Cultivo In Vitro. Plantas. Medicinales

Transcripción

1 Cultivo In Vitro de Plantas Medicinales Resumen El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir dentro de vidrio. Es decir, el cultivo de plantas o de algunas de sus partes dentro de recipientes de vidrio en condiciones estériles de ambiente controlado, (pero también de células y tejidos animales). El cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico cómo químico, en el que se sitúa el explanto. Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biótopo de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo, por lo que se hace necesario investigar cuáles son los principales factores que deberán ser controlados para el óptimo desarrollo del explanto. Se realizará la micropropagación vía cultivo in vitro de porciones nodales de plantas medicinales utilizadas frecuentemente en los hogares de los alumnos que participan en esta investigación. Para ello, se instalará un pequeño invernadero en el colegio del cuál se obtendrán las muestras para realizar el estudio. Esto aseguraría un gran porcentaje de seguridad en las muestras, ya que no serían manipuladas por agentes externos. Se extraerán diferentes tipos de tejido somáticos y se espera obtener a partir de ellos microplantas viables para ser llevadas a invernadero y luego a viveros, huertos o jardines. 59

2 Investigadores Escolares Patricio Farfán Muñoz (11 años) Cristóbal Villalobos San Martín (11 años) Nicolás Oñate Schneider (11 años) Profesoras Guías Leticia Williams P. Patricia Salazar S. Establecimiento Colegio Concepción, San Pedro de la Paz Asesores Científicos Darcy Ríos L., Doctora en Biología, Docente de la Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Concepción Introducción La micropropagación ha revolucionado la producción vegetal silvoagronómica en los últimos años, ya que gracias a esta técnica se pueden generar clones de variedades élite en grandes cantidades, con un conjunto de beneficios adicionales respecto a la propagación tradicional. La técnica de propagación in vitro de material vegetal es sencilla, pero necesita de un laboratorio equipado y personal calificado, representando una inversión inicial considerable. Esto a largo plazo genera varios beneficios, pero restringe su acceso en países pobres. La micropropagación también permite un control fitosanitario estricto, en especial en lo que se refiere a la obtención de plantas libres de virus, siendo una herramienta de utilidad para el fitomejoramiento. La micropropagación permite reproducir in vitro cientos de clones de una misma especie, los cuales posteriormente son llevados a un vivero y luego al campo de cultivo, donde se desarrollarán y darán lugar al producto de interés económico que se busca obtener. Esta técnica permite optimizar la obtención de clones resistentes y de elevada producción, en grandes cantidades y en un tiempo menor. Las condiciones de laboratorio en las que se realiza la micropropagación permiten obtener nuevas plántulas todo el año, independientemente del factor climático, (temperatura, luz, humedad, etc.). Gracias a esto se pueden abastecer los viveros en cualquier temporada. Micropropagar, es el proceso de multiplicar plantas in vitro a partir de un fragmento de una planta madre y de la cual se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia. Este proceso incluye seis fases: Fase 0 : Preparación de la planta madre. Fase I : Establecimiento de embriones maduros. Fase II : Proliferación de los brotes. Fase III: Elongación. Fase IV: Enraizamiento. Fase V : Aclimatación. En la presente revisión se pretende dar un enfoque global al proceso de micropropagación de plantas medicinales herbáceas con el objetivo de poder obtener plantas a partir de tejidos somáticos, (fragmento de tallo y hoja). Las especies en estudio son: menta, hinojo y toronjil. A partir de tejido somático se pueden obtener plantas adultas en un medio de cultivo adecuado. Materiales Planta de menta, toronjil e hinojo provenientes del invernadero del colegio Medio de cultivo MSd(Medio Murashige y Skoog, 1962) Material de disección: tijera, bisturí y pinzas Mechero de alcohol Cámara de flujo laminar Cámara de crecimiento Horno eléctrico 60

