nmol/l octreotide plus DMSO (Oct), and 1 nmol/l rapamycin; and AtT-20 cell lysates treated as in B and C in the presence of the GSKβ inhibitor SB (14 µmol/l; D). Cerovac et al., 2010.

28 IDENTIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS Western Blot Proteínas Inmunocitoquímica Proteínas Southern Blot ADN Northern Blot ARN Hibridación in situ ADN/ARN

29 MÉTODOS INMUNOCITOQUÍMICOS MICOS E INMUNOHISTOQUÍMICOS MICOS Permiten la localización n y/o identificación de moléculas en las células c o tejidos utilizando anticuerpos marcados

30 MÉTODOS INMUNOCITOQUÍMICOS MICOS E INMUNOHISTOQUÍMICOS MICOS Dependiendo de la finalidad del estudio la observación n podrá realizarce por: MICROSPCOPÍA A OPTICA MICROSPCOPÍA A ELECTRÓNICA Del método m seleccionado dependerá el procesamiento de la muestra

Hibridación SOUTHERN Descripta por E. M. Southern en 1975.

31 Hibridación SOUTHERN Descripta por E. M. Southern en Aplicaciones de la hibridación n Southern RFLP s, VNTR s s y DNA fingerprinting

32 OBJETIVOS DE LA HIBRIDACIÓN SOUTHERN Immovilizar el ADN sobre un substrato Identificar la secuencia de ADN (gen) de interés

33 NORTHERN BLOT Técnica que permite la detección n de ARN específicos separados por electroforesis a través de sondas marcadas

34 Comparación n entre las técnicas t de Southern, Northern y Western blot Southern Northern Western Molécula detectada ADN ARN Proteína Electroforesis Gel de agarosa Gel de agarosa/formal dehído Pretratamiento del gel Método de transferencia Revelado Detección Depurinación, desnaturalización y neutralización Gel de poliacrilamida - - Capilaridad Capilaridad Electrotransferenci a Sonda marcada Hibridación Autorradiografía Quimioluminiscencia Colorimetría Sonda marcada Hibridación Autorradiografía Quimioluminiscencia Colorimetría Anticuerpo primario. Inmunodetección Quimioluminiscencia Colorimetría

35 CHIP DE ADN (MICROARRAYS) Permite el análisis de la expresión n de muchos genes en forma simultanea, observandose en algunos casos de forma instantanea la expresión n de todos los genes de un genoma Hibridación CHIP DE ADN

37 Detección n de moléculas de ADNo ARN en la célula c (in( situ) Inmunohistoquímica mica Hibridación n tipo Northern o Southern

38 La hibridización in situ fluorescente permite la localización n de un gen particular a nivel de cromosomas

40 Interpretación de RT-PCR

41 Real Time-PCR

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