N Latex SAA. Procedure

Transcripción

1 Intended Use In vitro diagnostic reagents for the quantitative determination of Serum Amyloid A (SAA) in human serum and heparinized plasma by means of particle-enhanced immunonephelometry using the BN* II or BN ProSpec System. Summary and Explanation SAA is an acute-phase protein which, in response to inflammatory, infectious as well as non-infectious processes, exhibits a strong rise in its blood concentration within a few hours. The increase can amount to 1000-fold its initial concentration. SAA is associated with the high-density lipoproteins (HDL) and can modify their metabolism during inflammation. One particularly important aspect of SAA is that its degradation products can be deposited in various organs as Amyloid A (AA) fibrils, which is a serious complication in chronic inflammatory diseases. Like for C-reactive protein (CRP), the determination of SAA is useful for diagnosing inflammatory processes, assessing their activity as well as monitoring these processes and their treatment. However, the assay of SAA is more conclusive than that of CRP in patients with viral infections, rejection reactions to kidney transplants (especially in immunosuppressed patients) as well as in patients with cystic fibrosis treated with corticoids (1, 2). In case of inflammatory arthritis, SAA was found to exhibit the closest correlation to the activity of the disease (3). Parallel determination of CRP and SAA can enhance diagnostic sensitivity for infections (4). In patients with AA amyloidosis, the course of the disease can be improved by therapy aimed at returning the SAA levels to normal (5). Principle of the Method Polystyrene particles coated with antibodies to human SAA are aggregated when mixed with samples containing SAA. These aggregates scatter a beam of light passed through the mixture. The intensity of the scattered light is proportional to the concentration of the relevant protein in the sample. The result is evaluated by comparison with a standard of known concentration. Reagents Materials provided N Latex SAA, Code No. OQMP N SAA Reagent, 3 vials, for 2 ml each N SAA Standard SY (human), 3 vials, for 0.5 ml each N SAA Control SY (human), 4 vials, for 0.5 ml each N SAA Supplementary Reagent, 3 vials, with 1.3 ml each Composition and Standardization N SAA Reagent consists of lyophilized polystyrene particles coated with sheep antibodies to human SAA. N SAA Standard SY (human) is produced from human serum with elevated levels of SAA. The SAA concentration of the reconstituted standard is given on the vial label. N SAA Control SY (human) is produced from human serum with elevated levels of SAA. The SAA concentration of the reconstituted control is given on the vial label. The concentration of N SAA Standard SY and N SAA Control SY are calibrated with reference to the 1st International Standard 1997 Serum Amyloid A Protein Lot No. 92/680 (6). N SAA Supplementary Reagent consists of a glycine NaCl buffer solution containing pyrrolidone and detergent as additives. Preservatives Reconstituted N SAA Reagent : Gentamicin 6.25 mg/l, Amphotericin mg/l Reconstituted N SAA Standard SY, reconstituted N SAA Control SY as well as N SAA Supplementary Reagent: Sodium azide < 1 g/l Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes. Sodium azide can form explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead. 3. Each individual blood donation for use in the manufacture of the N SAA Reagent, N SAA Standard SY (human) and N SAA Control SY (human) was tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2 by FDA-required testing. Only donations with negative findings are used for manufacture. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all samples (e.g., patient sera and plasma) and products (e.g., standard and control sera) obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material (7). Preparation of the Reagents N SAA Reagent: Resuspend the lyophilized vial contents with 2 ml of distilled water. The reagent can be used 15 minutes after reconstitution. Shake gently to mix before first use. N SAA Standard SY (human) and N SAA Control SY (human): Dissolve the lyophilized vial contents in 0.5 ml of distilled water. Shake gently to mix. The standardas well as the control are ready for use 60 minutes after reconstitution. N SAA Supplementary Reagent: The solution is supplied ready-for-use. Storage and Stability Shelf life at +2 to +8 C see expiry date on label; Stability once opened: 4 weeks (reconstituted N SAA Reagent, reconstituted N SAA Standard SY and reconstituted N SAA Control SY as well as N SAA Supplementary Reagent) if stored at +2 to +8 C securely capped immediately after each use. Do not freeze. On-board Stability: A minimum of five days, at eight hours per day, or a comparable period of time. Note: On-board stability may vary, depending on the BN* System used and laboratory conditions. For further details, refer to BN* II and BN ProSpec System Instruction Manual. On-board stability of the N SAA Control SY on the BN ProSpec System is stated in the Instruction Manual of the system. Materials required but not provided BN* II or BN ProSpec System N Diluent, Code No. OUMT Cleaner SCS, Code No. OQUB BN* II Evaporation Stoppers (optional), Code No. OVLE Additional materials and supplies as described in your BN* II or BN ProSpec System Instruction Manual. Specimens Suitable samples are human serum and heparinized plasma, either as fresh as possible (stored for no more than 8 days at +2 to +8 C) or stored frozen. Samples can be stored at below -25 C for up to 3 months, if they are frozen within 24 hours after collection and if repeated freeze-thaw cycles are avoided. Samples must have completely coagulated and, after centrifugation, must not contain any particles or traces of fibrin. Lipemic samples or frozen samples which are turbid after thawing, must be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) prior to testing. OQMP G11 C0540 (16) H 1 Edition April 2003 Procedure Notes 1. Consult your BN* System Instruction Manual for details regarding operation of the instrument. 