Citometría de Flujo Principios y Aplicaciones

Transcripción

1 Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina José María Vargas Cátedra de Inmunología Citometría de Flujo Principios y Aplicaciones 2016 Prof. Edwin Escobar edscobar@gmail.com

2 Esquema General Principios Generales de la Citometría de Flujo Citómetro de Flujo Fluorescencia / Fluorocromos Anticuerpos Monoclonales Señales / Datos Generados Análisis Aplicaciones en Medicina Inmunofenotipaje Sistema de Complemento Diagnóstico de Inmunodeficiencias Procesos Celulares Dinámicos

3 CITOMETRÍA DE FLUJO PRINCIPIOS GENERALES Citómetro de Flujo

4 Citometría de Flujo Metodología que permite analizar células (u otras partículas: µm) que se encuentran en un fluido, en base a sus características de dispersión de luz y fluorescencia, al interaccionar una a una con un rayo láser.

5 Enfoque Hidrodinámico Canal Central (Muestra en Estudio) Fluido de Arrastre Flujo Laminar (Partículas avanzan una a una)

6 Dispersión del Rayo de Luz Dispersión Frontal (FSC, forward scatter) Es una medida del tamaño de la célula o partícula evaluada Dispersión Lateral (SSC, side scatter) Es una medida de la granularidad y/o complejidad interna de la célula o partícula evaluada Célula Láser (Fuente de Luz) FSC Dispersión Frontal SSC Dispersión Lateral

7 Dispersión del Rayo de Luz Laser (Fuente de Luz) SSC FSC Población de Leucocitos Sangre Periférica Granulocitos m Monocito Monocitos Dreamstime.com FSC Linfocitos

8 CITOMETRÍA DE FLUJO PRINCIPIOS GENERALES Fluorocromos y Fluorescencia

9 Fluorocromos Moléculas capaces de absorber energía (excitarse) a una determinada longitud de onda y emitir esa energía, en forma de fotones, a una longitud de onda mayor Estado de Singlete Excitado Liberación de Calor Estado de Singlete Relajado E excitación (Energía de Excitación) E emisión (Energía de Emisión) Absorción de Luz Emisión de Luz Excitación (Longitud de onda 1) Estado Basal Emisión (Longitud de onda 2) nm

10 FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) Espectro de Absorción Laser de Argón 488 nm Máxima Absorción 490 nm Espectro de Emisión Máxima Emisión 525 nm Longitud de Onda (nm) Espectro Luz Azul Emisión Fuerte Verde Emisión Débil Anaranjado

11 Fluorocromos Espectros de Absorción y Emisión de Fotones Láser de Argón 488 nm Isotiocianato de Fluoresceína FITC Ficoeritrina PE Ficoeritrina-Cy5 PE-Cy5

12 Compensación La compensación se refiere a la corrección matemática de la señal de fluorescencia detectada en un canal determinado, restando el porcentaje de señal introducido (solapado) por otro fluorocromo Longitud de Onda (nm) 12% 5% Longitud de Onda (nm)

13 CITOMETRÍA DE FLUJO PRINCIPIOS GENERALES Anticuerpos Monoclonales

14 Anticuerpos Monoclonales Kohler & Milstein, 1975 Epitopos Anticuerpos Monoclones Conjugar Ac. Monoclonal + Fluorocromo Separación de Clones Células Esplénicas + Hibridación Células Plasmáticas Células de Mieloma Hibridomas

15 CITOMETRÍA DE FLUJO PRINCIPIOS GENERALES Análisis de Datos

16 Procesamiento de Señales Sistema de Fluidos Filtros Detectores Dispersión Frontal (Tamaño) Rayos Laser Dispersión del Rayo de Luz FSC / SSC Lentes Filtros Fluorescencia FL1 FL4 Detector Dispersión Lateral (Complejidad) Fluorescencia 1 Fluorescencia 2 Fluorescencia 3 Fluorescencia 4 Pantalla de Computadora

17 Análisis de Datos Selección de Regiones

18 Análisis de Datos Intensidad de Fluorescencia Histograma Células Positivas para FL-1 (CD3) Linfocitos T 72% Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log) CD3

