CAPITULO 7. Fosforilacion oxidativa

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1 CAPITULO 7 Fosforilacion oxidativa Los seres vivos necesitan alimentarse permanentemente, los nutrientes son utilizados en la síntesis de las moléculas imprescindibles para cada organismo y en la producción de energía para cumplir con las necesidades vitales tales como crecer, reproducirse y moverse. Para producir esta energía los seres vivos queman metabólicamente las biomoléculas en un proceso que guarda similitudes con la combustión. Si se aplica este concepto a un ejemplo donde se quema glucosa, se tiene la siguiente ecuación: El estudio de la síntesis y degradación de las distintas biomoléculas y la interrelación entre los metabolismos de todas ellas, ha mostrado que a lo largo de estas transformaciones se consume o produce energía, bajo la forma de y se produce o consume poder reductor, bajo la forma de NADH, NADPH y/o FADH2. Ahora se abordará el estudio del metabolismo en el que el NADH y el FADH2 producidos en la glucólisis, en la β-oxidación de los ácidos grasos y en el ciclo de Krebs, se reoxidan y generan una gran cantidad de energía que es aprovechada para sintetizar. Resumidamente se puede describir a la fosforilación oxidativa como un proceso en el que las coenzimas reducidas, formadas durante los pasos catabólicos, vuelven a oxidarse, cediendo los electrones al O2, que pasa a un estado de oxidación -2 y forma agua. Al mismo tiempo, la energía producida se aprovecha para sintetizar a partir de ADP y Pi. El flujo de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el O2 es mediado por una serie de complejos proteicos localizados en la membrana interna de la mitocondria; concomitantemente con este flujo se produce un bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana, que genera una diferencia de concentración de H + a ambos lados de la membrana interna de la mitocondria. Cuando esta diferencia de concentración se disipa a través de un complejo enzimático, se sintetiza. Es decir que la oxidación de las coenzimas y la fosforilación del están acopladas por un gradiente de protones a través de la membrana interna de la mitocondria. Como se analizará más adelante, en la fosforilación oxidativa el potencial de transferencia de electrones de las coenzimas reducidas se transforma, primero en fuerza protomotriz, y posteriormente, en potencial de transferencia de fosforilos del. La fuerza que dirige la fosforilación oxidativa es el potencial de transferencia de electrones del NADH y el FADH2. Al calcular el Gº correspondiente a la oxidación de las coenzimas reducidas con el O2, se obtiene lo siguiente: ½ O2 + 2H + + 2e - H20 E 0= +0,82V NAD + + H + + 2e - NADH E 0= -0,32 V ½ O2 + NADH + H + H2O + NAD + E 0= +1,14 V 107

2 La energía libre de oxidación de esta reacción será entonces: Gº = - nf E 0 donde, n = número de electrones transferidos F = constante de Faraday E 0 = diferencia de Potencial Redox. Gº = -2 x 23,06 Kcal/Vmol x 1,14 V = -52,6 Kcal/mol Como se ha visto, el proceso de respiración tiene similitudes con la combustión; sin embargo, la respiración presenta como particularidad, que la energía se libera por etapas y de manera controlada. Si la liberación de energía se produjera en un solo paso, se elevaría la temperatura de la célula hasta valores incompatibles con la vida. Además cuando la energía se libera en cantidades controladas, se puede aprovechar para sintetizar y quedar almacenada bajo esta forma. Planteando la ecuación de la combustión para la respiración, se tiene: Re-oxidación de las coenzimas reducidas Los electrones del NADH y el FADH2 son cedidos al O2 para que éste pase a un estado de oxidación 2 y pueda formar agua. La transferencia de electrones en la cadena respiratoria se realiza a través de tres grandes complejos proteicos y dos transportadores móviles. Es importante destacar que el flujo electrónico se realiza a favor del potencial redox, es decir que la transferencia es energéticamente favorable para el sistema (Fig. 7-1). 108

