UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS Caracterización citogenética y molecular de las especies cultivadas del género Pachyrhizus Richard ex DC. Presentado por: Mónica Lucía Santayana Rivera TESIS PARA OBTAR EL TÍTULO DE: Biólogo Lima, Perú 2012

2 ÍNDICE GENERAL Índice de cuadros iii Índice de figuras iv Índice de anexos v Resumen vi Abstract vii I. Introducción 1 II. Revisión de literatura El género y las especies Pachyrhizus erosus (L.) Urban Pachyrhizus ahipa (Wedd.) Parodi Pachyrhizus tuberosus (Lam.) Sprengel Caracterización de recursos fitogenéticos Caracterización citogenética Caracterización molecular mediante marcadores AFLP 12 (polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados) 2.5 Análisis filogenético Índices de diversidad 15 III. Materiales y métodos Obtención del material vegetal Determinación de ploidía en células meristemáticas de 19 raíces en Pachyrhizus 3.3 Extracción de ADN Preparación de muestras para AFLP Iniciadores AFLP Amplificación preselectiva Amplificación selectiva Análisis de datos 23 IV. Resultados y discusión Conteo de cromosomas Caracterización molecular mediante marcadores AFLP Tamizado de iniciadores Polimorfismo y diversidad fenotípica 31 i

3 4.2.3 Análisis genético Análisis de coordenadas principales (PCoA) Análisis de varianza molecular (AMOVA) 38 V. Conclusiones 46 VI. Recomendaciones 48 VII. Referencias bibliográficas 49 VIII. Anexos 58 ii

4 ÍNDICE DE CUADROS 1. Accesiones de Pachyrhizus pertenecientes al banco de germoplasma del 18 CIP utilizadas en los estudios citogenético y molecular. 2. Secuencias de los iniciadores EcoRI y MseI. Los iniciadores E00 y M00 22 no poseen nucleótidos selectivos por lo tanto se muestran las secuencias núcleo. 3. Ploidía y número cromosómico para 39 accesiones de Pachyrhizus Combinaciones de iniciadores AFLP elegidas para el análisis de diversidad 30 y agrupamiento de las accesiones de Pachyrhizus. 5. Número de fragmentos AFLP por combinación de iniciadores, índices de 31 diversidad fenotípica de Shannon (Hs) y comparación entre las tres especies cultivadas de Pachyrhizus. 6. Resultados del AMOVA para las tres especies de Pachyrhizus Resultados del AMOVA para los individuos de P. tuberosus Resultados del AMOVA para los individuos de P. tuberosus sin la accesión 39 CIP iii

5 ÍNDICE DE FIGURAS 1. Características morfológicas de P. erosus. a) Hoja, semillas, legumbre y raíz. 5 b) Porte herbáceo 2. Características morfológicas de P. ahipa. a) Porte herbáceo con frutos 6 b) Flor e inflorescencia. c) Semillas. 3. Características morfológicas de P. tuberosus, cultivar Chuin. Se observan 8 dos fenotipos (a y b) correspondientes a la misma accesión. 4. Característica morfológicas de P. tuberosus, cultivar Ashipa 8 5. Porcentaje de células en metafase para las accesiones de Pachyrhizus con 26 las que se realizaron las pruebas preliminares. 6. Microfotografías de células en metafase mostrando 22 cromosomas 28 condensados para: a) P. ahipa (CIP ), b) P. tuberosus (CIP ), c) P. erosus (CIP ) y d) Híbrido: P. ahipa x P. tuberosus (CIP ). Grado de aumento: 100x 7. Dendrograma generado por agrupamiento no ponderado por pares utilizando 34 la media aritmética (UPGMA). 8. Patrón AFLP de dos combinaciones elegidas de iniciadores mostrando 35 al individuo CIP (b) flanqueado por dos individuos P. tuberosus (a y c) y comparado con tres individuos de P. erosus (d, e y f). M: marcador de peso. 9. Análisis de coordenadas principales de las especies de Pachyrhizus incluyendo 37 híbrido P. ahipa x P. tuberosus. P. erosus (rojo), P. ahipa (azul), P. tuberosus (verde) e Híbridos (negro). iv

6 INDICE DE ANEXOS 1. Porcentajes de fragmentos polimórficos para cada par de iniciadores 59 evaluados en el tamizado. 2. Sección de gel mostrando los fragmentos generados por los iniciadores: E45/M59, 2. E46/M42, 3. E46/M48 y 4. E46/M Análisis de coordenadas principales para la especie P. ahipa Análisis de coordenadas principales para la especie P. tuberosus Análisis de coordenadas principales para la especie P. erosus Protocolo para extracción de DNA (pequeña escala) Protocolo para desarrollar polimorfismos en longitud de fragmentos 65 amplificados (AFLPs) 8. Protocolo para electroforesis en gel de poliacrilamida Tinción del gel con nitrato de plata Preparación de buffers para extracción de DNA Preparación de Buffers y mezclas de reacción para AFLP Preparación de soluciones tampón para electroforesis en gel de 72 acrilamida v