2. The reagents must not be used beyond the expiry date. 3. Only components (reagent, standard, control and supplementary reagents) from kits of the same lot may be used together; do not combine kit components from kits of different lots. 4. The lyophilized reagents must not be used until properly reconstituted, (at least 15 minutes for N SAA Reagent, and at least 60 minutes for N SAA Standard SY and N SAA Control SY, ). 5. A separate cuvette rotor must be used for the SAA assay on the BN* II System. The assay can be combined with N High Sensitivity CRP and N Latex Cystatin C. Assay Protocol for BN* Systems The assay protocol, for serum and plasma, is given in the BN* System Instruction Manual and software of the instrument. All steps are performed automatically by the system. Establishment of the Reference Curve Reference curves are constructed by multi-point calibration. Serial dilutions of the N SAA Standard SY are automatically prepared by the instrument using N Diluent. The standard dilutions must be used within half an hour. The analytical value is given on the respective vial label. For the BN ProSpec System a lot-data disk, (code no. OVLP) can be used to enter the analytical value. The reference curve is valid for one week and can be used beyond this period, for as long as the accuracy control, e.g. N SAA Control SY, is reproduced within its confidence interval. If a different lot of reagent is used, a new reference curve must be recorded. The exact measuring range depends upon the concentration of the protein in each lot of N SAA Standard SY. For typical figures refer to the respective BN* System Instruction Manual. Assay of Specimens Samples are automatically diluted 1:400 with N Diluent. The diluted samples must be used within 2 hours. If the results obtained are outside the measuring range, the assay can be repeated using a higher or lower dilution of sample. Details on repeat measurements using further sample dilutions are described in the Instruction Manuals for the BN* Systems. Internal Quality Control Assay N SAA Control SY after each estblishment of a reference curve, after the first use of a reagent vial as well as with each run of samples. Like the patient samples, the N SAA Control SY is automatically diluted 1:400 with N Diluent and must be measured within 30 minutes. The assigned value of the N SAA Control SY is given on its vial label. The confidence interval is the assigned value ± 20 %. For the BN ProSpec System, a lot-data disk (code no. OVLP) can be used to enter the assigned value. The stated assigned value is intended for use as an accuracy control. If used for precision control, the user should establish the target concentration and confidence limits during a preliminary phase. If a result of the control measurements is outside the confidence interval, the determination must be repeated. If the repeated determination confirms the deviation, a new reference curve should be established. Do not release patient results until the cause of the deviation has been identified and corrected. Results The results are evaluated automatically by means of a logit-log function. Limitations of the Procedure Turbidity and particles in the samples may interfere with the determination. For this reason, samples containing particles must be centrifuged prior to testing. Lipemic samples which cannot be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) must be excluded from the assay. Due to matrix effects, inter-laboratory survey samples and control samples may yield results that differ from those obtained with other methods. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target values. Reference Interval In a population with normal serum CRP levels (95 th percentile = 5.0 mg/l, n = 483), the 95 th percentile for N Latex SAA was found to be at 6.4 mg/l. Nevertheless, each facility should determine its own reference intervals since values may vary depending on the population studied. Specific Performance Characteristics Sensitivity The sensitivity of the assay is determined by the lower limit of the reference curve and thus depends on the concentration of the protein in N SAA Standard SY. Specificity No cross-reactivity of the applied antibodies is known. Precision Three SAA concentrations (approximately 7 mg/l, 55 mg/l and 192 mg/l) were measured on the BN* System using N Latex SAA. Calculation of precision by variance analysis (n = 40) according to NCCLS Guideline EP5-A (8), the intra-assay coefficients of variation (CV) were found to be 4.3 to 6.2 % and inter-assay CV laid between 2.8 to 4.7%. The total CV were between 5.4 and 6.4 %. Note The values cited for specific performance characteristics of the assay represent typical values and are not to be regarded as specifications for N Latex SAA. Bibliography 1. Malle E, De Beer FC. Human serum amyloid A (SAA) protein: a prominent acute-phase reactant for clinical practice. Eur J Clin Invest 1996; 26: Yamada T. Serum Amyloid A (SAA): a concise review of biology, assay methods and clinical usefulness. Clin Chem Lab Med 1999; 37: Cunnane G, Grehan S, Geoghegan S, et al. Serum Amyloid A in the assessment of early inflammatory arthritis. J Rheumatol 2000; 27: Hogarth MB, Gallimore R, Savage P, et al. Acute phase proteins, C-reactive protein and serum amyloid A protein, as prognostic markers in the elderly inpatient. Age Ageing 1997; 26: Gillmore JD, Lovat LB, Persey MR, et al. Amyloid load and clinical outcorne in AA amyloidosis in relation to circulating concentration of serum amyloid A protein. Lancet 2001; 358: Poole S, Walker D, Gaines Das RE, et al. The first international standard for serum amyloid A protein (SAA). Evaluation in an internartional collaborative study. J Immunol Methods 1998; 214: U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) ; 1999; Section II; National Commitee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of Precosion Performance of Clinical Chemistry Devises; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN X). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA , USA, BN ProSpec is a registered trademark of in the USA, Germany and other countries. * BN is a trademark of in the USA. USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE U.S.A.