3 ESPACIO INTERMEMBRANA 4H + 2H + 4H + C-c NADH-Q Reductasa Ub Citocromo C Reductasa Citocromo Oxidasa Sintasa FADH 2 FAD + NADH NAD + 2H + + ½ O 2 H 2 O MATRIZ MITOCONDRIAL ADP + Pi H + Fig Transferencia de electrones en la cadena respiratoria. El NADH cede sus electrones al primer complejo proteico denominado NADH-Q reductasa, una enzima formada por 34 cadenas polipeptídicas y con una masa molecular de aproximadamente 900 Kd. Un grupo prostético de este complejo es la flavina mononucleótido (FMN), que recibe los electrones provenientes del NADH, según: NADH + H + + FMN FMNH2 + NAD + Posteriormente los 2 electrones son transferidos a una serie de complejos hierroazufre, capaces de tomar y ceder electrones merced a que sus átomos de hierro pueden existir como Fe 2+ y Fe 3+. Estas proteínas hierro-azufre son las encargadas de transferir los electrones al primer transportador móvil, la ubiquinona o coenzima-q. Esta pequeña molécula liposoluble toma primero un electrón y se reduce a un intermediario, semiquinona intermedia, que al tomar otro electrón se transforma en ubiquinol. El papel de los transportadores móviles es transferir los electrones entre los complejos proteicos, así el ubiquinol cede los dos electrones al complejo citocromo reductasa y se reoxida volviendo al estado de ubiquinona. El segundo complejo proteico (citocromo reductasa) está formado por dos tipos de citocromos, denominados citocromo b y citocromo c1. En sus estructuras participan, una proteína hierro-azufre y diferentes cadenas polipeptídicas. El complejo citocromo reductasa participa en el transporte de electrones mediante un mecanismo altamente complejo, ya que debe transferir los dos electrones desde el ubiquinol hasta el segundo transportador móvil, el citocromo c, capaz de transportar un solo electrón. Para ello toma primero sólo un electrón del ubiquinol, que pasa a la forma semiquinona intermedia. El citocromo c1 es el encargado de transferir este electrón hasta el citocromo c; seguidamente el intermediario cede el segundo electrón al citocromo b que por un mecanismo de reciclaje reduce a otra molécula de citocromo c. El resultado neto del accionar de la citocromo reductasa es que un par de electrones del ubiquinol es transferido a dos moléculas de citocromo c. El citocromo c está formado por una sola cadena polipeptídica de poco más de 100 aminoácidos, a la que se une de manera covalente un grupo hemo; la proteína es 109

4 aproximadamente esférica y se ubica en la parte exterior de la membrana, hacia el espacio intermembrana. Cuando las dos moléculas de citocromo c toman los electrones provenientes de la citocromo reductasa se reducen a ferrocitocromo c, y en este estado llevan los electrones hasta la citocromo oxidasa, último de los complejos proteicos de la cadena respiratoria. La citocromo oxidasa es un complejo de 10 subunidades y contiene dos grupos hemo y dos iones cobre. La citocromo oxidasa es la encargada de entregar los electrones al oxígeno para que se forme agua. El oxígeno tiene una alta afinidad por los electrones y esto le otorga un gran impulso termodinámico a la fosforilación oxidativa. Pese a ser un fuerte aceptor de electrones, el oxígeno molecular sin catalizadores reacciona muy lentamente, el principal riesgo de esta reacción es la formación de compuestos parcialmente reducidos, como por ejemplo el anión superóxido, una molécula altamente destructiva que se forma por la transferencia de un sólo electrón al oxígeno molecular. Para evitar este inconveniente la citocromo oxidasa enlaza al O2 y con la participación de los iones hierro y cobre le cede 4 electrones para reducirlo, luego captura 4 H + y forma dos moléculas de agua; recién en este momento el oxígeno formando el agua- es liberado. El FADH2 no es capaz de ceder sus electrones al complejo NADH-Q reductasa, pero su potencial redox es suficiente para transferir sus electrones a nivel de la ubiquinona y lo hace mediante un complejo succinato-q reductasa, una proteína intrínseca de la membrana interna mitocondrial. Los electrones incorporados a la cadena respiratoria por la reoxidación del FADH2 continúan hasta la formación de H2O el mismo recorrido descrito para los electrones provenientes del NADH. Síntesis de El flujo de electrones desde el NADH hasta el oxígeno es un proceso exergónico. ½ O2 + NADH + H + H2O + NAD + Gº = -52,6 Kcal/mol Esta energía se utiliza para un proceso endergónico: la síntesis de. ADP + Pi + H + + H2O Gº = + 7,3 Kcal/mol Es decir que la transferencia de dos electrones desde el NADH hasta el oxígeno proveería la energía necesaria para sintetizar poco más de 7 moléculas de. Es claro que aunque las células tengan una eficiencia energética superior a la de cualquier máquina creada por el hombre, parte de esa energía no será aprovechada para la formación de. La oxidación y la fosforilación están acopladas por medio de una fuerza protomotriz, durante el transporte de electrones se genera una diferencia de concentración de protones a los dos lados de la membrana interna mitocondrial. Esta diferencia se forma porque concomitantemente con el transporte de electrones a lo largo de la cadena respiratoria, se produce un transporte de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana. La membrana interna mitocondrial no es libremente permeable a los protones, éstos salen de la matriz por un bombeo que realizan los tres complejos proteicos de la cadena respiratoria: la NADH-Q reductasa, la citocromo reductasa y la citocromo oxidasa. El flujo de un par de electrones desde el NADH hasta la ubiquinona mediante la NADH-Q reductasa, provoca el bombeo de 4 protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana. Cuando estos dos electrones son transferidos a través del complejo citocromo reductasa se bombean dos protones hacia el lado citosólico de la membrana y 4 protones más a nivel de la citocromo oxidasa. Cuando se transfieren 110

