NTE INEN Primera Revisión 2015-xx

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1 Quito Ecuador NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 9-8 Primera Revisión -xx CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. DETECCIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI PRESUNTIVA POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE MICROBIOLOGY CONTROL OF FOOD. DETECTION AND ENUMERATION OF PRESUMPTIVE ESCHERICHIA COLI BY MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE DESCRIPTORES: microbiología de los alimentos, ICS: 7.. Páginas

2 NTE INEN 9-8 Norma Técnica Ecuatoriana CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. DETECCIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI PRESUNTIVA POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE NTE INEN 9-8 OBJETO Esta norma proporciona un método para para la detección y enumeración de Escherichia coli presuntiva por las pruebas bioquímicas IMVIC y la técnica del número más probable.. ALCANCE El método descrito en esta norma sirva para determinar Escherichia coli presuntiva por la técnica del número más probable y las pruebas bioquímicas confirmatorias en: productos destinados al consumo humano y la alimentación de los animales muestras ambientales en el ámbito de la producción alimentaria y manipulación de alimentos. REFERENCIAS NORMATIVAS Los siguientes documentos en su totalidad o en parte, son referidos en este documento y son indispensables para su aplicación. Para referencias fechadas, solamente aplica la edición citada. Para referencias sin fecha, aplica la última edición del documento de referencia (incluyendo cualquier enmienda). NTE INEN 9- Control microbiológico de los alimentos. Preparación de medios de cultivo NTE INEN ISO 8 Control microbiológico de los alimentos. Determinación de microorganismos coliformes por la técnica del número más probable ISO/TS - Microbiología de los alimentos y piensos - Directrices para la preparación y producción de medios de cultivo - Parte : Directrices generales sobre la garantía de calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio ISO/TS - Microorganismos de ensayo para medios de cultivo comúnmente usado NTE INEN ISO 6887-, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte : reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y las diluciones decimales NTE INEN ISO 6887-, Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal. Preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte : reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos NTE INEN ISO 6887-, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte : reglas específicas para la preparación de pescados y productos de la pesca. NTE INEN ISO 6887-, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte : reglas específicas para la preparación de productos distintos a leche y productos lácteos, carne y productos cárnicos y, pescados y productos de la pesca NTE INEN ISO 6887-, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte : reglas específicas para la preparación de leche y productos lácteos. -xx de

3 NTE INEN 9-8. DEFINICIONES Para la aplicación de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:. Escherichia coli presuntiva. Bacteria perteneciente al grupo de los coliformes fecal capaz de fermentar lactosa a C con producción de gas, es capaz de producir indol a partir de triptófano, reacciona positivamente a la prueba de rojo de metilo y negativo a la prueba de Voges Proskauer y no usa el citrato como única fuente de carbono.. Recuento de Escherichia coli presuntiva. Es el número más probable de Escherichia coli por mililitro o por gramo de la muestra problema.. IMVIC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de cada prueba.. MÉTODO PARA DETECCIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI PRESUNTIVA POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE. Fundamento.. Método de detección de coliformes Los tubos que presentan opacidad o producción de gas en le medio liquido de enriquecimiento selectivo y cuyos subcultivos han producido gas en Caldo EC e indol en agua de peptona a C se considera que contienen Escherichia coli presuntiva... Método de enumeración El número más probable de Escherichia coli presuntiva es determinado por medio de la tabla MPN (ver apéndice Y), acorde con el número de tubos con medios de concentración simple o doble cuyos subcultivos han producido gas in el caldo EC e indol en agua peptonada a C... Pruebas INVIC para determinación de Escherichia coli La determinación de Escherichia coli se realizan mediante la aplicación de las pruebas bioquímicas INVIC.... Prueba de indol. Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs). El triptófano forma parte de las peptonas del medio. Escherichia coli es positiva a la prueba de indol.... Prueba de rojo de metilo. Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el ph del medio hasta -. Dicho cambio de ph se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo. Escherichia coli es positiva a la prueba de rojo de metilo,... Prueba de Voges Proskauer. Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al %), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej. Arginina). Escherichia coli es negativa a la prueba de Voges Proskauer.... Prueba de citrato. Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. Se utiliza el medio de Simmons que consiste en un medio sólido con citrato sódico y un -xx de

