Estudio de la expresión de GalNAc-T11 en pacientes con Leucemia Linfoide Crónica

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1 Tesis de Maestría PEDECIBA Biología Subárea Biología Celular y Molecular Estudio de la expresión de GalNAc-T11 en pacientes con Leucemia Linfoide Crónica Q.F. María Gabriela Libisch Recalde Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur de Montevideo Orientador: Dr. Carlos Robello Co-Orientador: Dr. Alfonso Cayota Montevideo, Abril 2012

2 Agradecimientos Finalmente se termina esta etapa!!! No me queda más que agradecer a todos los que directa o indirectamente me ayudaron a realizar esta Tesis. En primer lugar quiero agradecerle a Malon por darme un lugar en su laboratorio y brindarme siempre mucha libertad para trabajar. Además gracias Malon y Alfonso por el apoyo recibido durante todos estos años. A mis compañeras y amigas del laboratorio UBM (Ma. Laura, Talia, Moni, Lore, Paula, Andrea, Ceci, Gaby, Dola, Adri, Pili y Gonza), gracias por el tiempo compartido, la ayuda recibida, y por hacer que el día a día de trabajo sea un lindo camino para transitar. A Pablo, Pilar, Florencia y Cecilia del laboratorio UPR, y a Sergio de UBP por darme las muestras para trabajar. A Josefina, Valentina e Inés del laboratorio UBC por su ayuda con los experimentos de citometría de flujo. A mis Amigas, por estar siempre ahí en las buenas y en las no tanto. A mi querida hermana Ana. A Gabriel, por su amor, comprensión y apoyo. Por último a mis padres, para ellos no me alcanzan las palabras de agradecimiento, así que simplemente gracias por TODO! A todos muchas gracias!

3 ÍNDICE RESUMEN... 7 INTRODUCCIÓN... 9 CÁNCER... 9 Cáncer y metilación LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA Diagnóstico y pronóstico Estados de Rai y Binet Estado mutacional genes IgVH Expresión de marcadores moleculares Análisis citogenético Defectos de apoptosis y proliferación Microambiente en LLC GLICOSILACIÓN Generalidades Funciones N-glicosilación O-glicosilación Mucinas GalNAc-Ts Definición Estructura Especificidad de sustratos Patrones de expresión y distribución Regulación de la expresión de las GalNAc-Ts... 29

4 Localización La familia de los genes GALNT humanos GalNAc-Ts y su relación con patologías GalNAc-Ts y Cáncer Glicobiología y LLC ANTECEDENTES OBJETIVOS GENERAL ESPECÍFICOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS EXPRESIÓN DEL ARNm DE GalNAc-T El ARNm de GalNAc-T11 se expresa en linfocitos B-LLC GALNT11: potencial nuevo marcador de LLC EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA GalNAc-T Producción y caracterización de un Anticuerpo anti GalNAc-T Purificación del polipéptido de GalNac-T11 recombinante Determinación de la expresión de la proteína GalNAc-T Western blot Inmunofluorescencia Indirecta IFI EXPRESIÓN DE LOS ANTÍGENOS Tn Y SIALIL-Tn Estudio de expresión del antígeno Tn por citometría de flujo Estudio de expresión del antígeno Tn y sialil Tn por IFI GENERACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR DAUDI-T Generación de la línea Daudi-pcDNA

5 Generación de la línea Daudi-T Expresión de la proteína GalNAc-T11 en la línea Daudi-T La sobre-expresión de GalNAc-T11 no se asocia con la expresión de Tn ni sialil-tn REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GALNT11 POR METILACIÓN DEL ADN Búsqueda de islas CpG en la familia de las 20 GalNAc-Ts humanas DISCUSIÓN EXPRESIÓN DEL ARNm de GalNAc-T Identificación de GalNAc-T11 como un potencial nuevo marcador de Leucemia Linfoide Crónica GALNT11 como marcador diferencial de linfocitos B y T EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA GalNAc-T EXPRESIÓN DE LOS ANTÍGENOS Tn y SIALIL-Tn GENERACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR DAUDI-T REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GALNT11 POR METILACIÓN DEL ADN PERSPECTIVAS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

6 Resumen RESUMEN 6

7 Resumen RESUMEN Una de las alteraciones de mayor relevancia en células tumorales es la modificación de los patrones de O-glicosilación, encontrándose en la mayoría de los casos expresión de antígenos mucínicos de O-glicosilación incompleta, como los antígenos Tn y silail-tn. El primer paso de la O-glicosilación tipo mucina está mediado por una amplia familia de enzimas (20 en humanos) denominadas UDP-GalNAc-polipéptido-α- N-acetilgalactosaminiltrasnferasas (GalNac-Ts), muchas de las cuales presentan una expresión alterada en distintos tipos de cáncer. Sin embargo, existe muy poca información respecto a la presencia de alteraciones de la O-glicosilación en leucemias, y particularmente en la Leucemia Linfoide Crónica (LLC). En este trabajo encontramos que el ARNm de GalNAc-T11 constituye un nuevo potencial marcador de LLC, cuyo promedio de expresión es significativamente mayor en pacientes no mutados y progresores respecto a pacientes mutados e indolentes respectivamente. Además determinamos la ausencia de expresión de los antígenos de O-glicosilación incompleta Tn y sialil-tn en células B-LLC. Por otro lado, mostramos que el proceso de metilación del promotor de GALNT11 jugaría un rol importante en la regulación de la expresión de este gen, y finalmente generamos una línea estable inducible por tetracicilna capaz de sobre-expresar GalNAc-T11, la cual constituye una importante herramienta, que nos permitirá estudiar blancos de la enzima y alteraciones en la función de las células que puedan estar relacionadas con la malignidad de las mismas. En resumen el trabajo realizado contribuye al entendimiento de las bases moleculares de los procesos de O-glicosilación en la LLC. 7

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