Taller Pruebas de Susceptibilidad a los antifúngicos

Transcripción

1 Taller Pruebas de Susceptibilidad a los antifúngicos ngicos Susana CórdobaC Departamento Micología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS. Dr. Carlos G. Malbrán Buenos Aires. Argentina 2009

2 Seguimos Microdilución M27-A3, CLSI E. Def 7.1, EUCAST M38-A2, CLSI Método de difusión Tabletas Discos E-test Ventajas e inconvenientes

3 Levaduras: Detección de la Resistencia C I M CLSI : M27-A3: Levaduras Macro y microdilución EUCAST E. Def 7.1 : E-TEST Levaduras fermentadoras Microdilución TABLETAS: Neo Sensitabs- Rosco DISCOS DE PAPEL: M44-A CLSI DISCOS DE PAPEL: Fluconazol Malbrán A G A R

4 M27-A, CLSI Método: Macrodilución y microdilución Medio: RPMI 1640, ph 7 Inóculo: 0,5-2,5 x 10 3 UFC/mL Incubación: 35º C durante 48 y 72 h Determinación de la CIM: visual Control de calidad: Candida krusei ATCC 6258 Candida parapsilosis ATCC 22019

5 M27-A. Microdilución Macro y microdilución: equivalentes Diluciones similares Inóculo final: 0,5-2,5 x 10 3 UFC/mL Placas estériles con fondo en U Almacenar a -70ºC Caducidad > 6 meses

6 M27-A. Preparación del inóculo Sabouraud Incubación 35º-37ºC 24 h Candida spp. 48 h C. neoformans Sabouraud 3-5 colonias 1 mm en 5 ml de agua destilada estéril Ajustar a la DO a 0,5 McFarland, 530 nm 1-5 x 10 6 UFC/mL

7 M27-A. Inoculación de la microplaca 1-5 x 10 6 CFU/mL 1-5 x 10 3 CFU/mL 1: µl inóculo (2X) 1-5 x 10 3 UFC/mL? células /200 µl ,06 CC CE 100 µl RPMI + antifúngico (2X) 100 µl RPMI 200 µl RPMI

8 M27-A. Incubación 35ºC Candida spp. : 48/24 horas Cryptococcus neoformans : 72 horas

9 M27-A. Lectura de resultados La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente

10 E. Def 71, EUCAST Por qué leer con un espectrofotómetro?

11 Lectura visual CC CE 4 0

12 Lectura visual CIM Ligeramente turbio CC CE ? 3? 4 0 Ligera disminución de la turbidez

13 Lectura con espectrofotómetro Optical Density % 50% MIC GC i

14 Placas de fondo redondo Densidad óptica

15 Placas de fondo plano Densidad óptica real

16 Preparación de las placas H 2 0 DE + Medio 100 µl RPMI + Antifúngico ngico Control Crecimiento Blanco

17 Preparación del inóculo Subcultivo en SAB h, C 5 colonias aisladas 1 mm diámetro en 5 ml, ADE Mezclar Diluir con agua para conseguir una DO de 0,15 a 530 nm ~ 1-5 x 10 6 UFC/mL Diluir 1: 10 en agua ~ 1-5 x 10 5 UFC/mL Dispensar 100 µl por pocillo ~ 0,5-2,5 x 10 5 UFC/mL

18 Inoculación de las placas 100 µl inóculo + H 2 0 DE + Medio 100 µl RPMI + Antifúngico ngico Control Crecimiento Blanco

19 Incubación Aire normal C Estáticas Selladas o sin sellar - no hay preferencia Cámara húmeda o no - no hay preferencia 24 h

20 Lectura Espectrofotómetro a 530 nm (405 o 450 nm ) Restar el blanco (columna 12) del resto de pocillos La DO del CC debe estar por encima de 0.5 Si no creció a 0.5, reincubar otras 24 h. CIM para azoles, 5FC y equinocandinas, es la inhibición del 50% comparada con el control de crecimiento

21 Fluconazol. Puntos de corte. S I R DIN < 4 8 >16 NWGA < >32

22 Fluconazol. Puntos de corte. Susceptible Intermedio Resistente < 2 mg/l EUCAST 4 mg/l > 4 mg/l Aplicable a C. albicans, C. parapsilosis y C. tropicalis Pero no se aplica a C. krusei, insensible a fluconazol C. glabrata, ya que parece ser intermedio

