Efecto del espesor y del ph del agar Mueller-Hinton en el antibiograma

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1 Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69 Efecto del espesor y del ph del agar Mueller-Hinton en el antibiograma Effect of Mueller-Hinton agar thickness and ph in the antibiogram Esteban B. Riera 1 Gustavo Chamorro 1 Miriam Noemí Zárate 1 Miryan Falcón 1 Rosana Franco 1 1 Departamento de Bacteriología Referencial, Laboratorio Central de Salud Pública, Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social, Asunción, Paraguay. Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69 Resumen Se determinó el efecto del ph y espesor del agar Mueller-Hinton (AMH) en los diámetros de los halos de inhibición para determinar si los cambios en uno o ambos elementos afecta la interpretación del antibiograma. El efecto del espesor del agar se ensayó con cepas de Staphylococcus aureus ATCC frente a oxacilina, vancomicina, trimetoprima-sulfametoxazol, tetraciclina, gentamicina y eritromicina; Escherichia coli OPS 101 frente a ciprofloxacina, imipenem, gentamicina y cefotaxima, y Pseudomonas aeruginosa ATCC frente a ciprofloxacina, piperacilina, gentamicina y ceftazidima. Para medir el efecto del ph, se ensayó también cefoxitina con cepas de S. aureus ATCC Se encontró que el ph del agar afecta los halos de inhibición según el antibiótico de que se trate, dando halos más grandes que lo establecido por las normas para gentamicina, ciprofloxacina y eritromicina con un ph alcalino y más pequeños con un ph ácido. Por otra parte, el halo para piperacilina y cefoxitina fue más grande con ph ácido y más pequeño con ph alcalino. No se vieron afectados los diámetros del halo de inhibición de vancomicina, trimetoprima-sulfametoxazol, imipenem, cefotaxima, ceftazidima y piperacilina. La temperatura adecuada para medir el ph del AMH fue de 25 C ± 3 C. La variación del ph del agar no afectó la interpretación del antibiograma en las cepas estudiadas, excepto en el caso de la combinación E. coli OPS 101 con gentamicina a un ph de 5,97 y 6,52, que dio un resultado falso resistente. El espesor afectó por igual a todos los antimicrobianos ensayados, generando halos más pequeños con un agar Mueller-Hinton de más de 4 mm de espesor, y halos más grandes cuando el agar tenía menos de 4 mm. La variación del espesor del agar no afectó la interpretación del antibiograma de las cepas estudiadas, excepto cuando se ensayaron cepas de E. coli OPS 101 frente a cefotaxima, en que se obtuvo un resultado falso sensible con un agar de 2,1 mm. Palabras clave: Antibióticos, antimicrobianos, pruebas de laboratorio. Abstract The effect of Mueller-Hinton agar (MHA) thickness and ph on the diameter of the zone of inhibition was studied to determine whether changes in one or both elements affect interpretation of antibiotic sensitivity profiles. The study considered the effect of agar thickness on the resistance of Staphylococcus aureus strain ATCC to oxacillin, vancomycin, trimethoprim-sulfametho- 64

2 Riera EB, et al Efecto del espesor y del ph del agar... xazole, tetracycline, gentamicin, and erythromycin; of Escherichia coli OPS 101 to ciprofloxacin, imipenem, gentamicin and cefotaxime; and of Pseudomonas aeruginosa ATCC to ciprofloxacin, piperacillin, gentamicin and ceftazidime. In order to measure the effect of ph, cefoxitin was also tested with S. aureus strain ATCC It was found that the effect of agar ph on the zone of inhibition varies with the antibiotic. With alkaline ph, the zones of inhibition were larger than those established by the standards for gentamicin, ciprofloxacin, and erythromycin. Smaller zones of inhibition were found with acidic ph. In addition, the zone of inhibition for piperacillin and cefoxitin was larger with acidic ph and smaller with alkaline ph. The diameter of the zone of inhibition for vancomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, imipenem, cefotaxime, ceftazidime, and piperacillin was not affected. The appropriate temperature for measuring