3 Cámara fotográfica Papel de aluminio Frasco de vidrio 200 ml Sustancias químicas: hipoclorito, alcohol. Jabón desinfectante Mascarillas Delantal Papel alusa plas Lápiz marcador punta fina Agitador magnético phmetro Probeta 1000cc Pirex Matraz 500ml Vaso de precipitado 250 ml Agua destilada esterilizada Autoclave Método Las actividades se desarrollaron en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Concepción, en el laboratorio a cargo de la Dra. Darcy Ríos. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO El medio utilizado es el de Murashige y Skoog (1962). Se utilizaron stock de micro y macro nutrientes refrigerados a 4 C. (La preparación del medio se adjunta en el anexo). Fase 0 : Preparación de la Planta Madre: Para lograr establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. En nuestro caso las plantas fueron llevadas al laboratorio de biotecnología vegetal directo del invernadero del colegio. También fueron lavadas con agua, para remover posibles contaminantes. Fase I: Establecimiento del Tejido de los Nudos del Tallo: Se eligieron las plantas madre, se procedió a cortar las mejores hojas y aquellos tallos que presentaban yemas de las que se extrajeron los fragmentos a partir de los cuales se obtuvieron los explantos. Antes de extraer éstos se hizo una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos, siguiendo el procedimiento establecidos en el Laboratorio. Ya en condiciones de asepsia, bajo cámara de flujo laminar y siguiendo los procedimientos establecidos, se extrajeron los explantos del material vegetal y se pusieron en cultivo en un medio de iniciación dentro de un frasco de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explanaos, (2 explantos en cada unidad de investigación o frasco). Para los explantos de hojas se cortó la parte basal de la hoja y se descartó el borde y el ápice, debido a que pudieron ser dañados en el tratamiento de asepsia. Para los explanatos de micro-estacas se colocaron 2 estacas en cada frasco, cuidando que la parte basal del tallo quedase inserta en el medio de cultivo. Fase II : Proliferación de los brotes: Una vez que se tienen rotulados con fecha y especificado el nombre de la planta, y que se encuentran los dos explantos en los frascos, cada uno de ellos es trasladado a la cámara de crecimiento donde se mantuvieron las siguientes condiciones: - Fotoperíodo: 16 horas luz- 9 horas oscuridad, - Humedad relativa: 37%, - Temperatura: 24 C +- 2 C, -Intensidad lumínica: 32 µmol/m 2 /s. Se trabajó con el siguiente material biológico: - HINOJO: 6 unidades de investigación con microestacas, 6 unidades de investigación con hoja; - MENTA: 6 unidades de investigación con microestaca, 8 unidades de investigación con hoja; - TORONJIL: 4 unidades de investigación con microestaca, 6 unidades de investigación con hojas. Se colocaron los frascos en la cámara de crecimiento y se observan 2 veces por semana las características: Sobrevivencia, Oxidación, Contaminación y Crecimiento de brote o callos. 61

4 Resultados Las observaciones cualitativas fueron tabuladas como se muestra mas abajo, se incluyen los resultados para Toronjil. Los resultados para Menta e Hinojo de incluyen en los anexos. I.- SOBREVIVENCIA 0= ningún explanto de las unidades de investigación sobrevive 50% = 1 explanto de la unidad de investigación sobrevive 100%= 2 explantos de la unidad de investigación sobrevive Tabla 1: Registro Sobrevivencia v/s tiempo en hoja (Hj) y microestaca (Me) de Toronjil Sobrevivencia (%) Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me 17-Dic Dic Dic Dic Ene II.- OXIDACIÓN 0= ningún explanto de las unidades de investigación está oxidado 50% = 1 explanto de la unidad de investigación está oxidado 100%= 2 explantos de la unidad de investigación sestán oxidados Tabla 2: Registro % Oxidación v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil Oxidación Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me 17-Dic Dic Dic Dic Ene 0 * 50 * * 100 * III.- CONTAMINACIÓN H= unidad de investigación contaminada con hongos, B= unidad de investigación contaminada con bacterias, 0= sin contaminación, (1) = 1 explanto contaminado (2)= 2 explantos contaminados Tabla 5: Registro Contaminación v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil Contaminación Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me 17-Dic B Dic H H(1) B-H B 0 21-Dic H H(1) H(1) B-H B-H H(1) 27-Dic H H(2) 0 H(2) 0 H(2) H(1) B-H B-H H(2) 02-Ene * * H * 0 * H(2) * B-H * 62