23 Diferencias entre M27-A y E. Def 7.1 Cryptococcus Anfotericina B Glucosa Forma del pocillo Inóculo (UFC/mL) Incubación n (h) Lectura IM M27-A, CLSI incluido incluido 0,2 % Fondo redondo 0,5 2,5 x visual Más s baja concentración n que inhibe sustancialmente el crecimiento E. Def 7.1 EUCAST-AFST AFST excluido excluido 2% Fondo plano 0,5 2,5 x espectrofotómetr metro Más s baja concentración n que inhibe el crecimiento al menos un 50%

24 EUCAST Por qué no se incluye Cryptococcus neoformans? Bases del estándar para levaduras no fermentadoras

25 Influencia de la agitación en el crecimiento y la sensibilidad a los antifúngicos de C. neoformans Rodríguez-Tudela, J.L., Rodero L, et al AAC 35 Cryptococcus neoformans M27A y AM3 para la AB: 10 3 CFU/mL BYNB (Ghannoum et al JCM): 10 4 CFU/mL RPMI 2% glucosa: 10 5 CFU/mL 35 0 C, 48 horas Placas de microdilución: estáticas y agitadas

26 Curvas de crecimiento de 16 C. neoformans RPMI Agitado 0.30 DO RPMI 2% G Estático tico Horas

27 Por qué se excluyó Cryptococcus neoformans? El procedimiento para ensayar la sensibilidad de Cryptococcus neoformans tiene que fijar las siguientes variables: Agitar: Si? No? RPMI, YNB u otro medio? Inóculo: 10 5 CFU/mL?? Incubación a 35 0 C o 30 0 C Lectura espectrofotométrica Inhibición del 50% para la CIM

28 DO 540 de C. neoformans CCLS PMI 2%G Shaken Static CN ATCC CN ATCC CN CN n Mean SD Range CI 95% n Mean SD Range CI 95%

29 DO 540 de C. neoformans AM3 BYNB Shaken Static CN ATCC CN ATCC CN CN n Mean SD Range CI 95% n Mean SD Range CI 95%

30 Comentarios Se está desarrollando un estándar europeo CLSI lo ve resuelto Es evidente que para las levaduras no fermentadoras se necesita desarrollar de un estándar diferente

31 Métodos para estudios de susceptibilidad en hongos miceliales

32 Pruebas de susceptibilidad para hongos miceliales (microdilución) CLSI Estado actual EUCAST 1991, 1995, 1997 Espinel-Ingroff, Preparación del inóculo; Bases para macro y microdilución Difusi 1998, M38-P, (propuesto) 2002, M38-A, Estándar aprobado 2008 Estándar aprobado 2da edición M38-A Documento M51-P Difusión en agar!!!! 2006 E. Dis E. Def 9.1

33 Pruebas de susceptibilidad para hongos miceliales ANTIFÚNGICOS ANFOTERICINA B 5-FLUOROCITOSINA EQUINOCANDINAS CICLOPIROX GRISEOFULVINA TERBINAFINA FLUCONAZOL ITRACONAZOL KETOCONAZOL POSACONAZOLE RAVUCONAZOLE VORICONAZOLE

34 Intervalo de concentraciones Debe incluir los puntos críticos de cada antimicrobiano Debe incluir las CIMs de las cepas de control de calidad Antifúngico Intervalo (ug/ml) Anfotericina B 16-0,0313 Fluorocitosina 64-0,125 Ketoconazol 16-0,0313 Fluconazol 64-0,125 Itraconazol 16-0,0313 Voriconazol 16-0,0313 Ravuconazol 16-0,0313 Posaconazol 16-0,0313 Caspofungina 16-0,0313 Anidulafungina 16-0,0313

35 Pruebas de susceptibilidad para hongos miceliales MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640 L-glutamina + 0,165 M MOPS

36 M38-A2 Preparación del inóculo No-dermatofitos 1 ml 0,85% Sol. salina estéril 3-5 ml sol. Sal. estéril

37 Ajuste de inóculo (530 nm) Especie Densidad óptica Aspergillus spp., Paecilomyces lilacinus, P. variotti Exophiala dermatitidis, Sporothrix schenckii 0,09-0,13 Fusarium spp., S. apiospermum, Ochroconis gallopava, Cladosporium bantiana, R. oryzae y otros Zygomycetes 0,15-0,17 Bipolaris spp., Alternaria spp. 0,25-0,3 Con estos valores se obtienen valores de inóculo: 10 6 UFC/mL 1:50 0,4-5 x10 4 UFC/mL