19 Análisis de Datos Intensidad de Fluorescencia Histogramas de Dos Parámetros CD4 Vs. CD3 CD8 Vs. CD3

20 Subpoblaciones de Linfocitos T Porcentaje (%) Recuento (Cél./µL) Valores de Referencia Leucocitos Linfocitos Totales Linfocitos T Totales Linfocitos T CD Linfocitos T CD Relación CD4/CD

21 Análisis de Datos Selección de Regiones ( Gating ) IFN-γ CD8 CD8 CD4 Linfocitos CD4 Histograma Linfocitos T CD8+ Linfocitos T CD4+ Linfocitos T (CD3+) CD45RO CD45RO Vírgenes Memoria Vírgenes Memoria Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log) CD3 IL-2 IL-2

22 CITOMETRÍA DE FLUJO APLICACIONES Inmunofenotipos

23 Hematopoyesis Célula Madre Hematopoyética Progenitor Mieloide Común Progenitor Linfoide Común Monocitos GM-CFU Granulocitos Basófilos Linfocito Pre-B Linfocito Pre-T Linfocito Pre-NK Eosinófilos Monocitos Neutrófilos Glóbulos Blancos

24 Células Hematopoyéticas Marcadores de Linaje Linfocitos B CD19 ++ CD20 ++ CD22 ++ HLA-Dr ++ CD79 α, β ++ Eritrocitos Linfocitos T CD2 ++ CD3 ++ CD7 ++ CD4 +++ CD8 +++ Células Madre (Stem Cells) CD45 Débil CD34 ++ Células Citotóxicas Naturales (NK) Granulocitos CD16 ++ CD56 ++ CD3 Monocitos CD4 + CD11b + CD11c + CD14 ++ HLA-Dr ++ Glicoforina A ++ CD36 ++ CD45 (ó Débil) Plaquetas CD41 ++ CD61 ++ CD CD CD MPO +++

25 Citometría de Flujo Inmunofenotipo Ontogenia del Linfocito B Pre-BCR µ + Cadena Liviana Sustituta IgM IgM IgD Célula Madre Linfocito Pre-B Linfocito B Inmaduro Linfocito B Maduro Linfocito B Activado Célula Plasmática Gen de Ig Sin Reordenar Cad. Pesada µ Pre-BCR IgM IgM e IgD Expansión Clonal Cambio de Isotipo Mad. de Afinidad Ig Secretadas Gran Producción CD45 Débil CD34 CD45 CD34 Débil CD10 CD19 Igα-Igβ TdT RAG1, RAG2 CD45 CD10 Débil CD19 CD20 Débil Igα-Igβ CD45 CD19 CD20 Igα-Igβ CD45 CD19 CD20 CD38 Igα-Igβ CD45 Débil CD38 CD56 CD138

26 Inmunofenotipos Diagnóstico de Neoplasias Hematológicas Dependiendo del estadío de maduración ontogénica en que se encuentre una célula que sufra una transformación neoplásica, el cuadro resultante será distinto Pre-BCR µ + Cadena Liviana Sustituta IgM IgM IgD Célula Madre Linfocito Pre-B Linfocito B Inmaduro Linfocito B Maduro Linfocito B Activado Célula Plasmática Leucemias Linfomas Mieloma

27 SSC CD79α-PE SSC HLA-DR-FITC CD10-FITC Diagnóstico Hemato-oncológico LLA Común FSC CD22-PE CD19-PerCP CD34-PE TdT-FITC

28 Linfoma del Manto Blood 2008;111(8):

29 CITOMETRÍA DE FLUJO APLICACIONES Sistema del Complemento

30 Proteínas Reguladoras del Complemento Vía Clásica Vía de las Lectinas Vía Alterna C4b2a C3bBb Convertasas de C3 X Regulación: Convertasa de C3 Convertasa de C5 CD55 (DAF) C4bBP, CR2, Factor H Disociación de Convertasa de C3 CAM Complejo de Ataque a Membrana C5b67 C8 C5b678 C59 (MIRL) HRF X Regulación: Complejo de Ataque a Membrana C9 C5b678 Poli-C9 CAM Complejo de Ataque a Membrana

31 Hemoglobinuria Paroxística Nocturna Defecto en la expresión de CD55 y CD59 (dos proteínas reguladoras del Complemento), asociado con hemolisis importante y trombosis Evaluación de Eritrocitos CD235a es una molécula expresada en eritrocitos Paciente (HPN) I II III FSC FSC CD59-FITC III 8% II 54% I 38% CD59-FITC Blood 2005;106:

