Tema 6 Cuantificación de proteínas

Transcripción

1 Tema 6 Cuantificación de proteínas Procedimiento de estudio de proteínas Selección de fuente Fraccionamiento de células Centrifugación Cromatografía Cromatografía en capa fina Cromatografía en columna Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel Cromatografía de afinidad Electroforesis Electroforesis en acetato de celulosa Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)

2 Procedimiento estudio de proteínas 1º) Aislamiento de las proteínas Selección de la fuente Disgregación del tejido Ruptura celular 2º) Purificación Cromatografía Electroforesis 3º) Determinación de la estructura primaria 3º) Determinación de su actividad 3º) Determinación de sus niveles de expresión

3 Tejido Disgregación del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca ) Separación de las células Cultivos celulares Cultivos primarios Líneas celulares Selección de la fuente

4 Fraccionamiento de las células Químicos Lisis osmótica Detergentes Disolventes orgánicos (acetona, etanol, TCA) Mecánicos Homogenización Sonicación Congelación

5 Separación componentes celulares por CENTRIFUGACIÓN Homogenado se somete a altas velocidades de giro Separación por tamaño y densidad Las moléculas mayores se depositan antes Estabilización de las proteínas: ph Degradación proteolitica Temperatura

6 Fraccionamiento celular por CENTRIFUGACIÓN Homogenado 1000g x 10 min c. enteras, núcleos y citoesqueleto g x 20 min mitocondrias, lisosomas y peroxisomas g x 1h Separación en función del tamaño Aumento de la velocidad de centrifugación microsomas y pequeñas vesículas g x 3h ribosomas, virus y grandes macromoléculas

7 Separación y purificación de proteínas Se basa en la diferente: Solubilidad CROMATOGRAFÍA Tamaño Carga eléctrica ELECTROFORESIS Densidad Afinidad por otras moléculas

8 Cromatografía Cromatografía Papel (capa fina): Aminoácidos y Azúcares Columna: Aminoácidos y Proteínas Cromatografía sobre papel (Cromatografía de reparto)

9 Cromatografía CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos Muestra aplicada El solvente se aplica contínuamente a la boca de la columna Matriz sólida Tapón poroso Moléculas fraccionadas eluídas y recogidas Tubo de ensayo tiempo

10 Cromatografía TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA A) Intercambio iónico: en base a la carga B) Filtración en gel: en base al tamaño C) de Afinidad: en base a interacción Flujo de solvente Flujo de solvente Flujo de solvente Partícula cargada positivamente Molécula cargada negativamente unida Molécula cargada positivamente libre Partículas porosas Molécula pequeña retrasada Molécula grande no retrasada Partícula con sustrato unido covalentemente Molécula de enzima unida Otras proteínas pasan de largo

11 Las proteínas se separan según su carga a un ph determinado (Ej: intercambio catiónico) Cromatografía de intercambio iónico Proteínas cargadas positivamente se unen a la matriz cargada negativamente Proteínas cargadas negativamente pasan sin unirse

12 Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular Las proteínas se separan según su tamaño Matriz de polímeros de carbohidratos Moléculas pequeñas entran entre los espacios acuosos dentro de la matriz Moléculas grandes no entran dentro de los espacios de la matriz

13 Cromatografía de afinidad Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando Moléculas que unen glucosa se unen a residuos de glucosa (G) de la matriz Adición de glucosa (G) Moléculas se liberan tras la adición de glucosa Enzima - Sustrato Antígeno - Anticuerpo Hormona - Receptor

14 Electroforesis Electroforesis Papel, acetato de celulosa Gel: proteínas (SDS-PAGE) y ac. nucleicos

15 Proteínas plasmáticas Albúmina 45-55% total Globulinas: a 1 5-8% a % b 11-17% g % Electroforesis en acetato de celulosa

16 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Formación de un gel de poliacrilamida

17 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Dodecil sulfato sódico

18 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

19 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Marcadores de peso molecular

20 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Proteínas teñidas con Azul de Comassie tras SDS-PAGE Determinación de las masas moleculares

21 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Proteínas presentes en los sucesivos estadios de purificación de una enzima Carril 1: extracto de partida Resto de carriles: proteínas obtenidas después de fraccionamiento cromatográfico de la muestra del carril anterior