ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE

Transcripción

1 ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE FUNDAMENTOS INSTRUMENTACION FUNCIONAMIENTO APLICACIONES

2 FUNDAMENTOS La espectroscopia UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la radiación ultravioleta-visible (radiación con longitud de onda comprendida entre los 160 y 780 nm) por una molécula. La absorción de esta radiación causa la promoción de un electrón a un estado excitado. Los electrones que se excitan al absorber radiación de esta frecuencia son los electrones de enlace de las moléculas, la espectroscopia UV-Vis se utiliza para la identificación de los grupos funcionales presentes en una molécula. Las bandas que aparecen en un espectro UV-Vis son anchas debido a la superposición de transiciones vibracionales y electrónicas.

3 INSTRUMENTACION Una fuente de radiación estable. Selector de longitud de onda. Porta muestras. Detector o transductor de la radiación. Procesamiento de señales y dispositivo de salida.

4 FUNCIONAMIENTO Fuente de luz: Las lámparas halógenas de tungsteno, que tienen una temperatura radiante T de 3000 K por encima de los 330 nm), lámparas de deuterio con región UV por debajo de los 330 nm, Las lámparas de arco de xenón menos de 190 nm y por encima de 1000 nm Sistema óptico: a través de filtros, lentes y redes de difracción se focaliza el haz de luz y se selecciona una longitud de onda fija. Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un espesor conocido, normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso óptico, sobre la que se hace incidir el haz de luz monocromática Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y selecciona por longitudes de onda Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida a cada longitud de onda y la transforma en señal eléctrica que un ordenador pueda procesar.

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7 APLICACIONES Determinación de iones metálicos y complejos de elementos de transición ( Ni+2, Cu+2, Co+2, Cr2O7-2 ) Fe(II,Fe(III) Campos: industrial, clínico, forense, medio ambiente Determinación de grupos funcionales en moléculas orgánicas Análisis de muestras bioquímicas Análisis de semiconductores Determinación cuantitativa y cualitativa

8 VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS ESTABLES DE ÓXIDO NÍTRICO EN FLUIDOS BIOLÓGICOS

9 REACCIÓN DE GRIESS La prueba de Griess es una prueba química que detecta la presencia de nitritos orgánicos. La reacción de diazotación de Griess, en la que se fundamenta el reactivo de Griess. Este método se basa en la reacción del analito en medio ácido para formar una sal diazonio que acoplada a aminas aromáticas produce un colorante azo (diazotización de Griess). Esta reacción de color es monitoreada fácilmente por medio de espectrofotometría.

10 RESUMEN Se utilizo la espectrometría de UV-Vis para la cuantificación de metabolitos estables de óxido nítrico (NO3-) en muestras biológicas (suero). utilizando la reacción colorimé-trica de Griess.

11 INTRODUCCIÓN El óxido nítrico (NO) es un gas incoloro escasamente soluble en agua, con un electrón no apareado en su capa de valencia externa, lo que lo convierte en una molécula paramagnética con naturaleza de radical libre que participa en procesos fisiológicos y patológicos. El NO puede ser cuantificado por métodos directos (cromatografía de gases, espectrometría de masas), ni indirectos (espectrometría de UV-Vis y métodos electrométricos). Se han reportado varias técnicas para la detección de los metabolitos estables del NO (NO3- y NO2-), siendo la más utilizada la detección colorimétrica con reactivos de Griess.

12 Preparación de disoluciones METODOLOGIA -Se preparan disoluciones de: cloruro de vanadio 0.08 % p/v en H₃PO₄ 1 M, sulfonilamida 2% p/v en H₃PO₄ 5% v/v y una disolución de diclorhidrato de N- etilendiamina 0.2 % p/v en agua destilada. Procedimiento experimental para disoluciones acuosas: -Se utilizó solución stock de NaNO₃. -Se evaluó la selectividad del sistema analítico frente a la presencia de otros aniones. -Para la evaluación se utilizó una disolución de Krebs-Henseleit.

13 -Se realizó un barrido en el espectrofotómetro entre 0 y 1100 nm. -Con esto se realizó una serie de curvas patrón de NaNO₃ en el intervalo de concentración de 0 a 100 µm. -Se preparó otra serie de soluciones a partir del NaNO₃. -Se evaluó la linealidad del sistema y del método utilizando como documentos guía a las Guías de Validación de Métodos Analíticos Procedimiento experimental para fluidos biológicos: -Se centrifugaron a rpm por 3 min muestras de sangre de pacientes sanos y pacientes con afecciones cardiovasculares. -Se evaluó el método analítico bajo los parámetros de: sueros sin desproteinizar y sueros desproteinizados

14 -Para evaluar la selectividad del sistema analítico se emplearon aniones con estructura similar al NO ₃. -Una vez obtenidos los sueros humanos se realizo un barrido en UV-Vis entre 500 y 600 nm. -Al suero obtenido a una cantidad de 20 µl se le adicionó una serie de disoluciones. -Finalmente se evaluó la linealidad, exactitud y precisión.

15 RESULTADOS Selectividad del sistema analítico para disoluciones acuosas: El diazocompuesto formado presenta una banda de absorción en la región UV-Vis a una longitud de onda de 540 nm, y ya que esta bando no se encuentra en todos los espectros tomados se dice que el sistema analítico es selectivo

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18 Linealidad del sistema y método analítico en disoluciones acuosas fuertemente electrolíticas: Para el sistema analítico, se cumple con que el coeficiente de determinación (r²) es mayor a 0.98, por lo que el sistema analítico es lineal. El sistema analítico para disoluciones acuosas muestra un límite de detección de 0.01 µm y el límite de cuantificación 0.04 µm.

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20 Linealidad del sistema y método analítico en fluidos biológicos: La linealidad del sistema en el análisis del suero el cual era la muestra biológica fue un (r²) de , en el intervalo de concentración de 0 a 40 µm, un límite de detección de 0.69 pm y un límite de cuantificación de 2.10 pm, por lo que el sistema analítico para fluidos biológicos es lineal.

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22 Análisis de la exactitud del método analítico para el análisis de fluidos biológicos: Los resultados obtenidos en las condiciones para fluidos biológicos cumplen con los requisitos necesarios para que el método analítico sea considerado como exacto.

23 Análisis de la precisión del método analítico para el análisis de fluidos biológicos: Los resultados obtenidos cumplen con los requisitos para fluidos biológicos, lo cual está estipulado para determinar si el método analítico sea preciso como lo es en este caso.

24 CONCLUSIONES El método de Griess, modificado para los fines experimentales de nuestro laboratorio y validado de acuerdo a la Guía de validación de métodos bioanalíticos, ha mostrado ser un método analítico lineal, exacto y preciso, con un porcentaje de recobro analítico y un coeficiente de variación superiores a los calculados para kits disponibles actualmente en el mercado, por lo que representa una alternativa viable y rentable para la cuantificación de metabolitos estables de óxido nítrico (NO ₃ y NO ₂)

25 GRACIAS