REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS. ELISA e IF

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1 REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS ELISA e IF

2 REACCIONES INMUNOLÓGICAS CLASIFICACIÓN REACCIÓN MÉTODO SISTEMA INDICADOR IF FLUOROCROMOS PRIMARIAS ELISA RIA IRMA ENZIMAS ISÓTOPOS ISÓTOPOS IN VITRO LUMINISCENCIA LUMINÓGENOS SECUNDARIAS AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN FIJACIÓN DE COMPLEMENTO IN VIVO TERCIARIAS ANAFILAXIA REACCIÓN DE ARTHUS

3 REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS Fuerza que facilitan la unión AG-AC: *Uniones electrostáticas * Uniones o puentes de hidrógeno * Fuerzas de Van der Waals * Fuerzas de dispersión de London

4 REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS ELISA

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6 Elección de una técnica inmunológica Screening? Confirmación? Menor número de falsos negativos Menor número de falsos positivos Técnica sensible Técnica específica R A B Sensibilidad Límite de detección C

7 Sensibilidad de las reacciones inmunológicas MÉTODO Límite de Sensibilidad detección relativa Precipitación en geles 20 1 Precipitación en medios líquidos 10 2 RFC 5 4 Aglutinación HAI IF ELISA RIA

8 EIA: ELISA Se basan en dos fenómenos biológicos importantes: 1.- elevada especificidad de los Ac 2.- alta actividad de algunas enzimas, lo que permite la amplificación de la señal generada por la muestra Empleo de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Clasificación Homogéneos: fase líquida Heterogéneos: fase sólida

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10 ELISA heterogéneo COMPETITIVO Determinación de Ac Y Y Y NO COMPETITIVO Determinación de Ag Determinación de Ac

11 Pasos generales de la técnica de ELISA 1.- Interacción con la fase sólida Soporte: placas de poliestireno, PVC Condiciones: 4ºC, toda la noche; 25ºC 4 h; 37ºC, 1h. SENSIBILIZACION. Buffer: carbonato-bicarbonato ph 9,6 Proteína nativa: Conserva sus epitopes configuracionales y conformacionales. Epitopes crípticos. Lavados. Etapa crítica. Separar componentes que puedan reaccionar en forma no específica, cualquiera sea la variente del método. PBS/Tween 20 (se realizarán después de cada paso)

12 Importancia de la optimización de la concentración del inmunorreactante en fase sólida Capacidad de saturación de la placa Inconvenientes: pérdida de inmunorreactante (formación de multicapas), competencia por los sitios Determinación de antígeno (ELISA de captura) Determinación de anticuerpo 1-10 ug/ml Ag o Ac puros ug/ml para mezclas antigérnicas complejas

13 Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 2.- Bloqueo: se realiza para bloquear todos los sitios de la placa que no fueron ocupados por el antígeno. Proteína inerte para el sistema. Ej. leche descremada en PBS 7,4. Condiciones: 1h a 37ºC, 2h a temperatura ambiente, toda la noche a 4 C. Proteína inerte Ag placa

14 Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 3.- Reacción Ag-Ac: En un ELISA indirecto los Ac que se desean investigar provienen de fluidos biológicos (ej.: suero) el cual se pone en contacto con el Ag que está adherido a la placa. Condiciones: 1h a 37ºC o toda la noche a 4ºC. Diluyente: PBS ph 7,4, Tween 20, proteína inerte. Suero que contiene Ac contra los antígenos adheridos a la placa

15 Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 4.-Incubación con el conjugado: Para poner en evidencia los Ac que se encuentran unidos al Ag, se incuba con un segundo Ac que está dirigido hacia la cadena pesada del primero. Este segundo Ac se encuentra conjugado a una enzima. Ejemplo: Deseo revelar la presencia de IgG h. El segundo Ac será una anti-cadena gama humana marcado con la enzima. Enzimas más empleadas: peroxidasa, fosfatasa alcalina, ureasa, etc. Condiciones: 1h a 37 C Conjugado: Ac, dirigido contra la cadena pesada del primer Ac, marcado con la enzima.

16 Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 5.- Revelado: en este paso se incuba con una solución de revelado que contiene el sustrato de la enzima y un cromógeno, el cual debido a la actividad enzimática sobre el sustrato induce un cambio en el estado de oxidación del cromógeno. Este último pasa de una sustancia incolora a un producto coloreado. Condiciones: 15 a 30 min a temperatura ambiente. Sustrato de revelado: sustrato de la enzima, cromógeno y buffer del sustrato.