the ph of MHA is 25 C ± 3ºC. The variations in agar ph did not affect interpretation of the antibiotic sensitivity profile studied, except in the case of strain E. coli OPS 101 with gentamicin combination at a ph of , which recorded a false resistant result. All of the antimicrobial drugs tested were equally affected by agar thickness. Smaller zones of inhibition were produced with Mueller-Hinton agar thickness of more than 4 mm, and larger zones of inhibition were detected when agar thickness was less than 4 mm. The variations in agar thickness did not affect interpretation of the antibiotic sensitivity profile for the strains studied, with the exception of the resistance of strains of E. coli OPS 101 to cefotaxime. In this case, a false sensitive result was obtained with 2.1 mm agar. Key words: Kirby-Bauer, antibiotics, antimicrobials, laboratory testing Introducción La prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de difusión por disco (antibiograma de Kirby-Bauer) es actualmente de rutina y ampliamente usada en el laboratorio de bacteriología. Los microbiólogos la han utilizado por casi siete décadas, (1,2,3,4) e incluso ha sido adoptada por redes de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos nacionales e internacionales. (5) Uno de los aportes más significativos a la bacteriología clínica fue realizado por Bauer, Kirby, Sherrys y Turck (3) al desarrollar una técnica de difusión con discos de una sola carga por antibiótico, que puede interpretarse cuantitativamente. La técnica, comúnmente denominada prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos por disco de Kirby Bauer (KB), tiene por finalidad correlacionar el diámetro del halo de inhibición con la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico determinado en una infección clínica. En 1971, se realizó un estudio colaborativo para estudiar los factores que influyen en la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por disco, (3) como son el tipo de agar que se debe utilizar, la carga de los discos, el tiempo y la temperatura de incubación, el espesor y ph del agar, el inóculo bacteriano y el modo de lectura del halo de inhibición. El método fue adoptado por el entonces llamado Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (National Committee on Clinical Laboratory Standards, NCCLS). (6) Muchos laboratorios de análisis bacteriológico de América Latina preparan sus propias placas de agar Mueller-Hinton a partir de polvo comercial. El fabricante del medio de cultivo es responsable de que el medio esté libre de timina/timidina y tenga el número adecuado de cationes (calcio, magnesio, zinc), pero el laboratorio de microbiología debe cerciorarse de que así sea. En el laboratorio también se debe controlar el ph y espesor del agar en las placas de cada lote que se prepare. Estos medios no siempre reúnen los requerimientos de calidad para el antibiograma, sobre todo en lo que respecta al ph y al espesor del agar en las placas, aunque en varios estudios se ha demostrado que esos elementos afectan el diámetro del halo de inhibición. (1) El CLSI, que ha establecido los estándares de desempeño de la prueba de Kirby-Bauer, (7) fijó un rango de 7,2 a 7,4 para el ph del agar, medido a temperatura ambiente y después de su solidificación. El espesor del agar en las placas de Petri debe ser de 4 mm, lo que se logra con un volumen de AMH de 60mL a 70 ml de medio para placas de 150 mm de diámetro, y de 25 ml a 30 ml para placas de mm de diámetro interno. El objetivo del presente trabajo es determinar si el ph y espesor del AMH afectan los resultados de la interpretación del antibiograma cuando sus valores están por fuera de los estandarizados. Materiales y método Medio: Para todo el estudio se utilizó un mismo lote de agar Mueller-Hinton de marca Oxoid, lote No , con fecha de vencimiento abril de Cepas de estudio: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC y Escherichia coli OPS 101. La cepa de E. coli OPS 101 es la que envía la Organización Panamericana de la Salud (OPS) a los laboratorios de referencia nacionales para la evaluación externa de calidad. Esta cepa tiene una betalactamasa tipo Amp C plasmídica (cefotaximasa). Discos: Se utilizaron discos de antimicrobianos de la marca Oxoid: oxacilina (1 µg), gentamicina (10 µg), eritromicina (15 µg), trimetoprima-sulfametoxazol (1,25/23,75 µg), tetraciclina (30 µg), vancomicina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), cefotaxima (30 µg), 65