2 Anwendungsbereich In-vitro-Diagnostica zur quantitativen Bestimmung von Serum Amyloid A (SAA) in humanem Serum und Heparin-Plasma mittels partikelverstärkter Immun-Nephelometrie am BN* II und BN ProSpec System. Diagnostische Bedeutung SAA ist ein Akute-Phase-Protein, das als Antwort auf entzündliche, infektiöse wie nicht-infektiöse Prozesse innerhalb weniger Stunden einen starken Anstieg seiner Konzentration im Blut zeigt. Der Anstieg kann bis zum 1000-fachen der Ausgangskonzentrationen betragen. SAA ist mit den High Density Lipoproteinen (HDL) assoziiert und kann deren Metabolismus bei Entzündungen modifizieren. Eine besondere Bedeutung erhält SAA dadurch, dass seine Spaltprodukte als Amyloid A (AA)- Fibrillen in verschiedenen Organen abgelagert werden können, was eine ernsthafte Komplikation chronischer Entzündungen darstellt. Der diagnostische Nutzen der SAA-Bestimmung liegt zum einen in der Erkennung, Aktivitätseinschätzung, Verlaufs- und Therapiekontrolle von entzündlichen Prozessen, analog zum C-reaktiven Protein (CRP). Bei der Erfassung viraler Infektionen, bei Abstoßungsreaktionen von Nierentransplantaten, besonders bei immunsupprimierten Patienten, sowie bei Patienten mit zystischer Fibrose unter Corticoid-Therapie ist dagegen die Bestimmung von SAA aussagekräftiger als die des CRP (1, 2). Auch bei entzündlichen Arthritiden zeigte SAA die beste Korrelation zur Krankheitsaktivität (3). Die parallele Bestimmung von CRP und SAA kann die Sensitivität der Erkennung von Infektionen steigern (4). Bei AA-Amyloidose-Patienten kann eine auf Normalisierung des SAA- Spiegels ausgerichtete Therapie den Verlauf verbessern (5). Prinzip der Methode Polystyrol-Partikel, die mit Antikörpern gegen humanes SAA beladen sind, bilden bei Mischung mit SAA enthaltenden Proben Aggregate, an denen eingestrahltes Licht gestreut wird. Die Intensität des Streulichts ist abhängig von der Konzentration des jeweiligen Proteins in der Probe. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich mit einem Standard bekannter Konzentration. Reagenzien Inhalt der Handelspackung N Latex SAA, Bestell-Nr. OQMP N SAA Reagenz, 3 Flaschen für je 2 ml N SAA Standard SY (human), 3 Flaschen für je 0,5 ml N SAA Kontrolle SY (human), 4 Flaschen für je 0,5 ml N SAA Zusatzreagenz, 3 Flaschen mit je 1,3 ml Zusammensetzung und Standardisierung N SAA Reagenz besteht aus einem Lyophilisat von Polystyrol-Partikeln, die mit Antikörpern gegen Human-SAA vom Schaf beladen sind. N SAA Standard SY (human) wird auf Basis von humanem Serum mit erhöhtem SAA-Gehalt hergestellt. Die SAA-Konzentration nach Rekonstitution des Standards ist auf dem Flaschenetikett angegeben. N SAA Kontrolle SY (human) wird auf Basis von humanem Serum mit erhöhtem SAA-Gehalt hergestellt. Die SAA-Konzentration nach Rekonstitution der Kontrolle ist auf dem Flaschenetikett angegeben. Die Konzentration des N SAA Standards SY und der N SAA Kontrolle SY werden unter Bezug auf den 1st International Standard 1997 Serum Amyloid A Protein Lot No. 92/680 (6) kalibriert. N SAA Zusatzreagenz besteht aus einer Glycin-NaCl-Pufferlösung unter Zusatz von Pyrrolidon und Detergenz. Konservierungsmittel: N SAA Reagenz nach Rekonstitution: Gentamicin: 6,25 mg/l, Amphotericin: 0,625 mg/l N SAA Standard und N SAA Kontrolle jeweils nach Rekonstitution sowie N SAA Zusatzreagenz: Natriumazid < 1 g/l Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden! Natriumazid kann mit Schwermetallen wie Kupfer oder Blei explosive Azide bilden. 3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von N SAA Reagenz, N SAA Standard SY (human) und N SAA Kontrolle SY (human) vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Proben (z. B. Patientenseren und -plasmen) und Produkte (z. B. Standard- und Kontrollseren) wegen nie völlig auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden (7). Vorbereitung der Reagenzien N SAA Reagenz: Der lyophilisierte Inhalt einer Flasche ist mit 2 ml destilliertem Wasser zu rekonstituieren. Das Reagenz ist 15 min nach Rekonstitution einsetzbar. Es ist vor dem ersten Gebrauch behutsam zu durchmischen. N SAA Standard SY (human) und N SAA Kontrolle SY (human): Der lyophilisierte Inhalt einer Flasche ist mit 0,5 ml destilliertem Wasser zu lösen. Die Lösung ist behutsam zu durchmischen. 