5 electrones provenientes del FADH2, sólo se bombean los 2 protones a nivel de la citocromo reductasa y los 4 en la citocromo oxidasa, por lo que la diferencia de concentración de protones y por lo tanto la fuerza protomotriz- que produce la reoxidación del FADH2 es menor. El gradiente de concentración de protones se disipa a través de un complejo enzimático denominado sintetasa o sintasa. Este complejo está formado por un conducto de protones F0 y una unidad catalizadora de la síntesis de, llamada F1 (Fig. 7-2). Canal Protónico ESPACIO INTERMEMBRANA F0 F1 ADP + Pi H + MATRIZ MITOCONDRIAL Fig Síntesis de mediante la sintasa. La unidad F0 es un segmento hidrofóbico formado por 4 cadenas polipeptídicas, que se ubica atravesando la membrana interna de la mitocondria y se constituye en el conducto a través del cual los protones pasan desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial. La unidad F1 está formada por 9 cadenas polipeptídicas y tiene una masa de 378 Kd, su función es catalizar la formación de a partir de ADP y fosfato, según la siguiente reacción: ADP 3- + Pi 2- + H H2O 111

6 Se estima que para que se sintetice una molécula de es necesario que pasen por la sintasa 3 protones desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial. Las moléculas de NADH generadas en metabolismos tales como la glucólisis, se encuentran en el citosol; los electrones deben ingresar a la mitocondria para poder ser incorporados a la cadena respiratoria. La membrana interna de la mitocondria es totalmente impermeable al NADH y al NAD +, pero es necesario que este último sea regenerado para continuar con la glucólisis (es importante recordar que en los organismos anaeróbicos las coenzimas oxidadas son regeneradas en la fermentación). El mecanismo por el que los electrones del NADH citosólico son cedidos a la cadena respiratoria se denomina lanzadera, una de ellas es la lanzadera del glicerol fosfato que, según puede verse en la figura, ingresa los electrones para cedérselos a FAD que forma FADH2 y puede ingresar a la cadena respiratoria a nivel de la ubiquinona (Fig. 7-3). Esta lanzadera es especialmente activa en el músculo de vuelo de los insectos, mientras que en corazón e hígado funciona la lanzadera de malato-aspartato (Fig. 7-4). Dihidriacetona Fosfato CH 2 OH C=O CH 2 OPO 3 NADH NAD + Glicerol Fosfato Deshidrogenasa Citoplasmática Glicerol-3- Fosfato CH 2 OH CH-OH CH 2 OPO 3 CH 2 OH C=O CH 2 OPO 3 Dihidriacetona Fosfato Glicerol Fosfato Deshidrogenasa Mitocondrial FADH 2 FAD + Matriz Mitocondrial CH 2 OH CH-OH CH 2 OPO 3 Glicerol-3- Fosfato Fig Lanzadera del glicerol fosfato. 112