3 Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69 imipenem (10 µg), piperacilina (100 µg), ceftazidima (30 µg), cefoxitina (30 µg). Preparación del agar Mueller-Hinton con diferentes valores de ph: Se prepararon placas de AMH con ph de 6,0 a 8,0. Las mediciones se realizaron con un potenciómetro Mettler Toledo modelo MP220, con un electrodo de superficie plana marca Mettler Toledo Modelo In Lab 426 y Sonda ATC de compensación automática de temperatura, modelo NTC 30Kv ( ), también de marca Mettler Toledo. Las mediciones se realizaron a 25 C para determinar el ph final del agar Mueller-Hinton. Efecto de la temperatura en la medición del ph del AMH: Teniendo en cuenta que hay laboratorios que preparan su propio AMH miden el ph cuando el medio está aún fundido (aproximadamente 40 C a 45 C) o a temperatura ambiente, se evaluó el efecto de la temperatura en la determinación del ph del agar. Con ese objeto se realizaron mediciones de ph a partir de 40 C (AMH fundido) con intervalos de 1,0 C, a medida que el medio se iba solidificando. Preparación del AMH con diferentes espesores: Para preparar el AMH en placas de Petri de 85 mm de diámetro interno, se colocaron los siguientes volúmenes de agar: 14,0 ml, 19,4 ml, 22,6 ml, 24,5 ml, 25,8 ml, 27,1 ml, 29,0 ml, 32,2 ml y 38,6 ml, obtenién dose espesores de 2,1 mm, 2,9 mm, 3,5 mm, 3,8 mm, 4,0 mm, 4,3 mm,4,6 mm, 5,2 mm, y 6,2 mm, respectivamente. Estos espesores son el promedio de 10 mediciones por placa. Para medir el espesor del AMH se utilizó un calibre con precisión de 0,1 mm y un micrómetro marca Peacock (de fabricación japonesa), con 0,01 mm de precisión. Método del antibiograma: Se utilizó el método propuesto por el CLSI. (8) Un día antes del experimento se aislaron las cepas de estudio en agar sangre, previamente incubadas durante 4 horas a 35 C. Se utilizó AMH de diferente espesor y ph, a fin de medir el efecto de los cambios en esas variables. Se colocaron hasta seis discos por placa y se incubaron a 35 C durante 16 a 18 horas. Cada antibiograma se realizó cinco veces distintas en las mismas condiciones. La lectura de los halos de inhibición fue realizada por dos o tres operadores, en consecuencia, los resultados son el promedio de lectura de 10 a 15 placas por dos o tres operadores diferentes. Para la interpretación de los antibiogramas se utilizaron las tablas del CLSI. (7) La experiencia del laboratorio indica que las diferencias en la lectura del diámetro del halo de inhibición por un solo operador son de ± 1 mm. Espesor del agar de Mueller-Hinton: Un mismo operador midió 10 veces cada espesor de agar diferente en una misma placa, utilizando calibre y micrómetro, no encontrándose diferencia estadísticamente significativa en las lecturas (P < 0,05). Sin embargo, la medición con micrómetro fue más precisa (coeficiente de variación [CV] = 2,43) que la realizada con calibre (CV = 3,32). El intervalo de confianza (I.C.) de 95% que se logró en la lectura con calibre y con micrómetro fue de ± 0,20 mm y ± 0,16 mm, respectivamente. Resultados Efecto de la temperatura en la medición del ph del AMH A medida que la temperatura del AMH disminuye, el ph aumenta. La figura 1 muestra que a 25ºC, el ph de este agar fue de 7,25. Sin embargo, a 28 C, el ph fue de 7,18, fuera del rango establecido por el CLSI (de 7,2 a 7,4). (7) El ph del AMH aun fundido (40 C) fue de 6,79. Por ejemplo, si a 40ºC se lleva el ph del agar a 7,3, cuando el agar esté a 25 C tendrá un ph alcalino, de aproximadamente 7,8, fuera del rango aceptable (datos no mostrados). La figura 1 muestra datos representativos de 10 ensayos. Efecto