DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA (BVDV)

Transcripción

1 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA (BVDV) Debido a los distintos cuadros que puede originar el BVDV el diagnóstico clínico es complicado. En función de los síntomas observados (enfermedad respiratoria, digestiva, abortos, infertilidad, etc.) se remitirán las muestras más apropiadas al laboratorio para su análisis. Existe una amplia bacteria de pruebas de laboratorio para el diagnóstico del BVD. Mediante ellas, es posible detectar la presencia del virus o de su genoma, de determinados antígenos o de los anticuerpos específicos que origina. Aunque en general son técnicas que poseen un buen rendimiento, los cuadros agudos o de fallo reproductivo son los más difíciles de diagnosticar. Técnicas para la detección del virus - Inmunofluorescencia (directa e indirecta) e inmunohistoquímica: Son técnicas que emplean anticuerpos específicos poli- o monoclonales para la detección del virus en improntas o secciones de tejidos. Si la muestra contiene virus BVD, los anticuerpos se unen al mismo y son puestos de manifiesto mediante un sustrato que origina color o fluorescencia. Son técnicas laboriosas con una sensibilidad y especificidad entre baja y moderada. - Aislamiento vírico en cultivo celular: El aislamiento en cultivo celular se considera la prueba gold-standard para el diagnóstico directo. Es una técnica laboriosa y cara, restringida a laboratorios especializados o de investigación. Requiere el mantenimiento de líneas celulares que permitan la multiplicación del BVDV. Debido a que la mayor parte de las cepas de este virus son no citopáticas (no alteran el tapiz celular), para confirmar su presencia es necesario realizar una tinción con anticuerpos específicos (inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa). Mediante el cultivo celular es posible analizar muestras de tejidos, exudados, semen, células sanguíneas, etc. Es la prueba prescrita por la Organización Mundial de 1

2 Sanidad Animal (OIE) para el comercio internacional. Su sensibilidad y especificidad es muy elevada, siempre que se siga un control estricto de las líneas celulares y de los lotes de suero fetal bovino, que garantice que están libres de BVDV y de anticuerpos frente al mismo. - ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): El ELISA antigénico es una buena técnica que permite, a un coste asumible, analizar un gran número de muestras. En consecuencia, se emplea como prueba de rutina para la detección de animales persistentemente infectados (PI) en programas de control de BVD. No es una técnica adecuada para el diagnóstico de infecciones agudas debido a su baja sensibilidad. Mediante el ELISA antigénico es posible analizar muestras de suero y plasma sanguíneo, sangre completa, cartílago auricular (ilustración 1), y otros tejidos y fluidos. Inicialmente se desarrollaron kits comerciales que detectaban las proteínas no estructurales NS2-3. Más recientemente se han comercializado kits que detectan antígenos de la envuelta (E rns ), los cuales se ven menos afectados por las interferencias con los anticuerpos calostrales. Ilustración 1.Toma de muestra del cartílago auricular. En el caso de los terneros recién nacidos, se recomienda el análisis de muestras de sangre (EDTA) precalostrales mediante ELISA o, en su defecto, de cartílago auricular (ilustración 1) para evitar la presencia de anticuerpos maternales que bloqueen el virus e impidan su detección. Autores alemanes estiman que no existe interferencia cuando se analiza cartílago auricular mediante ELISA antigénico (E rns ), o sangre (EDTA) mediante RT-PCR. Sin embargo, señalan que la interferencia de los anticuerpos calostrales cuando se emplea el análisis de sangre mediante ELISA llegaría hasta los 40 días de vida. Con todo, es una técnica de elevada sensibilidad y especificidad para la detección de animales PI. 2