4 NTE INEN 9-8 indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato. Escherichia coli es negativa a la prueba de citrato.. Reactivos y materiales.. Medio de enriquecimiento selectivo (Caldo de lauril sulfato) TABLA. Composición del medio de enriquecimiento selectivo Componente a) Medio de concentración simple b) Medio de concentración doble Triptosa, g, g Lactosa, g, g Fosfato monoácido de potasio (K HPO ), g,7 g Fosfato diácido de potasio, g,7 g (KH PO ) Cloruro de sodio (NaCl), g, g Lauril sulfato de sodio, g, g [CH (CH ) OSO Na] Agua destilada ml ml... Preparación Disolver los componentes del medio completo deshidratado en agua, por calentamiento si es necesario. Ajustar el ph, si es necesario, de modo que después de la esterilización sea 6,8 ±, a C. En el caso del medio de concentración simple dispensar el medio en cantidades de 9 ml dentro de tubos de 6 mm x 6 mm que contengan tubos Durham. En el caso del medio de concentración doble dispensar el medio en cantidades de ml dentro de tubos de 8 mm x 8 mm que contengan tubos Durham. Esterilizar por min en una autoclave a C. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización... Caldo EC TABLA. Composición del Caldo EC Componente Tripteína Lactosa Sales biliares nro. Fosfato monopotásico (K HPO ) Fosfato dipotásico (KH PO ) Cloruro de sodio (NaCl) Agua destilada Cantidad, g, g, g, g, g, g ml... Preparación Disolver los componentes del medio completo deshidratado en agua, por calentamiento si es necesario. Ajustar el ph, si es necesario, de modo que después de la esterilización sea 6,8 ±, a C. Dispensar el medio en cantidades de ml dentro de tubos de 6 mm x 6 mm que contengan tubos Durham. Esterilizar por min en una autoclave a C. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. -xx de

5 NTE INEN Agua de peptona libre de indol TABLA. Composición del agua de peptona libre de indol Componente Peptona Cloruro de sodio Agua destilada Cantidad, g, g ml... Preparación Disolver los componentes del medio completo deshidratado en agua, por calentamiento si es necesario. Ajustar el ph, si es necesario, de modo que después de la esterilización sea 7, ±, a C. Dispensar el medio en cantidades de ml a ml dentro de tubos de 6 mm x 6 mm. Esterilizar por min en una autoclave a C... Caldo para las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer (MR-VP), ver la NTE INEN Solución de rojo de metilo, ver la NTE INEN Solución de creatinina al,%, ver la NTE INEN Solución de α-naftol, ver la NTE INEN Solución de hidróxido de potasio (KOH) al %, ver la NTE INEN Agar citrato de Simmons, ver la NTE INEN solución de alcohol cetona, ver la NTE INEN Solución de cristal de violeta al %, ver la NTE INEN Solución de fucsina básica al %, ver la NTE INEN Solución de lugol, ver la NTE INEN Reactivo de Kovacs, ver la NTE INEN Agar nutritivo, ver la NTE INEN Agar de contaje en placa (PCA), ver la NTE INEN Agar de eosina azul de metilo (EMB), ver la NTE INEN Agar cristal violeta-rojo neutro bilis (VRB), ver la NTE INEN Tubos de ensayo, de dimensiones de aproximadamente de 6 mm x 6 mm y 8 mm x 8 mm.o mm x mm... Tubos Durham, de tamaño adecuado para que pueda colocarse dentro de los tubos de ensayo... Pipetas para entregar (TD), que tengan una capacidad nominal de ml a ml.. Asas de muestreo, hechas de platino/iridio o niquel/cromo, aproximadamente de mm de diámetro o de µl si son asa estériles desechables. -xx de