32 Hemoglobinuria Paroxística Nocturna La causa es un defecto genético que afecta a las proteínas que se unen a la membrana celular a través de puentes con GPI (Glucofosfatidilinositol) Evaluación de Granulocitos CD15 se expresa en Granulocitos Paciente 1 Anemia Aplásica Granulocitos Normales SSC Paciente 2 Anemia Aplásica FSC Paciente 3 HPN Clásica Eosinófilos 0.18% Defectos en la expresión 8.7% 98.8% CD24-PE CD24-PE CD16 y CD24 se anclan a la membrana de PMN por puentes de GPI CD24-PE Blood 2005;106:

33 CITOMETRÍA DE FLUJO APLICACIONES Diagnóstico de Inmunodeficiencias

34 Citometría de Flujo Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias Ontogenia del Linfocito B Pre-BCR µ + Cadena Liviana Sustituta IgM IgM IgD Célula Madre Linfocito Pre-B Linfocito B Inmaduro Linfocito B Maduro Linfocito B Activado Célula Plasmática Tirosinquinasa de Bruton (Btk) Requerida para reordenamiento genético y expresión de cadenas ligeras Defectos en Btk Inmunodeficiencia Primaria Agammaglobulinemia Ligada a X (XLA)

35 Citometría de Flujo: Usos Clínicos Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias Determinar Subtipos Celulares: XLA (Agammaglobulinemia Ligada a X) Control Linfocitos T (CD3+) Paciente (XLA) Linfocitos T (CD3+) Linfocitos B (CD20+) Linfocitos B (CD20+) 15.8% 0.39% CD20 Ausencia de Linfocitos B Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:

36 Antígeno Activación del Linfocitos B Interacción CD40/CD40L CD4 MHC-II TCR X Ausencia de CD40L Inmunodeficiencia Síndrome de Hiper-IgM Ligado a X

37 Citometría de Flujo: Usos Clínicos Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias Síndrome de Hiper-IgM Ligado a X Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:

38 CITOMETRÍA DE FLUJO OTRAS APLICACIONES

39 Parámetros Evaluables por Citometría de Flujo Estructurales Tamaño Celular Granularidad Citoplasma Antígenosmembrana, intracelular Contenido de ADN, ARN Funcionales Apoptosis Endocitosis Produccion de Citoquinas Proliferación Calcio movilización

40 Aplicaciones Procesos Celulares Dinámicos Proliferación Celular Incorporación de Fluorocromos en Fosfolípidos de Membrana Detección de Disminución de Fluorescencia en Progenie Celular Apoptosis Disminución del contenido de ADN Disminución de tamaño y aumento de Complejidad Interna Pérdida de Asimetría de Fosfolípidos de Membrana Reducción del Potencial de Membrana Mitocondrial Fagocitosis Ingestión de Bacterias marcadas con FITC Estallido Oxidativo Transformación de Fluorocromos por Metabolitos del Oxígeno Producción de Citoquinas Inhibición de la secresión Detección Citoplasmática de Citoquinas

41 Ensayos de Proliferación CFSE (pigmento de membrana)

42 Determinación de Apoptosis TUNEL Apoptosis: Fragmentación de ADN Extremos OH 3 disponibles TdT añade BrdU Detección con anti-brdu

43 Citometría de Flujo Cuantificación de Citoquinas En Sobrenadantes de Cultivos (CBA-BD) Muestra Sobrenadantes de Cultivos Perlas de Captura Poblaciones con Fluorescencia discreta (FL3) Anticuerpos Detectores Marcados con Fluorescencia (FL2) Sándwich Inmunitario Perlas + Citoquinas + Anticuerpos Detectores Varias Citoquinas Simultáneamente Combinando Diferentes Poblaciones de Perlas de Captura Flexibilidad y Eficiencia Ensayos Personalizados, Ahorro de Tiempo y Muestra

44 Citometría de Flujo Cuantificación de Citoquinas En Sobrenadantes de Cultivos (CBA-BD) Perlas de Captura: Poblaciones con Fluorescencia discreta (FL3) Determinación de Citoquinas: análisis de las señales de fluorescencia FL3 (Perlas) y FL2 (Anticuerpos Detectores)

45 GRACIAS!

46 Espectro Electromagnético Mayor Energía Menor Energía 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Espectro Visible