del ph del AMH en el halo de inhibición del antibiograma El tamaño del halo de inhibición en el antibiograma se ve afectado por el ph del agar, dependiendo del antibiótico ensayado (cuadros 1, 2 y 3). En este estudio, los antimicrobianos más afectados por el ph fueron oxacilina, cefoxitina, gentamicina y eritromicina cuando se ensayaron con cepas de S. aureus; gentamicina, cuando se ensayó con la cepa de E. coli, y gentamicina y ciprofloxacina, cuando el ensayo se hizo con cepas de P. aeruginosa. De estos antimicrobianos, oxacilina y cefoxitina son los que dieron un diámetro de halo de inhibición más grande con un ph < 7,3 cuando se ensayaron con cepas de S. aureus (véase el cuadro 1). A un ph < 7,3, las pruebas que dieron halos de inhibición más pequeños fueron las de gentamicina y eritromicina con S. aureus (cuadro 1); gentamicina con E. coli (cuadro 2) y gentamicina y ciprofloxacina con cepas de P. aeruginosa (cuadro 3). Con un ph > 7,3 se obtuvieron se obtuvieron diámetros del halo de inhibición más pequeños para oxacilina y cefoxitina frente a cepas de S. aureus, y más grandes para gentamicina y eritromicina frente a cepas de S. aureus (cuadro 1), gentamicina frente a cepas de E. coli (cuadro 2) y gentamicina y ciprofloxacina frente a las de P. aeruginosa (cuadro 3). Sin embargo, las variaciones del ph del AMH con respecto al ph estándar de 7,3 no afectaron los halos de inhibición de vancomicina y trimetoprima-sulfametoxazol cuando se ensayaron con la cepa de S. aureus; los de imipenem y cefotaxima con la cepa de E. coli y el de ceftazidima con la de P. aeruginosa. 66

4 Riera EB, et al Efecto del espesor y del ph del agar... Figura 1. Efecto de la temperatura en la medición del ph del agar Mueller-Hinton Efecto del ph del AMH en la interpretación del antibiograma: En el caso de las cepas de S. aureus se observaron diámetros del halo que estaban fuera del rango aceptable para oxacilina a ph de 7,13 y 8,11; cefoxitina a ph 6,30 y 6,61, y eritromicina a ph 6,30, 6,61 y 8,11 (cuadro 1). De los casos anteriores, los cambios de interpretación del antibiograma de oxacilina a ph de 7,13, cefoxitina a ph de 6,61 y eritromicina a ph de 6,61 estuvieron a menos de 1 mm del rango ATCC aceptable, o sea, dentro del error propio de lectura del antibiograma. Al usar AMH con ph diferentes del estándar (7,2 a 7,4), se produjeron cambios en la interpretación del antibiograma de las cepas de E. coli con gentamicina a ph 5,97 y 6,52 (sensible a resistente) (cuadro 2). La acción de Cuadro 1. Halos de inhibición e interpretación del antibiograma de la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, según el ph y espesor del agar Mueller-Hinton Tamaño del halo de inhibición (en mm)* ph del agar Mueller-Hinton Oxacilina (IC = 18-24) Vancomicina (IC = 17-21) Trimetoprimasulfametoxazol Cefoxitina (IC = 24-30) Gentamicina (IC = 19-27) Eritromicina (IC = 22-30) (IC = 24-32) 8,11 16,8 19,8 30,7 25,7 29,8 32,4 7,33 18,5 18,4 31,0 28,0 25,1 27,5 7,18 18,2 18,9 31,8 28,5 24,4 25,4 7,13 17,5 18,0 30,8 28,1 24,4 25,8 7,00 18,6 19,0 31,1 29,6 23,4 25,5 6,61 19,3 19,1 30,5 31,0 21,2 21,7 6,30 20,1 19,4 29,8 33,8 20,1 19,5 Espesor del agar Tamaño del halo de inhibición (en mm)* (en mm) Tetraciclina 6,2 17,3 19,5 31,8 29,8 25,7 26,8 5,2 18,2 19,2 33,8 31,0 24,5 27,1 4,6 19,6 19,8 36,3 33,1 25,4 29,1 4,3 19,7 19,5 37,5 32,0 25,4 28,6 4,0 18,5 19,7 32,0 30,0 25,5 27,9 3,8 20,1 19,9 35,6 31,6 26,6 30,1 3,5 20,1 19,8 36,2 31,6 25,5 29,2 2,9 20,5 20,5 38,0 34,2 27,3 29,8 2,1 23,4 21,9 38,0 33,8 28,7 31,0 *Excepto donde se indica lo contrario ( ), los halos de inhibición estuvieron dentro del rango; IC (Interpretación clínica). Para la interpretación clínica se usaron las tablas del CLSI. Todos los resultados fueron sensibles al antibiótico correspondiente. Rangos aceptables de halos para la cepa de Staphylococcus aureus ATCC e interpretación clínica según las tablas CLSI. (7) cefotaxima e imipenem en la cepa de E. coli no fue afectada por variaciones de ph en el rango estudiado, por lo que en su