Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill.

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Víctor Manuel Barbero Hernández
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1 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Autor. Beatriz Cuenca Otros autores. M.R.Fernández, L. Ocaña, C. Salinero, C. Pintos, J.P. Mansilla y C. Rial Presenta: Francisco Lario Avila, 24 de Septiembre de 29

2 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 2/11 ANTECEDENTES El componente aditivo de la resistencia a la tinta no es importante (Fernández-López y col, 1999) En áreas donde Phytophthora está presente desde el siglo XIX, se encuentran niveles de resistencia más altos que en áreas recientemente infectadas (Vettraino y col, 25) Se han detectado alta variación intraclonal en la susceptibilidad a la enfermedad de la tinta y se han encontrado árboles y familias resistentes (Robin y col, 27) Tiene sentido por tanto desarrollar un programa de mejora para resistencia del castaño a la tinta basado en selección en campo. ü prospección de 18,89 ha ü 26 árboles seleccionados OBJETIVO Testar la colección de árboles candidatos para determinar su nivel de resistencia por el método más fiable Desarrollar un nuevo test de resistencia para ser aplicado in vitro

3 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 3/11 TEST DE INOCULACIÓN DE ESTACA ESCINDIDA (Salesses y col, 1993) Material adulto de invierno, inoculado con un disco de micelio en cámara controlada L L L L 166 clones testados P38 P14 Variables medidas Control Inoculado Inoculado Control Longitud de la lesión (LL) en mm el día 14 y 21 Progreso de la enfermedad como (ΔLL14/14+ ΔLL21/7)/2

4 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 4/11 TEST DE ESTACA: material adulto El 22, 4 de los genotipos seleccionados presentan una LL21 inferior a 2 mm LL (mm) <2, 1, 2, 3, Hay una baja correlación entre LL21d y la supervivencia en el test de inoculación al sustrato (r=,8): test fiable? mm P14 C17 P24 P38 P39 C48 P23 P18 P29 P28 P34 P44 Resistente Susceptible Muy susceptible LL 14 d (mm) LL 21 d (mm) Disease progress (mm/d) P14, C17 muestran los mejores resultados mm/day % mm C48 LL 14 d LL 21 d Disease progress P11 C47 P29 P44 P18 P15 P16 P26 P24 P14 Resistente Susceptible Muy susceptible TEST DE ESTACA: material rejuvenecido 26 clones testados Material juvenil mucho más sensible al avance de la enfermedad LL no depende del diámetro de las estacas Alta interacción entre genotipo y la edad ontogénica del material Correlación alta y significativa entre el progreso de la enfermedad y la supervivencia en el test de inoculación del sustrato (r= -,97**) P2 P21 C96 P33 P22 P39 C17 P m m /día

5 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 5/11 TEST DE INOCULACIÓN DEL SUSTRATO (Robin y col, 26) Vitroplantas aclimatadas Variables medidas: NPR % CPC LPC Miranda-Fontaíña y col, 27 ü Supervivencia ü Nivel de daño (-4) ü Presencia de podredumbre de raíz y podredumbre de cuello (si o no) ü Nivel de podredumbre de raíz: 1-5 ü Circunferencia de podredumbre en cuello (%) ü Longitud de podredumbre 4 en el tallo (cm) ü Peso freso de la raíz (g) ü Reaislamiento positivo del hongo de suelo y raíz Vettraino y col, 21

6 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 6/11 Nivel de podredumbre de raíz y circunferencia de podredumbre de cuello son las variables más discriminantes (ANOVA) C6 y P11 muestran valores semejantes a C. crenata Test de estaca escindida a b c d Estacas adultos Estacas juveniles Supervivencia (%) Nivel podredumbre de raíz Circunferencia podredumbre de cuello (%) Progreso enfermedad (%/d) LL (21d),8 ns (-),6 ns (-),3 ns,63 * Progreso enfermedad (mm/d),4 ns (-),3 ns (-),27 ns,62 * LL (21d) (-),75 ns,68 ns,6 ns,41 ns Progreso enfermedad (mm/d) P14 control Test de inoculación del sustrato P14 inoculado (-),97**,94 *,89 *,64 ns C. sativa inoculado C. crenata inoculado Nivel %/día 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 Resistente Parcialmente Susceptible Muy susceptible resistente Nivel de podredumbre de raíz Circunferencia de daño en el cuello Root rot level Circunference of collar rot (%) 1,2 1,,8,6,4,2, Progreso de la enfermedad (%/día) 12 1 P34 C39 P29 P39 P22 C47 P33 CS P24 C17 P2 C3 P15 C96 C48 P18 P44 P21 P26 C31 P16 C11 C35 C6 P36 CC P14 P11 Resistente Susceptible Muy susceptible % Las correlaciones son más altas y significativas cuando se emplea estacas juveniles Con estacas adultas, el progreso de la enfermedad en ambos tests, presenta correlaciones moderadamente altas y significativas P11, P14 y P36 se presentan como muy resistentes de los 26 clones testados Nuevos tests en curso (27 clones), apuntan también P42, C4 y C97 como resistentes

Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 7/11 TEST DE INOCULACIÓN in vitro (Rial y col, 27) 1.

