Estimación de Biomasa

Transcripción

1 Estimación de Biomasa Dra. Alejandra Cardillo Proceso de producción Monitoreo de información ph Temperatura Biomasa po Concentración 2 de producto Sustrato consumido Estrategias de control Toma de decisiones 1

2 Cuál es la importancia??? Caracterizar nuestro sistema Ver su evolución Expresión de los rendimientos del proceso definir qué es la biomasa en el sistema en estudio tiempo estimado del que se dispone para obtener los resultados económicamente viable 2

3 Medidas On-line y Off-line Elección del método. Propiedades de la biomasa Propiedades del medio de cultivo Características del proceso Tipo Separabilidad o capacidad de disgregación Edad del cultivo Filamentoso Particulado Velocidad de crecimiento Viscosidad Color Sólidos insolubles Potenciales Interferentes Exactitud y sensibilidad Rapidez y versatilidad 3

4 Métodos directos Análisis físicos Peso seco / fresco Volumen DO Conteo en campo eléctrico Citometría de flujo Permeabilidad dieléctrica Microscopía y recuentos Recuentos de viables Conteo directo en microscopio Métodos indirectos Análisis químicos Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia Fluorescencia Espectroscopia de infrarrojo cercano Masa de componentes celulares Actividades metabólicas 4

5 PESO FRESCO. Ventaja: Puede aplicarse a cualquier morfología Desventaja: Necesidad de estandarizar muy bien la metodología y tiempos de la técnica PESO SECO 5

6 Desventajas: Se necesitan aproximadamente 24 hs para secar el material. Interfieren sólidos no disueltos en el medio de cultivo. No discrimina entre material viable y no viable. Es muy poco sensible. METODO VOLUMETRICO Poco volumen En capilar (como un hematocrito) Mayor volumen Centrifugación en tubo graduado En todos los casos se deben estandarizar las condiciones en las que sedimenta la biomasa Desventaja: La sedimentación de la biomasa dependerá de la morfología del cultivo 6

7 DENSIDAD OPTICA. El método está basado en la ley de Lambert y Beer. Turbidimetría Se mide la opacidad o densidad óptica. El detector se ubica en la misma dirección en la que incide el haz inicial. Log I 0 /I t = A x l DO Nefelometría El detector se ubica en un ángulo distinto del haz incidente (normalmente 90 o ). Log I 0 /I s = -B x l Desventajas Solo aplicable a microorganismos unicelulares y que no liberen sustancias al medio que modifiquen su Absorbancia. Es afectado por burbujas y sólidos no disueltos. Es sensible en un rango acotado de concentración. 7

8 CONTEO EN CAMPO ELECTRICO. Principio: Se hace pasar las células por una pequeña apertura en la cual está aplicado un campo de corriente eléctrica constante. Como las células son generalmente no-conductoras, al pasar por la apertura generan un incremento en el voltaje (por aumento de la resistencia). La concentración de la muestra debe de ser tal que pase una sola célula a la vez por la ranura. También se puede calcular el tamaño de la célula, ya que el cambio en la resistencia es proporcional al tamaño. Desventajas: Restringido a medios de cultivo definidos (por la conductividad del medio). Solo aplicable a microorganismos unicelulares. Equipo costoso (Coulter counter). 8

9 CITOMETRIA DE FLUJO. Principio: Es similar al se CONTEO EN CAMPO ELECTRICO. El monitoreo del paso de las células es por un haz de láser. El detector registra la interrupción del haz. Desventajas: Alto costo del equipo. Solo microorganismos unicelulares. para PERMEABILIDAD DIELECTRICA. Principio: Al aplicar un campo eléctrico se produce la polarización por migración de los iones de la solución. La polarización inducida (Capacitancia) en la suspensión celular difiere de la del medio esto sucede porque los iones generados dentro de la célula no pueden migrar al polo opuesto debido a la membrana celular. 9

10 Para generar polarización necesita de membranas intactas Detecta células viables Ventaja: Buen sistema para microorganismos filamentosos, los cuales suelen ser problemáticos. CONTEO DIRECTO EN MICROSCOPIO. Se hace un recuento en cámara tipo hematológica. Se usan colorantes como contraste ( azul de metileno, fenoftaleína, rojo neutro). Ventajas: Diferencia entre células viables y no viables. Equipamiento muy accesible. 10

11 CONTEO DE VIABLES. Se basa en el recuento de colonias. Poco práctico para el monitoreo de procesos por la demora en la obtención de los resultados Ventaja: Técnica apta para microorganismos unicelulares y para el cultivo de esporas. Desventaja: Método muy lento. Considerar la exigencia nutricional de los microorganismos. METODOS INDIRECTOS Refieren el crecimiento al dosaje de un componente celular. 11

12 BIOLUMINISCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA. La biomasa es expresada en términos de ATP. La técnica se basa en la reacción: ATP + luciferina + O 2 oxiluciferina + AMP i + PP i + CO 2 LUZ FLUORESCENCIA Utiliza la propiedad de algunas sustancias de emitir a distinta de la que es usada para excitarlos. NADH y NADPH son muy usados. La concentración de NADPH es muy variable de acuerdo al estado fisiológico de la célula. El NADH depende de la actividad redox de la célula. Es más constante. Los componentes del medio pueden contribuir a la fluorescencia. 12

13 ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO CERCANO Basado en la absorción de energía en el rango de 700 a 2500 nm. Bandas principalmente estudiadas: -OH, -NH, -CH. El método todavía no es muy aplicado. EN ETAPA DE INVESTIGACION. Desventajas: Alto costo Análisis de datos complejo MASA DE UN COMPONENTE CELULAR. Nitrógeno celular. Método utilizado: Kjeldahl Desventaja: el contenido de N es variable entre las distintas fases de crecimiento. Proteínas. Método más utilizado: Biuret Desventaja: Depende de la composición de aminoácidos (reactivos calibrados son BSA) DNA. Colorimetría basada en la reacción entre deoxiribosa y difenilamina. Ventaja: la concentración de DNA es bastante constante. Desventajas: Poco sensible, usa reactivos peligrosos. 13

14 ACTIVIDADES METABOLICAS. Relaciona biomasa con alguna velocidad de reacción metabólica Se puede monitorear : la producción de gases como CO 2, el consumo de sustratos o de O 2, reacciones de reducción de colorantes específicos. * En el caso del consumo de sustratos, se debe tener en cuenta que parte del consumo se destina al mantenimiento y solo una parte de estos se destina al crecimiento de la biomasa. 14