17 Pasos generales de la técnica de ELISA 5.- Revelado (cont.): Ej. peroxidasa Cromógeno o prod. formado 2DH + H2O2 2 H2O + 2D Donante de hidrógeno: OPD, o-fenilendiamina 6.- Reacción de parada: agregado de H 2 SO 4 4N

18 Pasos del ELISA Resultados Lavado PBS-T 1. Sensibilización Revelado Lavado PBS-T Lavado PBS-T 2. Incubación con la muestra 3. Incubación con el conjugado

19 Reacción Ag-Ac. Determinación de anticuerpos

20 ELISA no competitivo (tipo sandwich) Búsqueda de Ag Ac anti- TNFa marcado con enzima TNFa Ac anti- TNFa

21 ELISA competitivo (tipo sandwich) Búsqueda de Ag TNFa marcado con enzima TNFa de la muestra Ac anti- TNFa

22 Procesamiento de los datos y expresión de resultados Ensayo de ELISA Sistema competitivos cualitativo semicuantitativo cuantitativo: Curva patrón Punto de corte: X + 2 SD Sistema no competitivo Tipos de curvas patrones (análisis cuantitativo) R Competitivo R No competitivo C C

23 Sistemas alternativos de reconocimiento Sistema proteína/biotina (vitamina). Avidina: proteína de la clara de huevo. Estreptavidina: proteína producida por ciertas levaduras. Sistema Digoxigenina/anti-Digoxigenina (DIG/anti-DIG). Esteroide que se encuentra en forma natural sólo en dos especies de plantas del género Digitalis. Proteína A: proteína de la pared de S. aureus.

24 Y Y Y Biotina Avidina Biotina Peroxidasa Px Y Y Sistema Avidina/biotina Y Y Y Y Y Y Y Y Px DIG Sistema DIG/anti-DIG Y Y Y Y Peroxidasa Px IgG Proteína A Sistema Proteína A

25 Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la determinación de p24 en suero de paciente infectado con HIV suero Ac monoclonal anti-p24 Ac monoclonal anti p24-pod

26 1 Sensibilización de la placa con anticuerpos monoclonales antip24 (proteína del core de HIV) Incubación-Lavado PBS-Tween % 2 bloqueo con leche descremada al 1% en PBS Incubación-Lavado PBS-Tween % 3 Adicionar la muestra (suero de paciente infectado) Incubación 60 min a 37 C-Lavado PBS-Tween % 4 Adicionar el conjugado (anticuerpos monoclonales anti-p24 marcado con POD) Incubación 30 min a 37 C-Lavado PBS-Tween % 5 Adicionar la solución de sustrato (TMB) Incubación 30 min a 37 C Formación de un color azul verdoso 6 Adicionar solución stop (2M Ac. Sulfúrico) 7 Leer absorbancia a 450nm. Cálculos. Procesamiento de datos.

27 OBJETIVO Análisis cualitativo: presencia o ausencia de p24 en suero de paciente infectado con HIV Por lo tanto necesitamos comparar con un control positivo y un control negativo. CONTROL POSITIVO A B C D Cut-off (punto de corte) REACCIÓN POSITIVA CONTROL NEGATIVO P24 (antígeno recombinante) Suero humano normal (no posee p24) No se une el conjugado El sustrato no es reducido No se evidencia color A B C D REACCIÓN NEGATIVA

28 S1 S2 S3 S4 S5 C(-) 1 C(-) 2 C(-) 3 Muestras: S1, S2, S3, S4, S5 Controles negativos 1, 2, 3 En el paso 3 del ELISA de captura adicionamos en diferentes pocillos las muestras y los controles NEGATIVOS

29 Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la determinación de p24 en suero de paciente infectado con HIV Suero y/o controles Ac monoclonal anti-p24 Ac monoclonal anti p24-pod

30 Lectura a 450 nm Realizamos el cálculo del punto de corte (cut-off) con los controles negativos Hemos realizado un análisis cualitativo Y las muestras cuya lectura supera el punto de corte son consideradas positivas Presencia de p24 Y aquellas que son inferiores al punto de corte son consideradas negativas Ausencia de p24

31 Análisis cualitativo de p24 en suero de paciente. Protocolo cantidad p/well reactivo 1 Adicionar 25ul diluyente de muestra 2 Adicionar 100ul sueros muestra y controles negativos 3 Incubar 60 min 37 C 4 Lavar con líquido de lavado 5 Adicionar 100ul Conjugado 6 Incubar 30 min 37 C 7 Lavar con líquido de lavado 8 Adicionar 100ul solución sustrato 9 Incubar 30 min 37 C 10 Adicionar 50ul Ác. sulfúrico 2 M 11 Leer a 450nm 12 Cálculo del punto de corte 13 Procesamiento de datos

32 REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS IF

33 INMUNOFLUORESCENCIA Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos microbianos en tejidos. Coons AH,Creech HJ, Jones RN: Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: Actualmente es un método empleado para demostrar antígenos celulares y tisulares o anticuerpos en fluidos biológicos provenientes de numerosas condiciones clínicas humanas, animales y experimentales.