6 NTE INEN 9-8. Equipos Se requieren los equipos usados comúnmente en el laboratorio de microbiología y, en particular, los siguientes:.. Aparato de esterilización seca (estufa) o esterilización húmeda (autoclave)... Incubadora, capaz de operar a 7 C ± C y C ± C... Baño de agua, capaz de mantenerse a C ± C... Potenciómetro, que tenga una resolución de, unidades de ph y una exactitud de ±, unidades de ph a C.. Prueba de calidad del medio Para probar el rendimiento y aseguramiento de la calidad del medio de cultivo se puede usar la ISO/TS - y la ISO/TS -.. Preparación de muestra y las diluciones Se prepara y diluye la muestra de acuerdo al producto a analizar para alimentos de consumo humano y animal según la NTE INEN ISO , para carne y productos cárnico según la NTE INEN ISO 6887-, para pescados y productos de pesca según la NTE INEN ISO 6887-, para leche y productos lácteos NTE INEN ISO y para otros productos diferentes a los anteriormente citados según la NTE INEN ISO Procedimiento.6. Método de detección Agregar ml de suspensión inicial a 9 ml de caldo lauril sulfato (medio de enriquecimiento selectivo) de concentración simple (..) o de suspensión inicial a ml de caldo lauril sulfato de concentración doble (..). Incubar los tubos a 7 C ± h por h, si no se observa opacidad ni producción de gas incubar hasta 8 h± h. Nota : Para mariscos vivos, el tiempo de incubación aconsejable es 8 h± h. Nota : Para algunos productos lácteos como la caseína, el tubo Durham puede pegarse a la parte inferior de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo, si después del período de incubación se observa opacidad pero no producción de gas, inocular el caldo EC con este caldo y proceder como se detalla en el paso siguiente. A los tubos que presentaron opacidad o presencia de gas se debe subcultivar, inoculando con un asa de muestreo (..) un tubo que contiene Caldo EC (medio líquido selectivo) (..) e incubarlos en el baño de agua (..) o en la incubadora (..) a C por h ± h. Si no se observa la presencia de gas extender la incubación hasta 8 h± h. Nota : Para mariscos vivos, el tiempo de incubación aconsejable es h± h. A los tubos que presentaron opacidad o presencia de gas, se debe subcultivar, inoculando con un asa de muestreo (..) a un tubo con agua de peptona (..) precalentada a C. Incubar por 8 h± h a C..6. Pruebas INVIC para determinación de Escherichia coli A las muestras a las cuales se ha aplicado el procedimiento citado en el numeral.6. y han mostrado presencia de opacidad y gas, sembrar por estriación con un asa en una placa individual de agar eosina azul de metilo (EMB), o agar cristal violeta-rojo neutro bilis VRB previamente seca e identificada. Incubar las placas invertidas a C a 7 C por h ± h. -xx de

7 NTE INEN 9-8 Para confirmar la presencia de Escherichia coli de cada placa escoger a colonias bien aisladas y típicas (negra o nucleada con brillo verde metálico de a mm de diámetro) y sembrar por estriación con asa en tubos de agar de contaje en placa (PCA) o agar nutritivo inclinado e incubar los cultivos C a 7 C por h ± h. Tomar colonias que han crecido en los medios citados anteriormente y aplicar la tinción Gram, a las colonias que sean bacilos gram negativos no esporulados, utilizarlos para las pruebas INVIC. El procedimiento para las pruebas confirmatorias INVIC es el siguiente:.6.. Prueba para determinar la producción de indol Agregar, ml del reactivo de Kovacs (..) para los tubos inoculados en agua de peptona de acuerdo al numeral.6. que han producido gas visible el tubo con caldo EC. Mezclar bien y examinar después de min. La presencia de un color rojo en la fase alcohólica indica la producción de indol..6.. Prueba de rojo de metilo Sembrar en un tubo con caldo (MR-VP) un asa de cultivo puro obtenido del tubo de agar de contaje en placa (PCA) o agar nutritivo inclinado, incubar de C a 7 C por h ± h. Agregar gotas de solución de rojo de metilo (..) mezclar bien. Si el cultivo se torna rojo la prueba es positiva si hay viraje de color a a amarillo la prueba es negativa..6.. Prueba de Voges Proskauer Sembrar en un tubo con caldo MR-VP (..) un asa con cultivo puro (obtenido del tubo de agar de contaje en placa (PCA) o agar nutritivo inclinado), incubar de C a 7 C por h ± h. Luego del perdió de incubación agregar gotas de solución de creatina al, % (..6), gotas de solución de α-naftol (..7) y gotas de hidróxido de potasio (KOH) al % (..8). Observar después de min la formación de un color rosado o rojo brillante, indica un resultado positivo, caso contrario es negativa. Nota: Generalmente después de min ya se observa un resultado positivo..6.. Prueba para la utilización de citrato Sembrar en un tubo con agar citrato de Simmons (..9) inclinado un asa con cultivo puro (obtenido del tubo de agar de contaje en placa (PCA) o agar nutritivo inclinado), incubar de C a 7 C por h ± h. La prueba es positiva cuando se observa un viraje de color del medio de verde a azul, caso contrario es negativa. Considerar como Escherichia coli a los microorganismos que presentan las siguientes características: bacilos Gram negativos no esporulados que producen gas a partir de la fermentación de la lactosa y cumplen los resultados a las pruebas INVIC según la tabla..6. Método de enumeración Una serie de tres tubos de cada dilución está previsto. Si es necesario se incuba una serie de cinco tubos (ver apéndice Y) para maricos vivos u otros productos especiales, o cuando se requiera para tener una mayor exactitud de resultados. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración. Utilice una pipeta estéril, transfiera a cada de estos tubos ml de suspensión inicial. Estas porciones de test corresponden a g de muestra por tubo. -xx 6 de