60 min nach Rekonstitution ist der Standard bzw. die Kontrolle gebrauchsfertig. N SAA Zusatzreagenz: Die Lösung ist gebrauchsfertig Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Lagerung bei +2 bis +8 C: das Haltbarkeitsdatum ist auf dem Etikett angegeben; Stabilität nach Öffnen: 4 Wochen (rekonstituiertes N SAA Reagenz, rekonstituierter N SAA Standard SY und rekonstituierte N SAA Kontrolle SY sowie N SAA Zusatzreagenz), sofern unmittelbar nach Gebrauch wieder dicht verschlossen bei +2 bis +8 C gelagert. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren werden. Stabilität auf den BN* Systemen: N SAA Reagenz und N SAA Zusatzreagenz minimal 5 Tage mit jeweils 8 Stunden, oder ein vergleichbarer Zeitraum. Hinweis: Die "on-board" Stabilität hängt von dem verwendeten BN* System sowie den Laborbedingungen ab. Weiterführende Angaben sind in den Bedienungsanleitungen des BN* II und des BN ProSpec Systems enthalten. Die "on-board" Stabilität der N SAA Kontrolle SY auf dem BN ProSpec System ist in der Bedienungsanleitung des Systems angegeben. Zusätzlich benötigte Materialien BN* II oder BN ProSpec System N-Diluens, Bestell-Nr. OUMT Cleaner SCS, Bestell-Nr. OQUB BN* II Evaporation Stoppers (wahlweise), Bestell-Nr. OVLE Verbrauchsmaterial und Ausrüstung wie in der Bedienungsanleitung für das BN* II oder BN Pro- Spec System beschrieben. Untersuchungsmaterial Zur Messung sollen möglichst frische (max. 8 Tage bei +2 bis +8 C aufbewahrte) oder gefroren gelagerte humane Serumproben und Heparin-Plasmaproben eingesetzt werden. Werden Proben innerhalb von 24 Stunden nach Entnahme eingefroren, so ist eine Lagerung unterhalb 25 C bis zu 3 Monate möglich, wenn wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermieden wird. Die Proben müssen vollständig geronnen sein und dürfen nach Zentrifugation keine Partikel oder Spuren von Fibrin enthalten. Lipämische Proben oder eingefrorene Proben, die nach dem Auftauen trüb sind, müssen vor der Bestimmung durch Zentrifugation (10 min. bei ca x g) geklärt werden. Testdurchführung Hinweise: 1. Einzelheiten zur Bedienung der BN* Systeme sind der entsprechenden Bedienungsanleitung zu entnehmen. 2. Reagenzien dürfen nach dem angegebenen Haltbarkeitsdatum nicht mehr verwendet werden. 3. Nur Bestandteile (Reagenz, Standard, Kontrolle und Zusatzreagenzien) von Testkits mit gleicher Chargenbezeichnung dürfen miteinander kombiniert werden. 4. Die angegebene Rekonstitutionszeit lyophilisierter Reagenzien (mind. 15 min für N SAA Reagenz und mind. 60 min für N SAA Standard SY bzw. N SAA Kontrolle SY nach Zugabe von destilliertem Wasser) ist einzuhalten. 5. Für die SAA Bestimmung am BN* II System muß ein eigener Küvettenrotor verwendet werden. Die Bestimmung kann mit N High Sensitivity CRP uind N Latex Cystatin C kombiniert werden. Assay-Protokolle an den BN* Systemen Das Assay-Protokoll für Serum und Plasma ist in der Bedienungsanleitung sowie der Software des jeweiligen Gerätes enthalten. Alle Schritte werden automatisch vom System durchgeführt. Erstellung der Referenzkurve Referenzkurven werden über Mehrpunktkalibrierung aufgenommen. Für die Erstellung werden automatisch Verdünnungsreihen des N SAA Standards SY mit N-Diluens hergestellt. Die Standard- Verdünnungen müssen innerhalb einer halben Stunde verwendet werden. Der Sollwert ist auf dem entsprechenden Flaschenetikett angegeben. Am BN ProSpec System kann er per Chargenangaben-Diskette (Bestell-Nr. OVLP) eingelesen werden. Die Referenzkurve ist 1 Woche lang gültig. Sie kann über diesen Zeitraum hinaus verwendet werden, solange eine Richtigkeitskontrolle, wie z. B. N SAA Kontrolle SY innerhalb des jeweiligen Vertrauensbereichs wiedergefunden wird. Bei Verwendung einer anderen Reagenzcharge muß eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Der exakte Meßbereich hängt von der Analytkonzentration jeder N SAA Standard SY Charge ab. Typische Meßbereiche sind in der jeweiligen BN* System Bedienungsanleitung angegeben. Messung der Patientenproben Proben werden automatisch 1:400 mit N-Diluens verdünnt. Die Verdünnungen müssen innerhalb von 2 Stunden gemessen werden. Bei Meßwerten, die außerhalb der Meßbereichs liegen, kann die Messung aus einer höheren oder niedrigeren Probenverdünnung wiederholt werden. Wiederholungsmessungen aus weiteren Probenverdünnungen sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Interne Qualitätskontrolle Die N SAA Kontrolle SY sollte nach jeder Erstellung einer Referenzkurve, nach erstmaliger Verwendung einer Reagenzabfüllung sowie bei jeder Serie von Proben eingesetzt werden. Die N SAA Kontrolle SY wird im Ansatz und bei der Auswertung wie eine Patientenprobe automatisch mit N- Diluens 1:400 verdünnt und muß dann innerhalb von 30 Minuten gemessen werden. Der Sollwert der N SAA Kontrolle SY ist auf dem