3 - RT-PCR: La introducción de las técnicas moleculares ha supuesto un gran avance en el diagnóstico del BVD. Son técnicas rápidas y de elevada sensibilidad y especificidad. Las contaminaciones son su principal caballo de batalla, por lo que una buena técnica de trabajo es fundamental. La automatización de la fase de extracción permite analizar un elevado número de muestras al tiempo. Existen diferentes protocolos publicados. Alguno permite incluso diferenciar entre los tipos 1 y 2 del BVDV (ilustración 2). Mediante la RT-PCR es posible analizar muestras de tejidos, fluidos, semen, heces, células sanguíneas, sangre completa, etc. En el caso de los fetos, la autolisis de los tejidos puede alterar el ARN vírico y originar resultados falsamente negativos. Debido a la elevada sensibilidad de esta técnica, es posible el análisis en mezclas de muestras de sangre, cartílago auricular y de la leche del tanque, de una forma más económica. BVDV-1a BVDV-2 BVDV-1b Ilustración 2. RT-PCR que diferencia los tipos de BVDV. Técnicas para la detección de anticuerpos En el caso de la infección por el BVDV el análisis serológico puede tener diferentes objetivos: a.- Detectar un animal PI en la explotación. El estatus serológico de un grupo de animales (p. ej. novillas) puede servir para predecir la presencia de un animal PI en el grupo. Seroprevalencias elevadas (>70%) son indicativas de la presencia de un animal PI. 3

4 b.- Realizar un seguimiento en leche del tanque. Del mismo modo, cuando se analiza la leche del tanque, valores altos en el ELISA pueden servir para predecir la presencia de animales PI en el grupo en lactación. Ejemplos de monitorización en tanque de leche *Se debe observar que lo resultados de ELISA frente a p80 son ELISAs de bloqueo. Los resultados se proporcionan en % de inhibición. Así, cuanto mayor sea este menor es el nivel de anticuerpos de la muestra y viceversa. Explotaciones sin infección activa, que mantiene este status y no emplean vacunas (línea roja): los niveles de anticuerpos se van reduciendo (el % de inhibición aumenta) conforme pasa el tiempo. Donde había infecciones antiguas, los seropositivos de irán eliminando paulatinamente con el desvieje propio de la granja y reponiéndose con animales seronegativos. Explotaciones sin infección activa, que mantiene este status y no emplean vacunas inactivadas (línea azul): los niveles de anticuerpos tienden a incrementarse cuando la vacuna se aplica a largo plazo, pero no de forma acusada. Esto es debido a que, como se dijo, incluso las vacunas inactivadas pueden contener ciertas cantidades de la proteína p80. 4

5 Explotaciones que se infectan activamente (línea verde): explotaciones libres o con infecciones antiguas y bajos niveles de anticuerpos pero que se infectan. Tras la entrada del virus en la granja, los animales normalmente se contagian rápido, desarrollan anticuerpos y estos se incrementan de forma marcada en el tanque de leche (descenso acusado en el porcentaje de inhibición). Esta situación se puede diferenciar claramente de la anterior donde había un pequeño incremento de los niveles de anticuerpos por vacunación. Una vez eliminadas los animales PI, no habrá generación contagios y generación de anticuerpos en los nuevos animales nacidos e incorporados paulatinamente al grupo de lactación y los niveles de anticuerpos en tanque irán reduciéndose de forma lenta (reflejado como incremento del % de inhibición). c.- Conocer el estatus inmunitario de una explotación. Tras la aplicación de una vacuna frente al BVDV puede ser interesante conocer el grado de respuesta humoral. d.- Investigar casos de fallo reproductivo y de aborto. Un perfil serológico de animales con y sin problemas o por grupos edad puede ayudar a descartar la infección por el BVDV como causa del proceso en cuestión. En función de la seroprevalencia y de los grupos de edad con mayor positividad, es posible deducir la entrada o no del virus, la posible presencia de animales PI e, incluso, el tiempo que pueden llevar en la explotación (ver gráficos). 5