34 INMUNOFLUORESCENCIA Técnica relativamente poco costosa, rápida, simple, altamente sensible y confiable. Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos microbianos en tejidos. Ahora es un método usado para demostrar muchos otros antígenos celulares y tisulares en numerosas condiciones clínicas humanas y animales. Identificación de microorganismos en materiales infectados (agentes infectivos en materiales sospechosos) Identificación de reacciones antígeno-anticuerpo desarrolladas con cantidades mínimas de reactivos. Identificación de células comprometidas en la biosíntesis de anticuerpos

35 Sensibilidad de las reacciones inmunológicas MÉTODO Límite de Sensibilidad detección relativa Precipitación en geles 20 1 Precipitación en medios líquidos 10 2 RFC 5 4 Aglutinación HAI IF ELISA RIA

36 Fundamento INMUNOFLUORESCENCIA Empleo de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes o fluorocromos Fluorocromo Excitación Emisión Tiempo Fluorescencia máx(nm) máx(nm) declin.(nseg) Isotiocianato de fluoresceína verde (FITC) Isotiocianato de rodamina anaranjado-rojiza (TRICT)

37 PASOS GENERALES IFD IFI Preparación de una impronta, corte tisular o frotis; suspención celular Fijación Incubación con anticuerpos antimarcador, conjugado con un fluorocromo Incubación con anticuerpos antimarcador, no conjugado Lavados con solución salina tamponada Observación entre porta y cubre Montaje y observación Incubación con segundo anticuerpos anti- primer Ac, conjugado con un fluorocromo Lavado Observación

38 Fundamento s Empleo de anticuerpos marcados conjugados con sustancias fluorescentes o fluorocromos F

39 Fluorescencia Diagrama Jablonski 1 : Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S 1 2 : Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito donde el fluorocromo, sufre cambios conformacionales. En consecuencia la energía de S 1 es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia. 3 : Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S 0.

40 Intensidad de luz INMUNOFLUORESCENCIA excitación detección Absorción de luz Emisión de luz Longitud de onda Fig 1. Principio de medición de la fluorescencia.

41 Alexa Fluor Alexa Fluor dye Absorption max. (nm) Emission max (nm) Emission color* Extinction coefficient** Alexa Fluor Blue 19,000 Alexa Fluor Blue 34,000 Alexa Fluor Green/Yellow 16,000 Alexa Fluor Green 71,000 Alexa Fluor Yellow 81,000 Alexa Fluor Orange 104,000 Alexa Fluor Orange 150,000 Alexa Fluor Orange/Red 91,000 Alexa Fluor Red 73,000 Alexa Fluor Red 138,000 Alexa Fluor Far Red 239,000 Alexa Fluor Far Red 140,000 Compuestos orgánicos sintéticos que proporcionan una señal de fluorescencia más intensa y estable que los flourocromos convencionales Invitrogen

42 Importante Las reacciones de IF ponen en evidencia o demuestran la presencia de antígenos que se encuentran expresados sobre estructuras las cuales reciben el nombre de improntas Bacterias Parásitos Células Tejidos

43 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Ac-fluorocromo INDIRECTA Anticuerpo INDIRECTA amplificada por complemento Corte de tejido Y Lavar Y Lavar Ac-anti Ig fluorocromo Y Y Lavar Y Y Lavar Complemento Y Lavar Ac-anti C3 fluorocromo Y Y Lavar

44 Clasificación Inmunofluorescencia Inmunoflorescencia Directa (IFD) Impronta Ag de interés

45 Inmunoflorescencia Indirecta (IFI) Impronta Ag de interés

46 Inmunofluorescencia directa Utiliza un solo anticuerpo Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un 2 anticuerpo conjugado Anticuerpo 2 Anticuerpo 1 Antígenos Anticuerpo 1 Antígenos Ventajas y desventaja s Se realiza en una etapa Alta especificidad con menos problemas de background Baja sensibilidad Se realiza en más de una etapa El mismo anticuerpo conjugado se utiliza para distintas reacciones. Baja especificidad Alta sensibilidad

47 IFD El anticuerpo esta marcado con un florocromo. IFI El anticuerpo NO ESTA marcado con un florocromo. Lavado con Solución salina Lavado con Solución salina Incubación con segundo anticuerpos anti- primer Ac, marcado con un fluorocromo Montaje y Observación Lavado con Solución salina

48 SISTEMA PARA LA VISUALIZACIÓN DE LA INMUNOFLUORESCENCIA FUENTE: lámparas que emiten radiaciones ultravioletas (xenón, halógenas y de mercurio a altas presiones) FITRO DE EXCITACIÓN: selecciona la logitud de onda que incidirá en la impronta ( máxima de absorción del fluorocromo) FILTRO BARRERA: que se coloca entre el ocular y la impronta (eliminación de las radiaciones dañinas y radiaciones de fondo)

49 SISTEMA DE MICROSCOPIOS EPI-ILUMINACIÓN TRANS-ILUMINACIÓN

50 Microscopio confocal Su mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia, hace posible la obtención de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos. Fue inventado en el año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky al estudiar neuronas.