Flaschenetikett angegeben. Als Vertrauensbereich gilt der Sollwert ± 20 %. Am BN ProSpec System kann der Sollwert per Chargenangaben-Diskette (Bestell-Nr. OVLP) eingelesen werden. Der angegebene Sollwert dient zur Richtigkeitskontrolle. Bei der Verwendung als Präzisionskontrolle sollten in einer Vorperiode Kontrollwert und Kontrollgrenzen vom Anwender ermittelt werden. Wenn das Ergebnis der Kontrollmessungen außerhalb des Vertrauensbereichs liegt, ist die Kontrollbestimmung zu wiederholen. Wird die Abweichung durch die Wiederholungsmessung bestätigt, sollte eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Patientenergebnisse dürfen erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Ursache der Abweichung identifiziert und behoben wurde. Berechnung der Analysenergebnisse Die Auswertung erfolgt automatisch mittels einer Logit-Log-Funktion. Einschränkungen der Testdurchführung Trübungen und Partikel in den Proben können die Bestimmung stören. Deshalb müssen Proben, die Partikel enthalten, vor der Bestimmung zentrifugiert werden. Lipämische Proben, die durch Zentrifugation (10 min. bei ca x g) nicht zu klären sind, sind von der Bestimmung auszuschließen. Aufgrund von Matrixeffekten können für Kontroll- und Ringversuchsproben unterschiedliche Ergebnisse in Abhängigkeit von der verwendeten Bestimmungsmethode resultieren. Es kann daher notwendig sein, die Bewertung dieser Ergebnisse an methoden-spezifischen Zielwerten vorzunehmen. Referenzbereich In einer Population mit normalem Serum-CRP-Gehalt (95. Perzentile = 5,0 mg/l, n = 483) lag die 95. Perzentile für N Latex SAA bei 6,4 mg/l. Darüber hinaus sollte jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche ermitteln, da diese vielen Einflußgrößen unterliegen, die für jedes untersuchte Kollektiv verschieden sein können. Leistungsmerkmale der Bestimmung Empfindlichkeit Die Empfindlichkeit der Bestimmung wird durch die untere Grenze der Referenzkurve festgelegt und hängt damit von der Konzentration des Proteins im N SAA Standard SY ab. Spezifität Es sind keine Kreuzreaktionen des verwendeten Antikörpers bekannt. Präzision Bei der Bestimmung von drei SAA-Konzentrationen (ca. 7 mg/l, 55 und 192 mg/l) mit N Latex SAA am BN* System wurden mittels Varianzanalyse (n = 40) in Anlehnung an NCCLS Guideline EP5-A (8) Variationskoeffizienten (VK) für die Präzision in der Serie von 4,3 bis 6,2 % und von Tag zu Tag von 2,8 bis 4,7 % ermittelt. Die Gesamt VK lagen zwischen 5,4 und 6,4 %. Anmerkung Die angegebenen Werte für die Leistungsmerkmale der Bestimmung stellen typische Ergebnisse dar und sind nicht als Spezifikation für N Latex SAA anzusehen. Literatur Siehe Seite 1. BN ProSpec ist eine eingetragene Marke der in den USA, Deutschland und anderen Ländern. * BN ist eine Marke der in den USA. OQMP G11 C0540 (16) H 2 Ausgabe April 2003

3 Domaine d utilisation Réactifs pour la détermination quantitative de la Sérum Amyloïde A (SAA) dans le sérum et le plasma hépariné humain, par immunonéphélémétrie sensibilisée avec des particules sur les systèmes BN* II et BN ProSpec. Intérêt diagnostique La SAA est une protéine de la phase aiguë dont la réponse à un processus inflammatoire, infectieux ou non-infectieux, se traduit par une forte augmentation de sa concentration dans le sang en quelques heures. Sa concentration initiale peut être multipliée par La SAA est associée aux HDL (High Density Lipoprotein) et peut en modifier le métabolisme lors d inflammations. L intérêt particulier de la SAA réside dans le fait que ses produits de dégradation, les fibrilles amyloïdiques A (fibrilles AA), peuvent se déposer sur différents organes, révélant ainsi une complication grave des inflammations chroniques. L intérêt diagnostique du dosage de la SAA équivaut à celui de la protéine C-réactive (CRP) pour le dépistage des processus inflammatoires, l évaluation de leur activité ainsi que pour les contrôles d évolution et thérapeutiques. Par contre, pour la détection des infections virales, des réactions de rejet chez les transplantés rénaux, en particulier chez les patients immunodéprimés, ainsi que le suivi des patients souffrant de fibrose cystique sous cortico-thérapie, le dosage de la SAA est nettement plus prédictif que celui de la CRP (1, 2). Dans les cas d arthrites inflammatoires, la SAA était également le marqueur présentant la meilleure corrélation avec l activité de la maladie (3). Un dosage parallèle de CRP et de SAA permet d augmenter la sensibilité de la détection des infections (4). Chez les patients atteints d amyloïdose