8 NTE INEN 9-8 Luego, tomar tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de simple concentración. Utilice una pipeta estéril nueva, transferir a cada uno de los tubos ml de suspensión inicial. Estas porciones de test corresponden a g de muestra por tubo. Cada una de las diluciones futuras (igual a, g;, g; etc de muestra por tubo) proceder como en el paso anterior. Usar una nueva pipeta para cada dilución. Cuidadosamente mezclar el inóculo con el medio. Inocular los medios inoculados de simple y doble concentración en la incubadora a 7 C por h ± h. Si no existe presencia de gas inocular hasta 8 h ± h. Nota : Para mariscos vivos el tiempo de incubación adecuada debe ser 8 h ± h. Nota : Para algunos productos lácteos como la caseína, el tubo Durham puede pegarse a la parte inferior de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo, si después del período de incubación se observa opacidad pero no producción de gas, inocular el caldo EC con este caldo y proceder como se detalla en el paso siguiente. Los tubos de concentración simple o doble que presentan opacidad o presencia de gas visible deben subcultivarse en un tubo que contenga Caldo EC inoculando un asa de muestra. Incubar estos tubos inoculados en baño María o en incubadora a C por h ± h, si no se observa presencia de gas incubar hasta 8 h ± h. Para mariscos vivos, el total de tiempo de incubación debe ser de h ± h. Para cada tubo inoculado en caldo EC en los que se encontró presencia visible de gas, inocular un asa de estos en un tubo con agua de peptona precalentada a C, incubar por 8 h ± h a C.7 Informe de resultados El informe del análisis debe detallar: a) toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra; b) el método de toma de muestras utilizado, si se conoce; c) el método empleado, haciendo referencia a esta norma nacional, es decir NTE INEN 9-8; d) todos los detalles experimentales no descritos en esta norma nacional, o considerados opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber influido sobre el(los) resultado(s); e) los resultados obtenidos en la prueba expresados de la siguiente manera según el método:.7. Método de detección de Escherichia coli Considerar como positivos a las muestras tratados acorde el numeral.6. que han presentado presencia de gas en el caldo EC y que cumplan con los resultados de Escherichia coli a las pruebas INVIC. Reportar la presencia o ausencia de Escherichia coli presuntiva en la porción de ensayo, especificando la masa en gramos o el volumen en mililitros de la muestra de ensayo..7. Método de determinación de Escherichia coli El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de cada prueba, ver tabla. -xx 7 de

9 NTE INEN 9-8 Tabla. Resultados de Escherichia coli a las pruebas INVIC Nombre de la Producción de prueba indol Producción de indol + Prueba de rojo de metilo + Prueba de Voges- Proskauer Utilización de citrato Método de enumeración con la tabla del número más probable Utilizar la tabla del apéndice Y. Ejemplo. Usando una muestra sólida y tres tubos, en el 9% de los casos, los límites de confianza varían de a Escherichia coli presuntiva por gramo por un NMP de 7, x Escherichia coli presuntiva por gramo, y de a 99 Escherichia coli presuntiva por gramo de un NMP de, X Escherichia coli presuntiva por gramo. -xx 8 de

10 NTE INEN 9-8 APÉNDICE Y Tabla Y. Valores de NMP por gramo de muestra y límites del intervalo de confianza al 9% (tres tubos) (cuando se utilizan tres porciones de análisis de g, tres de, g y tres de, g) Número de resultados positivos por volumen de inóculo, ml o g MPN /ml o /g log M Desviació n estándar de logm Límites de confianza al 9%,,, Inferior Superior Índice de anomalí a Categorí a de anomalía NA a NA a,,,,,,,,9,6,,,,7,,7,,,7,,,7,,,8,,,,6,6,,7,,9,,,,,,,6,6,,8,,,7,7,,,,,,,69 6,,,,,,7 6,,7,,6,, 9,7,,8,9,,9 6,8,,6,,9 9, 7,,87,,9,,,6,6 7, 9,,97,,,,,7,,,, 7, 6,7,,,6, 6,7, 9,6,,, 8, a NA a NA a 6, No disponible. -xx 9 de