51 Ventajas del microscopio confocal Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia). Enfoca un solo plano del espécimen. Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen. Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta. Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.

52 APLICACIONES Y EJEMPLOS DE LA IF

53 APLICACIONES IFD: búsqueda de antígenos en cortes de tejido, en la superficie de microorganismos, identificación de poblaciones celulares, etc. IFI: búsqueda de anticuerpos en líquidos biológicos, análisis de autoanticuerpos circulantes (enfermedades autoinmunes). IFI amplificada por el complemento: detección de anticuerpos fijadores de complemento específicos para el antígeno fijado en la impronta. IF de tinción doble: evidenciar la presencia de dos antígenos sobre la misma impronta con el empleo de dos tipos de anticuerpos marcados con dos fluorocromos distintos cuyas de emisión están separadas entre sí.

54 IF Directa Aplicación: búsqueda de antígenos en cortes de tejido, microorganismos, identificación de poblaciones celulares, etc.

55 Identificación de Linfocito B por IF Observación, por microscopía de fluorescencia, de las inmunoglobulinas de superficie de un linfocito B Esquema de la técnica para la observación de las inmunoglobulinas de superficie de un linfocito B. Un suero policlonal o monoclonal (a) marcado con isocianato de fluoresceína (b) reacciona con las inmunoglobulinas de la membrana.

56 Detección del receptor de factor de crecimiento epidermal en biopsia de un tumor humano Ac anti-egf marcado con Alexa Fluor 488.

57 IF de tinción doble Aplicación: evidenciar la presencia de dos antígenos sobre la misma impronta con el empleo de dos tipos de anticuerpos marcados con dos fluorocromos distintos cuyas de emisión están separadas entre sí.

58 Visualización de filamentos de actina en Tetrahymena thermophila y celulas endoteliales de arteria pulmonar bovina Ac anti-tubulina marcado con Texas Red. Ac anti-tubulina marcado con Alexa Fluor 488.

59 Visualización de filamentos de actina y mitocondrias en fibroblastos Ac anti-tubulina marcado con Alexa Fluor 350, anti proteína inhibidora del complejo V marcado con Alexa Fluor 500.

60 Procesamiento e información de resultados Generalmente en IFD el objetivo es evidenciar la presencia o ausencia de un Ag de interés. En la mayoría de los casos la muestra problema es comparada con una que contiene el Ag de interés (CONTROL +) y otra que no lo contiene (CONTROL -) Resultado cualitativo

61 IF Indirecta Aplicación: la IFI puede ser empleada con los mismos propósitos que la IFD. Sin embrago, tiene gran aplicación en el laboratorio clínico para demostrar la presencia de anticuerpos en líquidos biológicos en un amplio número de patologías.

62 Células infectadas con el virus de la peste porcina africana Técnica de IFI. Células MS infectadas con el virus de la peste porcina africana. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la células infectadas, destacándose en el citoplasma unas zonas con una intensidad mayor, que corresponden a zonas de mayor replicación viral, y por tanto mayor fijación de anticuerpos.

63 Detección de células germinales en ovario de ratón Ac 1º anti PGC7 (conejo), Ac 2º anti IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 488

64 Prueba de inmunofluorescencia de Crithidia luciae para anticuerpos hacia el DNA. Prueba diagnóstica en LES.

65 Determinación de Ac anti-citoplasma de Neutrófilos (ANCA) en suero de paciente con Vasculitis Sistémica Impronta con Neutrofilos Suero Paciente Control (-) Ac 2º Ig anti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC

66 Patrón de IFI de un suero obtenido de un paciente con AC anti-t. cruzi Ac 2º Iganti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC

67 Como informar un título de AC por IF? 1/2 1/4 1/8 1/16 C - C + Impronta con T. cruzi fijados

68 El título de la muestra será la última dilución que de fluorescencia positiva

69 Procesamiento e información de resultados En el caso de una IFI puedo procesar los resultados de manera cualitativa. Sin embargo, en el caso que el objetivo sea determinar el titulo de Ac de una muestra debo emplear un método semicuantitativo. Resultado cualitativo y semicuantitativo.

70 Procesamiento de los datos Cualitativa. Presencia y ausencia. Controles negativos y positivos Semicuantitativa. Informar título. Controles negativos y positivos

71 Citometría de flujo