AA, un traitement axé sur la normalisation du taux de SAA peut améliorer l évolution de la maladie (5). Principe de la méthode Les particules de polystyrène recouvertes d anticorps anti-saa humaine s agglutinent lorsqu elles sont mélangées à un échantillon contenant de la SAA. L intensité de la lumière dispersée sur le système est proportionnelle à la concentration de SAA de l échantillon. L exploitation se fait par rapport à un standard de concentration connue. Réactifs Conditionnement N Latex SAA, code OQMP N SAA Réactif, 3 flacons pour 2 ml N SAA Standard SY (humain), 3 flacons pour 0,5 ml N SAA Contrôle SY (humain), 4 flacons pour 0,5 ml N SAA Réactif complémentaire, 3 flacons de 1,3 ml Composition et standardisation Le N SAA Réactif est composé d un lyophilisat de particules de polystyrène recouvertes d anticorps de mouton anti-saa humaine. Le N SAA Standard SY (humain) est préparé à partir de sérum humain enrichi en SAA. La concentration en SAA après reconstitution du Standard est indiquée sur l étiquette du flacon. Le N SAA Contrôle SY (humain) est préparé à partir de sérum humain enrichi en SAA. La concentration en SAA après reconstitution du Contrôle est indiquée sur l étiquette du flacon. Les concentrations du N SAA Standard SY et du N SAA Contrôle SY sont étalonnées par rapport au 1st International Standard 1997 Serum Amyloid A Protein Lot No. 92/680 (6). Le N SAA Réactif complémentaire est composé d une solution tampon NaCl-glycine, additionnée de pyrrolidone et de détergent. Agents de conservation : N SAA Réactif après reconstitution : gentamicine : 6,25 mg/l, amphotéricine : 0,625 mg/l N SAA Standard et N SAA Contrôle après reconstitution, et N SAA Réactif complémentaire : azide de sodium < 1 g/l Mises en garde et précautions d'emploi 1. A n'utiliser que pour un usage in vitro. 2. Les réactifs contenant de l'azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : Ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L'azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. 3. Tout don du sang prévu pour la préparation du N SAA Réactif, N Standard SY SAA ou du N Contrôle SY SAA a été testé vis-à-vis de l anticorps AgHBs, de l anticorps anti-vhc, de l anticorps anti-vih 1 et de l anticorps anti-vih 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Indépendamment de cela, toute préparation obtenue à partir de sang humain (par ex. sérum ou plasma de patient) doit être manipulée avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement un risque d infection (7). Préparation des réactifs N SAA Réactif : reconstituer le contenu d un flacon avec 2 ml d eau distillée. Le réactif est prêt à l emploi 15 mn après sa reconstitution. L agiter avec précaution avant emploi. N SAA Standard SY (humain) et N SAA Contrôle SY (humain): reconstituer le contenu d un flacon avec 0,5 ml d eau distillée. Mélanger avec précaution pour homogénéiser la solution. Le Standard et le Contrôle sont prêts à l emploi 60 mn après leur reconstitution. N SAA Réactif complémentaire : la solution est prête à l emploi. Stabilités et conditions de conservation Conservation à +2/+8 C : La date de péremption est indiquée sur l étiquette ; Stabilité après ouverture et reconstitution : 4 semaines (pour le N SAA Réactif, le N SAA Standard SY et le N SAA Contrôle SY reconstitués, ainsi que pour le N SAA Réactif complémentaire ouvert), à condition de bien refermer le flacon immédiatement après usage et de le replacer à +2/+8 C. Ne pas congeler les réactifs. Stabilité sur les systèmes BN* : Le N SAA Réactif et le N SAA Réactif complémentaire se conserve au moins 8 heures pendant 5 jours, ou sur une durée globale équivalente. Remarques : la stabilité on-board dépend du système BN* utilisé ainsi que des conditions d analyse du laboratoire. Pour plus d informations, se reporter aux manuels d utilisation des systèmes BN* II et BN ProSpec. La stabilité on-board du N SAA Contrôle SY sur le système BN ProSpec est indiquée dans le manuel d utilisation du système. Matériel et autres réactifs nécessaires Système BN* II ou BN ProSpec N-Diluant, code OUMT Cleaner SCS, code OQUB BN* II Bouchons anti-évaporation (usage facultatif), code OVLE Autres consommables et matériel selon les indications des manuels d utilisation des systèmes BN* II et BN ProSpec. Echantillons à tester Utiliser des échantillons humains sériques ou plasmatiques héparinés, de préférence frais (conservés 8 jours maximum à +2/+8 C), sinon congelés. Les échantillons doivent avoir été congelés dans les 24 heures suivant leur prélèvement et se conservent alors jusqu à 3 mois à < 25 C ; ne les congeler qu une seule fois. Les échantillons doivent être totalement coagulés, et ne plus contenir aucune particule ni trace de fibrine après centrifugation. Les échantillons lipémiques ou devenus troubles après décongélation, doivent être clarifiés par centrifugation (10 mn à env g) avant leur emploi dans le test. Réalisation du test Remarques : 1. Pour plus de précisions concernant l utilisation des systèmes BN*, se reporter au manuel d utilisation du système utilisé 2. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption. 3. N utiliser que des réactifs (Réactif, Standard, Contrôle et Réactif complémentaire) provenant de coffrets portant le même numéro de lot. 4. Respecter les temps de reconstitution indiqués pour les réactifs lyophilisés (au moins 15 mn pour le N SAA Réactif, et au moins 60 mn pour les N SAA Standard SY et N SAA Contrôle SY après l addition de l eau distillée). 5. Pour le dosage de la SAA sur le système BN* II, utiliser un rotor de cuvettes réservé à ce dosage. Ce dosage peut être combiné à ceux de la CRP et de la cystatine C avec les réactifs N High Sensitivity CRP et N Latex Cystatine C. Protocole du test sur les systèmes BN* Le protocole du test pour les échantillons sériques et plasmatiques est indiqué dans le manuel d utilisation du système utilisé ainsi que dans son logiciel. Toutes les étapes sont effectuées automatiquement par le système. Etablissement de la courbe d étalonnage La courbe d étalonnage est établie selon un étalonnage en plusieurs points. Le système prépare automatiquement les séries de dilutions du N SAA Standard SY avec le N-Diluant. Les dilutions du standard doivent être utilisées dans la demi-heure. La valeur-cible est indiquée sur l étiquette du flacon. Sur le système BN ProSpec, elle peut être lue par l intermédiaire de la disquette de données spécifiques à chaque lot (code OVLP). Une courbe d étalonnage reste stable 1 semaine. Pendant cette période, elle peut être utilisée aussi longtemps qu un contrôle d exactitude, par ex. le N SAA Contrôle SY, est trouvé à l intérieur du domaine de confiance. Une nouvelle courbe d étalonnage doit être établie à chaque changement de lot de réactif. Le domaine de mesure exact dépend de la concentration en ASL du lot de N SAA Standard SY utilisé. Des domaines de mesure types sont indiqués dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Mesure des échantillons de patients Les échantillons sont dilués automatiquement au 1/400 avec le N Diluant. Une fois dilués, ils doivent être testés dans les 2 heures. Si les valeurs mesurées sortent du domaine de mesure, refaire le dosage avec des dilutions plus élevées ou plus basses. Le protocole de retest avec d autres dilutions est décrit dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Contrôle de qualité interne Introduire le N SAA Contrôle SY à chaque établissement de courbe d étalonnage, lors de la première utilisation d un flacon de réactif, ainsi qu à chaque nouvelle série d échantillons. Le N SAA Contrôle SY est traité aussi bien dans le test que pour l exploitation des résultats comme un échantillon de patient. Il est dilué automatique au 1/400 avec le N Diluant et doit être testé dans les 30 minutes. La valeur-cible du N SAA Contrôle SY est indiquée sur l étiquette du flacon. Le domaine de confiance correspond à la valeur-cible ± 20 %. Sur le système BN ProSpec, elle peut être lue par l intermédiaire de la disquette de données spécifiques à chaque lot (code OVLP). La valeur-cible indiquée permet un contrôle d exactitude. Pour une utilisation du N SAA Contrôle SY comme contrôle de précision, déterminer au préalable la valeur de contrôle et les valeurs-limites propres au laboratoire. Si les valeurs mesurées pour le contrôle sortent du domaine de confiance, refaire le dosage du contrôle. Si la déviation est confirmée, établir une nouvelle courbe d étalonnage. Les résultats de patients ne peuvent alors être validés que si la cause de la déviation a été identifiée et supprimée. Calcul des résultats d analyse Les résultats sont calculés automatiquement selon une fonction log-log. Limites du test Les échantillons troubles ou contenant des particules peuvent perturber le test. Aussi les échantillons contenant des particules doivent-ils être centrifugés avant le test. Les échantillons lipémiques qui ne peuvent être clarifiés par centrifugation (10 mn à env g) doivent être éliminés. Les échantillons utilisés dans le cadre de contrôles nationaux peuvent, du fait d effets