Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de Biología Molecular

Transcripción

1 Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de Biología Molecular Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos Generación de moléculas de DNA recombinante Ingeniería Genética AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA) Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA) (detergentes, proteasas, cambios de presión) Separación del DNA del resto de los componentes celulares (principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenol-cloroformo) Repetir la extracción. Eliminación del fenol. Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol Disolver el DNA (Se concentra) Análisis del DNA Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría Espectro de absorción de DNA Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría A 260 = 1 50 g/ml DNA dc 33 g/ml DNA cs 40 g/ml RNA También se mide la relación de abs. A 260 / A 280 => ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Separación en geles de agarosa (1 4%) Electroforesis horizontal. Migran al ánodo Tinción con bromuro de etidio Intercala entre las bases del DNA Forman complejos fluorescentes 1

2 Herramientas para el análisis de DNA. Enzimas de restricción y sus sitios de corte LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDO EXTREMOS COHESIVOS STICKY Son purificadas de bacterias Las enzimas de restricción son endonucleasas Rompen en sitios específicos del DNA Reconocen secuencias palíndromicas específicas de 4; 6 o 8 pb DNA de un plásmido digerido con EcoRI Extremos son compatibles DNA genómico digerido con EcoRI Algunas generan extremos romos y otros extremos cohesivos en el DNA al que cortan Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasa forma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR) Corte del DNA con enzimas de restricción Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector Plásmido DNA de interés Tratamiento con enzima de restricción Fragmentos de DNA con extremos cohesivos compatibles Mezclar los fragmentos en presencia de una DNA ligasa 2

3 CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN Una biblioteca de DNA genómico es un conjunto de fragmentos de DNA de un organismo y empaquetados en vectores (plásmidos), que son mantenidos en células bacterianas. Digestión con enzimas de restricción DNA fragmentado y clonado en plásmidos Introducción de los plásmidos en bacterias DNA de doble hélice Desnaturalización: se genera DNA de cadena sencilla Renaturalización: se forma DNA duplex BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cdna SÍNTESIS DE cdna y construcción de una biblioteca de cdna Membrana de nylon o nitrocelulosa Selección del tejido Extracción de RNAm Incubación con las sonda y lavado Colonias con el plásmido de interés Caja Petri con colonias de bacterias Sonda: DNA de cadena sencilla marcado con 32 P Hibridar con oligo-dt Síntesis de cdna con una transcriptasa reversa Eliminación del RNA Las transcriptasas reversas son enzima virales. Sintetizan DNA usando RNA como molde Se hace una réplica de las colonias en la membrana Lisis de las bacterias y desnaturalización del DNA con NaOH Exposición a un film fotográfico. Detección de colonias con el plásmido de interés. Síntesis de la segunda cadena de DNA 3

4 Transferencia en Southern Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Thermus aquaticus Taq DNA Polimerasa Great Fountain Geyser, Yellowstone. Manantial Temperatura C El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente 4

5 La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones Detección de alelos mutantes caracterizados. Búsqueda de alelos mutantes no conocidos. Identificación de microorganismos patógenos. Caracterización de cepas del virus de la influenza Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cdna (Clonación de genes) Secuenciación de DNA Generación de mutantes puntuales. Estudiar la expresión génica. 5

6 La era genómica. Secuenciación de DNA La era genómica. Secuenciación de DNA SECUENCIACIÓN DE DNA 6

7 Secuenciación de Genomas Aplicaciones de Biología Molecular Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción) Diagnóstico genético. PCR Producción de proteínas recombinantes en bacterias Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas Terapia génica Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción) Este es el fundamento de pruebas de paternidad. A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base. Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser único. Individuo 1 Individuo 2 Homocigoto Homocigoto heterocigoto 7

8 Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener la huella genética Mancha de Sangre El DNA se extrae de las células sanguíneas Digestión del DNA con enzimas de restricción Se utiliza la técnica de Southern blot Sonda de DNA marcada se une específicamente Southern blot Los fragmentos de DNA se separan por electroforesis La membrana se lava y se revela para detectar bandas de interacción DNA-DNA El patrón de DNA se compara con el de sospechosos Se han mapeado genes anormales causantes de enfermedades Distrofia Muscular Enf. de Gaucher Hemofilia Cáncer de colon Diagnóstico genético. PCR Neurofibromatosis Esclerosis lateral Retinitis pigmentosa Enf. Huntington Debido a que las mutaciones más comunes que son responsables de estas enfermedades ya están caracterizadas, se han establecido algunas pruebas genéticas: Inmunodeficiencia ADA Hipercolesterolemia Amiloidosis Cáncer de mama Poliposis Hemocromatosis Fibrosis cística Exostosis múltiple Pruebas diagnósticas. Establecen o confirman el diagnóstico de un individuo que ya está afectado. Pruebas pre-sintomáticas. Determinan con un alto grado de certeza si un individuo va a desarrollar alguna enfermedad. Pruebas predictivas. Indican un elevado riesgo de una enfermedad pero no pueden establecer con certeza si un individuo va a estar afectado. Enfermedad policística de hígado Enfermedad de Tay- Sachs Melanoma maligno Neoplasia endócrina Anemia falciforme Estas pruebas genéticas son especializadas pues muchas de ellas involucran la amplificación del fragmento de DNA correspondiente al gen que se busca y la secuenciación del gen. Alzheimer Fenilcetonuria Retinoblastoma 8

9 Producción de proteínas recombinantes en bacterias. Escalamiento y purificación de la proteína Aplicaciones en Biotecnología Vegetal El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para obtener un homocigoto. Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante: Resistencia a plagas de insectos Resistencia a herbicidas Resistencia a virus Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares. Virus, bacterias, micoplasmas Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el homocigoto con los caracteres deseados. 9

10 La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que tengan una nueva característica. Transformación por Agrobacterium tumefaciens Una limitación importante es la transformación (introducción del DNA) de céluals vegetales. Transformación por bombardeo Resistencia a plagas de insectos. Gusano barrenador en maíz. Mecanismo de acción de las toxinas Bt En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad insecticida. El insecto ingiere la protoxina al alimentarse del tejido de la planta La protoxina sufre proteólisis en el intestino del insecto y se genera la toxina activa Toxinas Bt La toxina se une a receptores en las cel. epiteliales del intestino La toxina se oligomeriza y forma poros en la MP de la cel. epitelial 10

11 La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos: Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas. Se incrementa el rendimiento El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años: Controversias sobre plantas transgénicas. Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la transferencia resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas. Generalmente los marcadores de selección son Kan R y Neo R Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Generación de supermalezas resistentes a herbicidas. El caso de maíz en México. México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz silvestre en México. Transferencia de genes a estas especies. Reducción en la diversidad? Animales transgénicos. Ratones knock-out Aislar el gen de interés y clonarlo en un vector. Interrumpir el gen con una secuencia de DNA que confiera resistencia a un antibiótico. Transformar células embrionarias totipotenciales con la secuencia quimérica de DNA. Seleccionar las células transformadas en presencia del antibiótico. Inyectar las células a embriones de ratón. Transferir los embriones a una hembra para su desarrollo. En la camada se obtendrán ratones heterocigotos (x/-) Hacer una cruza entre dos heterocigotos. El 25% será (-/-). 11