interpretación siempre coincidió con el diámetro del halo de las pruebas realizadas con el ph estándar. La variación del ph de 6,31 a 7,77 no afectó el diámetro del halo de inhibición de las cepas de P. aeruginosa con piperacilina ni ciprofloxacina (cuadro 3). Sin embargo, el diámetro resultante de la prueba de esas cepas con gentamicina a ph de 7,77 cayó fuera del rango por una diferencia de 0,7 mm; asimismo, con ceftazidima el diámetro resultante estuvo fuera del rango ATCC para ph entre 6,31 y 7,77 por hasta 1 mm, diferencia que está dentro de las variaciones propias del antibiograma. En ninguna circunstancia los cambios en el ph modificaron la interpretación clínica de los antimicrobianos ensayados con la cepa de P. aeruginosa. Efecto del espesor del AMH en el halo de inhibición del antibiograma Con cada espesor del AMH se realizaron cinco antibiogramas para cada una de las siguientes combinaciones de microorganismo y antibiótico: S. aureus y oxacilina, vancomicina, trimetoprima-sulfametoxazol, tetraciclina, gentamicina y eritromicina (cuadro 4); E. coli y ciprofloxacina, imipenem, gentamicina y cefotaxima (cuadro 5); y P. aeruginosa y ciprofloxacina, piperacilina, gentamicina y ceftazidima (cuadro 6). A medida que aumentó el espesor del AMH, disminuyeron los diámetros del halo de inhibición; inversamente, a menor espesor del AMH se observó una tendencia al aumento del tamaño del halo. Asimismo, se observó mayor variación en el diámetro del halo de inhibición cuando el agar de Mueller-Hinton tenía un espesor de menos de 4,0 mm. Esta asimetría es marcada al probar la cepa de S. aureus con gentamicina y vancomicina (cuadro 1), la de E. coli con ciprofloxacina, gentamicina y cefotaxima (cuadro 2) y la de P. aeruginosa con imipenem (cuadro 3). Efecto del espesor del AMH en la interpretación del antibiograma: Al ensayar oxacilina con la cepa de S. aureus con un espesor de agar de 6,2 mm, el diámetro del halo cayó fuera del rango ATCC, al igual que con vancomicina y un espesor de 67

5 Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69 Cuadro 2. Halos de inhibición e interpretación clínica del antibiograma de la cepa Escherichia coli OPS 101, según el ph y el espesor del agar Mueller-Hinton Tamaño del halo de inhibición (en mm) Interpretación clínica* ph del agar Gentamicina Cefotaxima Imipenem Mueller-Hinton 7,63 22,1/S 21,1/I 26,7/S 7,33 18,0/S 21,2/I 28,6/S 7,15 16,9/S 20,7/I 25,7/S 7,13 17,1/S 20,3/I 29,9/S 7,03 16,0/S 20,9/I 27,0/S 6,52 12,5/R 20,8/I 27,0/S 5,97 10,6/R 20,6/I 26,3/S Espesor del agar Ciprofloxacina 6,2 17,4/S 18,5/I 26,8/S 6,0/R 5,2 17,2/S 19,0/I 26,4/S 6,0/R 4,6 17,4/S 19,7/I 26,8/S 6,0/R 4,3 17,7/S 19,9/I 26,9/S 6,0/R 4,0 17,7/S 20,0/I 27,4/S 6,9/R 3,8 17,3/S 20,6/I 27,1/S 7,5/R 3,5 17,7/S 20,7/I 28,2/S 7,8/R 2,9 19,0/S 21,6/I 28,8/S 8,3/R 2,1 21,0/S 22,8/S 29,0/S 10,6/R * Para la interpretación clínica se usaron las tablas del CLSI. (7) ;R = resistente; I = [resistencia] intermedia; S = sensible Cuadro 3. Halos de inhibición e interpretación del antibiograma de la cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, según el ph y espesor del agar Mueller-Hinton ph del agar Tamaño del halo de inhibición (en mm),* por antibiótico Mueller- Hinton Piperacilina (IC = 25-33) Ceftazidima (IC = 22-29) Gentamicina (IC = 16-21) Ciprofloxacina (IC = 25-33) 7,77 30,3 30,1 21,7 30,6 7,42 32,6 30,0 19,8 28,7 7,25 32,2 29,2 20,1 29,7 7,00 32,6 29,8 18,9 29,8 6,72 32,7 29,8 17,2 27,4 6,31 32,8 29,7 16,5 26,9 Espesor del agar (en mm) 6,2 27,7 27,1 17,6 29,0 5,2 27,9 27,6 18,0 30,6 4,6 29,1 28,5 18,1 30,9 4,3 29,5 29,5 18,8 31,1 4,0 29,8 29,3 19,2 32,0 3,8 29,8 28,9 18,9 32,6 3,5 30,1 28,9 19,2 32,2 2,9 29,7 29,0 19,4 33,7 2,1 31,0 30,4 21,2 36,0 Excepto donde se indica lo contrario ( ), todos los halos de inhibición estuvieron dentro del rango; IC (Interpretación clínica). Para la interpretación clínica se usaron las tablas del CLSI. Todos los resultados fueron sensibles al antibiótico correspondiente. Rangos aceptables de halos para la cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC e interpretación clínica según las tablas CLSI.