7 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 7/11 TEST DE INOCULACIÓN in vitro (Rial y col, 27) 1. Enraizamiento de los explantos en medio sólido 1/3 GD tras inmersión basal en AIB 1g/l 1min 2. Trasferencia de los explantos enraizados a WPM líquido en puente de papel 3. Cultivo del micelio del hongo en medio V8 y preparación del inóculo para la obtención de zoosporas (Chen y Zentmeyer, 197) 6. Reaislamiento del micelio del hongo de fragmentos de tallo y raíz de todas las plantas muertas 5. Registro de la evolución de síntomas del día a la completa muerte de todos los explantos 4. Inoculación del explanto enraizado en crecimiento activo con zoosporas del hongo

8 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 8/11 Las variables medidas fueron: 41 clones testados ü Progreso de la enfermedad como nº de días transcurridos hasta el 1% de las muertes ü % de reaislamiento positivo en raíz y tallo Test in vitro Coeficientes de correlación entre las variables del test in vitro y de inoculación al sustrato Días hasta el 1% de las muertes Supervivencia (%) Nivel de daño en la raíz Test de inoculación al sustrato Circunferencia de daño en el cuello de la raíz (%) Indice de progreso de la enfermedad (%/dia),43 n.s (-),43 n.s (-),42 n.s (-),67 * Control Planta inoculada. Daños tallo Control Planta inoculada. Daños raíz % planta muerta 1, 75, 5, 25,, Progreso de la enfermedad in vitro P29 P39 HS P15 Sativa C48 C17 P44 P11 P14 Crenata C Días Los síntomas en este test se manifiestan muy pronto, y la muerte alcanza al 1% de los explantos. En los clones con un avance más rápido de la enfermedad que C. sativa (en rojo), el 75% de las muertes se da en los 25 primeros días. Serán los clones muy sensibles. En los clones con un avance menor que el de C. crenata (en verde), el 75% de los explantos tarda más de 5 d en morir (clones resistentes).

9 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 9/11 % muertes 1, 75, 5, 25,, Clones muy sensibles C. sativa C. crenata Día 1 Día 25 Todos los clones clasificados como sensibles o muy sensibles in vitro presentan ese mismo comportamiento ex vitro salvo HS. P29 P39 P16 C81 L17 C34 P48 C13 P15 C95 C12 P3 P38 C4 CS P29* C14 CC HS Algunos de los clones clasificados como resistentes in vitro, se comportan de manera sensible en el test ex vitro CONFIRMAR LOS PRESELECCIONADOS CON EL TEST DEL SUSTRATO Día 1 Día 5 Día 7 % muertes 1, 75, 5, 25,, Clones resistentes C. sativa C. crenata CS P14 P44 P39* P11 L2 P35 C92 CC C9 C47 C4

10 Testaje de resistencia a Phytophthora cinnamomi de genotipos adultos seleccionados de Castanea sativa Mill. Beatriz Cuenca 1/11 CONCLUSIONES 1. Podemos usar el test de inoculación en estaca adulta para preclasificar el material seleccionado en campo atendiendo al progreso de la enfermedad ya que presentan correlaciones moderadamente altas y significativas con el test ex vitro de inoculación del sustrato. Si se emplean estacas juveniles, las correlaciones son más altas y significativas. 2. Igualmente, el progreso de la enfermedad en el test de in vitro muestra correlaciones moderadamente altas y significativas con el test ex vitro de inoculación del sustrato. Para clasificar el material atenderemos al momento en que el 75% de los explantos han muerto. Descarta bien los sensibles pero hay que confirmar la resistencia ex vitro 3. No se han testado todos los clones mediante los tres métodos, pero podemos concluir de lo observado hasta ahora: ü ü ü Dos de los clones se clasifican entre los más resistentes por los tres tests, P11, P14 así que los consideraremos los más resistentes. C4 se manifiesta resistente en dos de los tres tests. Los clones clasificados como sensibles o muy sensibles en al menos dos de los tres test serán definitivamente descartados: P15, P2, P21, P22, P24, P29, P33, P34, P39, C17, C96 C47 y P44 muestran buenos resultados en el test de estaca adulta y test in vitro, pero el test ex vitro los clasifica como sensibles. Sin embargo, el porcentaje de reaislamiento positivo del hongo en las raíces de las plantas muertas de estos clones fue bajo (5 y 8,3% respectivamente) lo que sugiere la posibilidad de la muerte por otras causas

11 Agradecimientos. Al Dr. Pedro Mansilla de la Diputación de Pontevedra y su equipo por su ayuda y asistencia técnica. A Begoña Pato, Mª Jesús Fariñas y Mª Sol Limia, técnicos de laboratorio de TRAGSA por el excelente trabajo que han hecho micropropagando, aclimatando y testando una cantidad tan grande de genotipos de castaño. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el programa PROFIT del Ministerio de Ciencia y Tecnología (FIT ) y por el programa INCITE de la Xunta de Galicia (PGIDIT7MRU3E). Contacto. bcuenca@tragsa.es

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