7 Malato Deshidrogenasa Citoplasmática NADH NAD + Oxalacetato Malato Aminotrasferasa Glutamato Aspartato α-cetoglutarato Malato Deshidrogenasa Mitocondrial NAD + NADH Malato Aspartato α-cetoglutarato Aminotrasferasa Oxalacetato Glutamato Matriz Mitocondrial Fig Lanzadera de malato-aspartato. La lanzadera de malato-aspartato tiene como ventaja que hace ingresar los electrones a la matriz mitocondrial como NADH, pero como es reversible sólo ingresa electrones cuando la relación NADH/NAD + es menor en la mitocondria que en el citoplasma. Tampoco el ADP y el difunden libremente a través de la membrana interna mitocondrial, para poder transponerla se valen de la ADP- translocasa, que es un dímero de dos subunidades idénticas de 30 Kd y que contiene un único centro de unión que se expone alternativamente hacia el espacio intermembrana y hacia la matriz mitocondrial; como producto de este accionar el ADP puede ingresar a la matriz mitocondrial para sintetizar, y el puede salir hacia el citosol para participar en los distintos metabolismos (Fig. 7-5). 113

8 Citoplasma ADP ADP Matriz Mitocondrial Fig Esquema del funcionamiento de la translocasa. Este intercambio de por ADP conlleva la transferencia de una carga negativa hacia el espacio intermembrana, porque el tiene una carga negativa más que el ADP, entonces se produce una disminución en la diferencia de carga a ambos lados de la membrana y disminuye la fuerza protomotriz. La reoxidación de una molécula de NADH produce el bombeo de 10 protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana, para la síntesis de una molécula de es necesario que atraviesen la sintetasa 3 protones, mientras que la salida de una molécula de hacia el citosol y la entrada de una de ADP a la matriz mitocondrial supone el gasto de un protón. Con estos datos se puede calcular cual es la producción de por cada molécula de NADH que se reoxida. Actualmente la estimación más aceptada es que el resultado de la transferencia de los dos electrones del NADH al oxígeno es la formación de 2,5 moléculas de en el citosol. Esta afirmación se basa en que para sintetizar las 2,5 moléculas de es necesario que 7,5 protones atraviesen la sintetasa (ya que se necesitan 3 protones para la síntesis de cada molécula de ) y 2,5 protones son el gasto necesario para sacar las 2,5 moléculas de de la matriz mitocondrial (ya que se supone un consumo de un protón por cada molécula de translocada); es decir que con los 10 protones transferidos cuando se reoxida una molécula de NADH se sintetizan 2,5 moléculas de y se sacan al exterior de la matriz mitocondrial. Cuando se reoxida una molécula de FADH2 no se produce el bombeo de protones a través de la NADH-Q reductasa, debido a que los electrones son incorporados a nivel de la ubiquinona; por lo tanto se verifica un bombeo de 2 protones en la citocromo reductasa y 4 protones en la citocromo oxidasa. Estos 6 protones transferidos pueden generar la síntesis de 1,5 moléculas de en el citosol, ya que 4,5 protones serán utilizados para el funcionamiento de la sintasa y 1,5 para translocar 1,5 moléculas de hacia el citosol. 114

9 Con esta información es posible realizar cálculos de energía en los distintos metabolismos; por ejemplo la cantidad de que se produce por la oxidación completa hasta CO2 y H2O de cada molécula de glucosa, provenientes del almidón que compone la ración de un animal monogástrico. ADP ADP 2NAD 2NADH 2ADP 2 1 Glucosa 1 Glucosa-6P 1 Fructosa-6P 1 Fructosa-DP 2 G-3P 2 DPG 2 PG 2ADP 2 2 PEP 2 Piruvato NADHcit 3 2NAD 8NADH 8NAD Cadena Respiratoria 2FAD 2FADH 2 3 ½ O 2 H 2 0 2FADH 2 2NAD 2NADH 2 Acetil-CoA 2 Piruvato 2CO 2 2CoA Ciclo de Krebs 6NADH 4CO 2 2GTP Comparando con la cantidad de producida por la fermentación de cada molécula de glucosa en una bacteria utilizada en la elaboración de vino, se tiene: ADP ADP 2NAD 2NADH 2ADP 2 1 Glucosa 1 Glucosa-6P 1 Fructosa-6P 1 Fructosa-DP 2 G-3P 2 DPG 2 PG 2 2NAD 2NADH 2ADP 2 2 PEP 2 Etanol 2 Acetaldehído 2 Piruvato CO 2 115