(7) 6,2 mm y 2,1 mm; trimetoprima-sulfametoxazol con un espesor de 2,1 a 3,8 y 4,3 a 6,2; tetraciclina con un espesor de 2,1 a 3,8 y 4,3 a 5,2, y gentamicina y un espesor de 2,1 a 2,9. Las pruebas con eritromicina no generaron halos que estuvieran fuera de rango ATCC, al margen del espesor del agar (cuadro 1). Las interpretaciones fuera del rango ATCC en el caso de oxacilina, vancomicina y gentamicina pueden haberse debido a las variaciones propias del método utilizado para el antibiograma. En cuando a la cepa de P. aeruginosa, se observaron valores del diámetro de inhibición fuera del rango ATCC en las pruebas con ciprofloxacina y espesores de 2,1 y 2,9; gentamicina con espesor de 2,1 y ceftazidima con espesor de 2,1 (cuadro 3). Las variaciones del espesor del agar Mueller-Hinton no cambiaron la interpretación clínica de las pruebas con cepas de S. aureus ni P. aeruginosa, que dieron resultados sensibles en todos los casos. En cuanto a la cepa clínica de E. coli, no se observó cambio en la prueba con ciprofloxacina, que resultó resistente con todos los espesores de AMH. Tampoco hubo cambios al probar imipenem y gentamicina, ante los cuales las pruebas resultaron sensibles con todos los espesores. Sí se observó cambio en la interpretación de la sensibilidad de la cepa de E. coli a cefotaxima, que pasó de intermedia a sensible con un espesor de 2,1 mm (cuadro 2). Discusión El antibiograma de Kirby-Bauer sigue siendo el método de elección en muchos laboratorios, dadas sus ventajas de costo y fácil ejecución, además de que sus resultados guardan buena correlación con el diagnóstico clínico. No obstante, hay muchas variables que afectan el diámetro del halo de inhibición, entre ellas, las relacionadas con el agar Mueller- Hinton (espesor; ph; y contenido de cationes, timina y timidina). Los resultados también varían según el operador que haga la lectura del halo de inhibición y las condiciones en que se realiza tal lectura, como la dirección de la luz, y las características del halo de inhibición. Otras variables que afectan los resultados son el método de análisis (forma de hisopado, temperatura, atmósfera y tiempo de incubación; fase de crecimiento bacteriano; inóculo bacteriano y otros) (6). En este trabajo evaluamos dos variables críticas: el ph del agar Mueller-Hinton y su espesor. Según los resultados obtenidos con las 3 cepas estudiadas (2 cepas ATCC y 1clínica), el efecto del ph en el diámetro del halo de inhibición depende más del antimicrobiano ensayado que de la cepa estudiada. Un ph fuera del rango aceptable (7,2 a 7,4) puede aumentar, disminuir o dejar igual el diámetro del halo, según el antibiótico ensayado. Así, por ejemplo, el diámetro del halo de inhibición que resulta de la prueba de gentamicina con la cepa de S. aureus es más pequeño a ph ácido que el diámetro del halo de inhibición obtenido en el rango aceptable de ph (7,2 a 7,4). El ph ácido, por otro lado, aumenta el diámetro del halo de inhibición a oxacilina y cefoxitina, aunque no afecta el de vancomicina y trimetroprimasulfametoxazol. En el presente estudio, los cambios de ph no fueron suficientes para modificar la interpretación clínica de las pruebas de las cepas estudiadas, 68

6 Riera EB, et al Efecto del espesor y del ph del agar... excepto en el caso de la de E. coli frente a gentamicina con ph 5,97 y 6,52, que dio resultados falsos resistentes. El que los cambios de ph no afecten la interpretación clínica de las pruebas con las cepas estudiadas puede deberse, en parte, a que dos de ellas son ATCC, sin mecanismos de resistencia y con halos de inhibición muy distintos de los de las categorías intermedia o resistente. La única cepa clínica estudiada fue la de E. coli OPS 101 que tiene una betalactamasa tipo Amp-C plasmídica, con resistencia intermedia a cefotaxima. No obstante, aun en este caso, la interpretación no cambió, a pesar de las variaciones de ph ensayadas. Esto se debe a que la acción de cefotaxima no fue afectada por