11 NTE INEN 9-8 Tabla Y. Valores de NMP por gramo de muestra (cinco tubos) (Cuando se utilizan cinco porciones de análisis de g, cinco de, g y cinco de, g) Número de resultados positivos Índice MPN <,8,8,8,6,7,,6,,,6,,6,8,6,8,8,,,,68,9,68,9 Categoría a cuando el número de muestras por lote examinado es Límites de confianza 9 % 9 % 99 % 99 %,,,,7,7,7,7,,7,7,7,7,,8,,,,,8,8,,9,,6,6,6,99,99,,,99,,,,,,,,,,,,,,7,,,,,,,9,9,,,9,,9,,9,,,,,,9,,,,9,9,9,,,,,,,,,,8,,8,8,8,8,,,8,,8 -xx de

12 NTE INEN 9-8 -xx de Tabla Y. (continuación) Número de resultados positivos Índice MPN Categoría a cuando el número de muestras por lote examinado es Límites de confianza 9 % 9 % 99 % 99 %,,9,,,,,,78,,,,,7,,7,,7,,,,,,,7,,,7,,6,,,6,,8,7,,,,,6,,6,6,,,6,,6,6,6,7,7,7,7,,7,,,,,7,,6,7,,,7,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,9,9,9,9,,,,9,9,,8,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,7,,7,7,,,,7,,,7,7,,7,7,9,7,7,9,,8,,,,,,8,9,,,,,,,,, 9,, 9, 9,,,, 9,,, 9, 9, 6, 9, 9,,7 9, 9,,7

13 NTE INEN 9-8 Número de resultados positivos Índice MPN,,,7,,8,,,,8,,6 6, 8,,9 7, 9, 7, Tabla Y. (continuación) Categoría a cuando el número de muestras por lote examinado es Límites de confianza 9 % 9 % 99 % 99 % 9 8 NOTE Los resultados son basados en DE MAN, J.C. MPN tables, corrected. Eur. J. Appl. Biotechnol., 98, 7, pp a P a r a u n a e x p l i c a c i ó n d e l a s c a t e g o r í a s v e r I S O 7 8,,,,,,7,,,,,,,,,, 6, ,,,,,,,9,,,9,,9 6,8,, ,9,9,9,9,9,,7,9,,7,9,,,9,,, ,7,7,7,7,7 9, 9,,7,,7,7, 7,,, 8, 7, xx de

14 APÉNDICE Z BIBLIOGRAFÍA ISO 7. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli. Most probable number technique NTE INEN ISO 8. Control microbiológico de los alimentos. Determinación de microorganismos coliformes por la técnica del número más probable ISO 78. Microbiology of food and animal feeding stuffs. General requirements and guidance for microbiological examinations -xx de

15 Documento: NTE INEN 9-8 ORIGINAL: Fecha de iniciación del estudio: Fechas de consulta pública: INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA TÍTULO: CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. DETECCIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI PRESUNTIVA POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE Código: ICS 7.. REVISIÓN: La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma Oficialización con el Carácter de por Resolución No. publicado en el Registro Oficial No. Fecha de iniciación del estudio: -- Subcomité Técnico de: Fecha de iniciación: Integrantes del Subcomité: NOMBRES: Fecha de aprobación: INSTITUCIÓN REPRESENTADA: Otros trámites: Esta NTE INEN 9-8:, reemplaza a la NTE INEN 9-8: La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma Oficializada como: Por Resolución No. Registro Oficial No.

16 Servicio Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-9 y Av. 6 de Diciembre Casilla Telfs: (9 ) 88 al 89 - Fax: (9 ) 678 Dirección Ejecutiva: direccion@inen.gob.ec Dirección de Normalización: normalizacion@inen.gob.ec Regional Guayas: inenguayas@inen.gob.ec Regional Azuay: inencuenca@inen.gob.ec Regional Chimborazo: inenriobamba@inen.gob.ec URL:

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