6 La vacunación frente a la BVD, especialmente con vacunas vivas, dificulta la interpretación de los resultados serológicos. e.- Investigar el estatus serológico y virológico de nuevas incorporaciones. Es conveniente conocer el estatus sanitario de los animales a incorporar en lo que respecta al BVDV y a otras enfermedades. En el caso de novillas seropositivas gestantes, deberemos extremar las precauciones. El ternero que gestan puede ser un animal PI. Otra circunstancia especial es el caso de los sementales. Los toros seropositivos deberían ser analizados en semen (RT-PCR o cultivo celular) para descartar una infección persistente a nivel testicular. En este caso, el toro sería virus negativo en sangre y virus positivo en semen. Las principales técnicas serológicas para el diagnóstico de la BVD son: - Sueroneutralización (SN): La SN es la gold-standard de las técnicas serológicas. Durante muchos años fue la técnica más empleada en los laboratorios de diagnóstico, hasta la introducción del ELISA. Al igual que el cultivo celular, su uso se ha restringido a laboratorios especializados. Requiere el mantenimiento de una línea celular. Se enfrenta una cepa 6

7 estandarizada del virus (preferiblemente local) a diluciones seriadas del suero problema, lo que permite realizar una titulación de los anticuerpos eventualmente presentes. Posee una moderada-elevada sensibilidad y una alta especificidad. Mediante esta técnica se analizan muestras de suero sanguíneo. Es conveniente tener en cuenta que si se emplean determinadas cepas del BVDV-1 podemos no detectar anticuerpos frente al tipo 2. - ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): El ELISA es la técnica que más se emplea en la actualidad para el diagnóstico de la infección por el BVDV. Existen diferentes versiones, incluso kits comerciales; los más utilizados son los siguientes: - ELISA indirecto (anticuerpos totales): Permite la detección de los anticuerpos dirigidos frente a los antígenos inmunodominantes del virus. Como antígeno se emplea el virus completo. Los animales vacunados con vacunas atenuadas e inactivadas producen anticuerpos que son detectados mediante este ELISA. Con esta técnica es posible analizar muestras de suero sanguíneo y de suero lácteo, tanto de leches individuales como del tanque. Por lo tanto es una buena técnica para monitorizar explotaciones libres de BVD. - ELISA de bloqueo (anticuerpos anti p80 -NS3-): Permite la detección de los anticuerpos dirigidos frente a la proteína no estructural p80 (NS3) del BVDV. En general los animales vacunados con vacunas inactivadas no producen anticuerpos que sean detectables mediante este ELISA. Por el contrario, los animales infectados naturalmente o vacunados con vacunas vivas desarrollan anticuerpos anti p80, por lo que resultan positivos en este ELISA. 7

8 Mediante esta técnica es posible analizar muestras de suero sanguíneo y de suero lácteo. En el caso de la leche del tanque el ELISA de bloqueo es una buena técnica para monitorizar explotaciones libres de BVD, aunque posee una menor sensibilidad que el ELISA indirecto. Aproximación práctica al diagnóstico de laboratorio y comparación de técnicas En función de los síntomas compatibles con BVD observados, las muestras a tomar y las técnicas de laboratorio a emplear serían las siguientes: Infección aguda - Síntomas: digestivos y respiratorios; fiebre y leucopenia. Poca carga vírica - Muestras: sueros pareados (21 días); sangre (EDTA); vísceras - Técnicas: RT-PCR (tejidos y sangre); ELISA p80 (anticuerpos) Infertilidad y abortos (con o sin malformaciones fetales) - Síntomas: baja fertilidad, abortos tiempo gestación variable - Muestras: hisopos uterinos, feto y placenta, suero y sangre vacas problemáticas; suero de animales sin problemas - Técnicas: RT-PCR (hisopos y vísceras); ELISA p80 (anticuerpos); ELISA antigénico Infección persistente - Síntomas: inaparentes o escaso desarrollo - Muestras: sangre (EDTA) >40 días de edad; cartílago auricular < 40 días de edad - Técnicas: ELISA antigénico Enfermedad de las mucosas - Síntomas: fiebre, inflamación mucosas, diarrea - Muestras: sangre (EDTA), tejidos - Técnicas: ELISA antigénico y cultivo celular (cepas citopáticas y no citopáticas) 8

9 La variedad de técnicas disponibles hace necesario conocer cuáles son las más adecuadas para cada objetivo y situación epidemiológica. En el siguiente cuadro se recogen las que nos podemos encontrar con mayor frecuencia. 9