5 IV.- CRECIMIENTO 0 = no hay crecimiento, 1 = 1 explanto de la unidad de investigación presenta crecimiento (microestaca: brote, hoja: callo), 2 = 2 explantos de la unidad de investigación presentan crecimiento (microestaca: brote, hoja: callo). Tabla 7: Registro Crecimiento v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil Crecimiento Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me 17-Dic Dic Dic Dic Ene * * 1 * 1 * 0 * * * * = unidades de investigación que fueron retiradas por estar muy contaminadas. Discusión Debido a sus logros, el cultivo in vitro de tejidos vegetales, y su utilización en las actividades agrícolas, ha tomado auge en forma paulatina y ascendente en las últimas décadas, (Montoya, 1991). El objetivo de esta investigación fue aprender el método de cultivo in vitro y específicamente obtener plantas a partir de tallos y hojas, siendo las especies en estudio: menta, hinojo y toronjil. En primera instancia se puede afirmar que el método de cultivo in vitro es un método viable en la obtención de plantas y se logró aprender a utilizarlo. Los resultados no fueron los esperados, el mejor logro se obtuvo en los explantos de hinojo, luego los de menta y finalmente los de toronjil. Al analizar las observaciones, se puede ver que en relación a sobrevivencia el hinojo obtuvo un mayor porcentaje (aproximadamente 70%), luego la menta (hoja 20% y microestaca 50% aproximadamente) y finalmente el toronjil (hoja 40% y microestaca 0%). Si se considera el % de oxidación, los resultados indican que al menos en el 50% de los explantos se presentaba éste fenómeno. En hojas de toronjil un 60% de los explantos estaban oxidados, mayor oxidación presentaban las microestacas de ésta planta (90%). En el toronjil se observó un 50% en hoja y 70% en microestaca. Finalmente, en menta un 85% en hoja y 65% aprox. en microestaca. Como se observa en los datos obtenidos más del 50% de los explantos estaban oxidados, lo que afectó el crecimiento y desarrollo de éstos evitando que llegaran a formar brotes o callos. Uno de los principales problemas que afecta la técnica de cultivo in vitro de tejido es la contaminación, particularmente de tipo endógena, ocasionada por hongos y bacterias. Estos microorganismos al encontrarse en el interior del tejido, hacen sumamente difícil la utilización del material vegetal. Más del 50% del total de los explantos fueron contaminados por hongos, bacterias o ambos, debiendo ser eliminados 12 unidades de investigación debido al grado de contaminación que presentaban. Estos resultados pueden haberse dado por algún error en el método de asepsia o por mala manipulación de los explantos y la higiene de los estudiantes al trabajar con ellos. Por ejemplo: el uso inadecuado de mascarillas, una mala asepsia en el lavado de manos, o el hecho que los estudiantes trabajaran con el material vegetal muy cerca de la boca, 63

6 pues no tenían práctica en ello. En relación al crecimiento, el hinojo respondió muy bien, tanto en cultivo de hojas como de microestacas. En el caso del toronjil no resultó como se esperaba lo que pudo deberse a que la planta madre de toronjil no fue seleccionada en forma adecuada (estaba deteriorada). Se obtuvieron brotes y callos en menta, siendo más notable el crecimiento en explanaos de microestaca. En explanaos de hojas sólo 2 unidades de investigación tuvieron éxito, lo que pudo deberse al grado de oxidación que presentaban las hojas o a la contaminación. Con más tiempo para proseguir la investigación se podría observar mas claramente el crecimiento de los explantos, que en algunos casos llegó a 6 cm y con varias ramificaciones, o bien de los callos en el caso de los explantos de hojas. Esto queda pendiente para una futura investigación. plantas medicinales entre los alumnos y la comunidad de San Pedro de la Paz, regalando plantas y folletos explicativos de sus beneficios. Para lograr esto, se espera seguir trabajado con el apoyo de la Universidad de Concepción, especialmente de la Dra. Darcy Ríos del Centro de Biotecnología Literatura Citada Fontúrbel Francisco, Micropropagación de un cultivo perenne. Montoya, L. (1991) Cultivo de tejidos vegetales. Medellín. Universidad Nacional de Colombia. Anexos Resultados para Menta e Hinojo: Conclusiones Si bien la micropropagación tiene una gran cantidad de ventajas, el principal problema para su aplicación en la agricultura es la limitación económica y tecnológica. Es posible cultivar plantas herbáceas como la menta, hinojo y toronjil a partir de tejidos somáticos, (micropropagación). La gran cantidad de hongos y bacterias que se presentaron en el cultivo, fueron producto de la manipulación del material vegetal y de la propia carga de microorganismos de las plantas. Para solucionar este problema la planta madre debe tratarse antes con funguicidas y bactericidas en el invernadero o lugar de cultivo. Es necesario hacer notar que es una primera etapa de desarrollo de la propuesta, a partir de los conocimientos adquiridos se pretende implementar una cámara de flujo laminar artesanal en dependencias del colegio. En primer lugar se espera desarrollar la técnica y afinar la manipulación. Luego, se promoverá el uso de 64