38 Preparación del inóculo Dermatofitos: 10 3 esporas/ml en hematocitómetro

39 Control del inóculo inóculo 1:10 10 µl Incubar a 28-30ºC / 24 h 7 días

40 Inoculación de la placa Inóculo (2X) con/sin Azul de Alamar 100 µl ,5 0,25 0,12 0, ,5 0,25 0, µl RPMI + antifúngico (2X) CC CE

41 Determinación de la CIM Lectura VISUAL Las placas se colocan en un espejo para lectura de placas de microdilución

42 EUCAST AFST E. Def 9.1 (EUCAST) para miceliales

43 Composición y tamaño del inóculo Fusarium spp. Macroconidios de 11 a 80 µm Microconidios de 4 a 8 µm Esporas Aspergillus spp. e Conidios de 2-7 µm hifas mezcladas

44 Preparación del inóculo 4-5 ml de Agua destilada APD; 35ºC Viernes al Lunes 1 2 3

45 Preparación del inóculo

46 Preparación del inóculo Filtro 11 µm

47 Diferencias entre CLSI M38-A & E. Def 9.1 CLSI M38-A2 EUCAST E. Def 9.1 Glucosa 10 veces más! 0,2 % 2% Forma del pocillo Inóculo (preparación) 10 veces superior! Más exacto! Inóculo (UFC/mL) Fondo redondo Espectro 1-8 x 10 4 Fondo plano Cámara Neubauer 1 2,5 x 10 5 Lectura CIM Visual Mas baja concentración que inhibe el crecimiento

48 Puntos de corte Todavía a no están n establecidos. No hay consenso de correlación n clínica. Hay propuestas de puntos para análisis con ITZ, POSA, VCZ, AMB y CASPO. Hay que ver la distribución n de CIMs de distintos fármacos f x especies.

49 Métodos comerciales Cualitativos Tabletas Discos AB 5FC Difusión en agar KZ FZ IZ Colorimétricos Sensititre Cuantitativos. CIM E-test NO SON DE REFERENCIA AB 32 0,002

50 Difusión en medio sólido Propiedades del agar No es afectado por el crecimiento del microorganismo Composición variable por ser un producto natural

51 Concentración del antifúngico en el reservorio La difusión del antifúngico es proporcional a la concentración del mismo en el reservorio, a mayor concentración, mayor distancia de difusión El proceso de difusión depende del antimicrobiano y de la naturaleza del agar partamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán SBC, 2009

52 Características de la zona limítrofe Inhibición parcial Inhibición completa

53 Pruebas de difusión Factores determinantes Tamaño del inóculo Tiempo de difusión del antimicrobiano Tiempo de desarrollo de la masa celular crítica

54 Pruebas de difusión Factores determinantes Velocidad de crecimiento Microorganismos de crecimiento lento Dilución en caldo

55 Pruebas de difusión Factores determinantes 20 ml de medio 9 cm 60 ml de medio 15 cm

56 Pruebas de difusión Factores determinantes Profundidad del medio de cultivo 4 mm

57 Siembra de las placas Siembra con hisopo Siembra por inundación

58 Colocación de los discos 20mm 40 mm

59 Pruebas de difusión Factores determinantes Incubación

60 Lecturas de las zonas de inhibición Lectura manual Lectura automatizada

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62 Primero determinar la mejor zona de lectura, tomando una diagonal que corte al disco por su centro Segundo, determinar el halo de inhibición, teniendo en cuenta que corresponde a la zona donde comienza a disminuir el crecimiento de las colonias. Tercero marcar los puntos que corresponden al diámetro y medirlo La zona de crecimiento irregular (teniendo en cuenta la cantidad y el tamaño de las colonias), no se considera como resistencia

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64 C. krusei RESISTENTE CIM FCZ 32 ug/ml Mueller Hinton con azul de metileno 50 ug Halo= 17 mm Halo= 8 mm 25 ug

65 Tabletas Neo-Sensitabs Levaduras Itraconazol Fluconazol Itraconazol Fluconazol Anfotericina B

66 E-test Itraconazol Itraconazol

67 E-test Fluconazol. Anfotericina B Fluconazol. Anfotericina B

68 Métodos de difusión Ventajas Simples de realizar y resultados rápidos. Inconvenientes Subjetividad en la lectura de los halos Subjetividad de la lectura visual de la CIM Lectura a 24 o 48 horas según las especies No todas las especies crecen bien en agar RPMI 2% G Identificar el inóculo Carga de antifúngico apropiada Reproducibilidad intra e interlaboratorio a gran escala

69 UN DESCANSO..