BACTERIAS DEGRADADORAS DE HIDROCARBUROS AISLADAS DE SUELOS CONTAMINADOS

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1 BACTERIAS DEGRADADORAS DE HIDROCARBUROS AISLADAS DE SUELOS CONTAMINADOS Belloso Claudio, Carrario Javier Belloso Claudio Mendoza Rosario - Argentina Tel-Fax: belloso@satlink.com Carrario Javier Pasaje Mateo Biglioni 761 Corral de Bustos. Córdoba - Argentina Tel: Palabras Claves: Bacterias Degradadoras de Hidrocarburos. n-hexadecano. Resazurina.

2 RESUMEN La recuperación de un ambiente contaminado con hidrocarburos por medio de la bioremediación, por ejemplo, exige un adecuado estudio y caracterización de los microorganismos presentes. Se han logrado aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de suelos contaminados, se han cultivado en el laboratorio y se han alimentado con un hidrocarburo puro como única fuente de carbono. Estas bacterias, una vez probada su actividad hidrocarburolítica podrían emplearse para acelerar los procesos de biodegradación. INTRODUCCION Los residuos oleosos producidos por la industria petrolera continúan siendo un problema ambiental respecto a su tratamiento y disposición final. Industrias enclavadas en un comienzo en lugares muy poco poblados, hoy, debido al gran crecimiento demográfico, algunas de ellas han quedado encerradas dentro de un cerco, en el cual, no solo está la industria sino también su otrora landfarming. La recuperación de un ambiente contaminado con hidrocarburos como este por medio de la bioremediación, por ejemplo, exige un adecuado estudio y caracterización de los microorganismos presentes. OBJETIVOS Aislar cepas bacterianas y estudiar su crecimiento en medios líquidos y sólidos conteniendo hidrocarburos como única fuente de carbono.

3 MATERIALES Y METODOS Matriz: suelo obtenido del Landfarming de Refinería San Lorenzo, industria petrolera ubicada en la Ciudad de San Lorenzo, Provincia de Santa Fe. Extractables en Eter Etílico (E.E.): 3,43 % p/p. Antigüedad del Landfarming: 15 años. Aislamientos: Diluciones del suelo al 1% fueron sembradas en tubos con 5ml de caldo Bushnell - Haas (1) conteniendo 50 µl de n- hexadecano esterilizado por radiación UV y 100 µl de una solución estéril de resazurina de 50 ppm. Se hicieron los correspondientes blancos de indicador y de n-hexadecano. Se incubaron durante cinco días a 30 C. Se consideraron positivos aquellos cultivos en los cuales viró el indicador, de azul a rosado. De los cultivos positivos se realizó posteriormente el aislamiento en Agar Bushnell - Haas suplementado con n-hexadecano. Al cabo de siete días de incubación a 30 C se obtuvieron colonias incoloras, pequeñas de borde entero e irregular. RESULTADOS Para corroborar que las colonias que crecían en medio sólido con n- hexadecano, también podían crecer con el extractable etéreo obtenido del suelo contaminado, se tomaron al azar 12 colonias de las obtenidas y se las sembró nuevamente en 12 tubos conteniendo Caldo Bushnell - Haas con indicador resazurina y con el extractable etéreo ahora como única fuente de carbono. Se sembraron paralelamente tubos testigos que contenían la cepa aislada en Bushnell - Haas con el indicador sin fuente de carbono. Se incubaron los tubos durante cinco días a 30 C, en 7 de los 12 tubos se pudo observar el viraje del indicador, mientras que en los 12 tubos testigo no se detectó cambio alguno del indicador. De los 7 tubos positivos se aisló nuevamente en Agar Bushnell - Haas con el extractable etéreo como única fuente de carbono.

4 Al cabo de 7 días de incubación a 30 C aparecieron las colonias en las 7 placas. Mediante el Kit API 20E se pudo identificar solo una de las siete cepas aisladas, la cual correspondió a Pseudomonas aeruginosa. Las seis cepas restantes se estudiaron mediante 38 reacciones bioquímicas, no pudiéndose lograr finalmente su identificación (2). Las cepas estudiadas no identificadas mostraron entre sí una similar taxonomía numérica de alrededor del 30 %. Cuadro 1. Reacciones Bioquímicas de las cepas aisladas en Kit API 20E CEPAS Nº TEST (* ONPG ADH LDC ODC CIT H 2 S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO N MOB McC OF-O OF-F

5 (*) Abreviaturas: ONPG, β-galactosidasa; ADH, arginina dehidrolasa; LDC, lisina descarboxilasa; ODC, ornitina descarboxilasa; CIT, citrato; H2S, ácido sulfhídrico; URE, ureasa; TDA, triptófano desaminasa; IND, indol; VP, producción de acetoína, GEL, gelatinasa; GLU, glucosa; MAN, manitol; INO, inositol; SOR, sorbitol; RHA, ramnosa; SAC, sacarosa; MEL, melibiosa; AMY, amigdalina; ARA, arabinosa; OX, citocromo oxidasa; NO 2, producción de NO 2 ; N 2, producción de N 2 ; MOB, movilidad; McC, crecimiento en agar Mac Conkey; OF, oxidación fermentación. CONCLUSION Aproximadamente un 60% de las cepas aisladas que crecen con n- hexadecano como única fuente de carbono también lo hacen con el extractable etéreo. De cualquier manera, algunas cepas pierden la capacidad de crecer con hidrocarburos como única fuente de carbono después de 2 o 3 transferencias sucesivas por distintos medios. El mismo hábitat en el cual se desarrollan este tipo de bacterias podría ser la causa de los cambios observados en sus fenotipos lo cual conduce a la baja coincidencia con las especies codificadas. Dichas bacterias podrían utilizarse para degradar hidrocarburos en suelos una vez propagadas en laboratorio y luego inoculadas. BIBLIOGRAFIA (1) Bushnell, LD; Haas, HF. The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms. J. Bacteriol. 41: , (2) Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JT, Williams ST. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 9 th ed., Baltimore, Williams & Wilkins, 1994.