las variaciones de ph del agar. Sin embargo, sí varió la interpretación de la prueba con gentamicina, ya que este antimicrobiano es muy sensible al ph del medio. Se demostró también que la temperatura es un factor importante en la medición del ph del agar Mueller-Hinton, que debe estar a 25ºC (± 3ºC). El efecto del ph sobre la actividad de un antibiótico no sólo ocurre in vitro, según quedó demostrado en este estudio, también puede ocurrir in vivo, como por ejemplo, en el caso de un absceso bacteriano, que es un ambiente ácido donde los aminoglucósidos (gentamicina) son menos activos. Esta disminución de actividad antibiótica in vivo podría comportarse como resistente in vivo. El efecto del ph in vivo es una de las causas de disociación clínico-laboratorial que el médico debe tener en cuenta al extrapolar el resultado del antibiograma al tratamiento de su paciente. El efecto del espesor del agar fue igual para todos los antimicrobianos probados, generando un diámetro de halo de inhibición menor mientras más espeso el agar y más grande con menos espesor, al margen del antimicrobiano y la cepa ensayados. Las variaciones de espesor del agar que estaban entre 2,1 mm y 6,2 mm generaron diferencias en el tamaño del halo insuficientes para cambiar la interpretación clínica de los ensayos. La única excepción fue la prueba de la cepa de E. coli OPS 101 frente a cefotaxima con un espesor de agar de 2,1 mm, que dio un resultado falso sensible en vez de resistencia intermedia. En varios casos, las variaciones más grandes del diámetro del halo de inhibición se obtuvieron con espesores de agar de menos de 4 mm. Las variaciones del ph y espesor del AMH generaron variaciones en el diámetro del halo de inhibición de los antimicrobianos ensayados frente a las cepas estudiadas. Solo en algunos casos estas variaciones modificaron la interpretación clínica. A fin de evitar errores de interpretación en el antibiograma, el ph y espesor del AMH deben ser controlados en cada lote de producción. El ph del AMH debería controlarse con un potenciómetro a una temperatura de 25ºC. El espesor del AMH debe ser controlado con un calibre de 0,1 mm de precisión en el centro de la placa del agar de Mueller-Hinton, y no con una regla en el borde de la placa. Agradecimiento Este estudio no habría sido posible sin el aporte financiero de la Agencia para el Desarrollo Internacional de los Estados Unidos de América, por medio del subsidio LAC-G otorgado a la Organización Panamericana de la Salud. Los autores agradecen la colaboración de las señoras Estela Castro y Nelly Benítez en la preparación de los medios de cultivos Referencias 1. Informe Anual de la Red de Monitoreo/Vigilancia de la Resistencia a los Antibióticos, Washington, DC: Organización Panamericana de la Salud;2005 (OPS/ DPC/CD/332/05). 2. Vincent JC, Vincent HW. Filter paper disc modification of the Oxford cup penicillin determination Proc Soc Exp Bio Med 1994;55: Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method Am J Clinl Pathol 1966;45(4): Bondi A, Spaulding EH, Smith DE, Dietz CC. A routine method for the rapid determination of susceptibility to penicillin and other antibiotics. Amer J Med Sci 1947;213: Petersdorf RG, Sherris JC. Methods and significances of in vitro testing of bacterial sensitivity to drugs. Am J Med 965;39(5): The National Committee for Clinical Laboratory Standards Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility tests; Approved Standard Eighth Edition. Vol. 23, n. 1, 2003.(NCCLS document M2 A8). 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance and standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixteenth informational supplement. Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute; 2006 (CLSI document M100-S26). 8. Ericsson HM, Sherris JC. Antibiotic sensitivity testing. Report of an International Collaborative Study. Acta Path Microbiol Scand Sect B 1971;(Suppl. 217): Correspondencia Esteban B. Riera Venezuela esq. Florida - CP 1430 Asunción - Paraguay. Tel ; Fax eriera@rieder.net.py 69