matriciels, donner des résultats différents selon la technique de dosage utilisée. Il peut dans ces cas-là être nécessaire d évaluer les résultats selon des valeurs-cibles spéciques à la méthode utilisée. Valeurs normales Dans une population avec des valeurs de CRP normales (95 ème percentile = 5,0 mg/l, n = 483), le 95 ème percentile pour le N Latex SAA a été trouvé à 6,4 mg/l. Il est cependant recommandé à chaque laboratoire d établir son propre domaine de référence dans la mesure où celui-ci est soumis à des facteurs d influence qui peuvent varier d un collectif à l autre. Caractéristiques du test Sensibilité La sensibilité du test est déterminée par la valeur-seuil inférieure de la courbe d étalonnage et dépend donc de la concentration en SAA du N SAA Standard SY. Spécificité Aucune réaction croisée avec l anticorps utilisé n a été observée. Précision Le dosage de trois concentrations différentes de SAA (env. 7 mg/l, 55 mg/l et 192 mg/l) à l aide du coffret N Latex SAA sur le système BN* a donné, par une analyse de variance selon la NCCLS Guideline EP5-A (8), des coefficients de variation (CV) de répétabilité compris entre 4.3 et 6.2% et de reproductibilité compris entre 2.8 et 4.7%. Le CV global était compris entre 5.4 et 6.4%. Remarque : les valeurs indiquées comme caractéristiques du test représentent des résultats types et ne doivent pas être considérées comme des valeurs spécifiques du test N Latex SAA. Littérature Voir page 1. BN ProSpec est une marque déposée de aux USA, en Allemagne et dans d autres pays. * BN est une marque de aux USA. OQMP G11 C0540 (16) H 3 Edition Avril 2003

4 Uso previsto Reagenti diagnostici in vitro per la determinazione quantitativa della Siero Amiloide A (SAA) nel siero umano e plasma eparinato, mediante nefelometria amplificata con particelle, con sistema BN* II e BN ProSpec. Significato diagnostico La SAA è una proteina della fase acuta. In risposta a processi infiammatori, infettivi ed anche non infettivi, la concentrazione della SAA nel siero aumento, in poche ore, fino a 1000 volte rispetto al suo livello normale. La SAA è associata alla high density lipoprotein (HDL) e può modificare il suo metabolismo durante il processo infiammatorio. Un aspetto particolarmente importante della SAA riguarda i prodotti di degradazione che possono essere depositati in vari organi come fibrille amiloidi A (AA) le quali costituiscono una seria complicazione delle malattie infiammatorie croniche. Come per la proteina C-reattiva (CRP), la determinazione della SAA è utile nella diagnosi dei processi infiammatori e la valutazione della loro attività così come nel monitoraggio di questi processi ed il loro trattamento. Tuttavia, nei pazienti con infezioni virali, nelle reazioni di rigetto in seguito a trapianti di fegato (soprattutto nei pazienti immunosoppressi) e nei pazienti con fibrosi cistica trattati con corticoidi, la determinazione della SAA è molto più significativa di quella della CRP (1,2). Nel caso di artrite infiammatoria, la SAA è strettamente correlata all attività di questa patologia (3). La determinazione parallela della CRP e della SAA può aumentare la sensibilità diagnostica delle infezioni (4). Nei pazienti affetti da Amiloidosi AA, il decorso di questa malattia può essere migliorato con una terapia atto a normalizzare il livello di SAA (5). Principio del metodo Le particelle di polistirene rivestite con anticorpi anti-saa umana, vengono agglutinate quando sono miscelate con campioni contenenti SAA. Questi aggregati diffondono un fascio di luce dopo aver attraversato il campione. L intensità della luce diffusa è proporzionale alla concentrazione della proteina presente nel campione. La valutazione del risultato avviene per confronto con uno standard a concentrazione nota. Reagenti Contenuto della confezione N Latex SAA, codice OQMP N Reagente SAA, 3 flaconi da 2 ml ciascuno N Standard SAA SY (umano), 3 flaconi da 0,5 ml ciascuno N Controllo SAA SY (umano), 4 flaconi da 0,5 ml ciascuno N Reagente supplementare SAA, 3 flaconi da 1,3 ml ciascuno Composizione e standardizzazione N Reagente SAA: è costituito da particelle di polistirene liofilizzate, rivestite con anticorpi anti-saa umana da pecora. N Standard SAA SY (umano): è prodotto da sieri umani con concentrazioni elevate di SAA. La concentrazione dello standard ricostituito è indicato sull etichetta. N Controllo per SAA SY (umano): è prodotto da sieri umani con concentrazioni elevate di SAA. La concentrazione del controllo ricostituito è indicata sull etichetta. La concentrazione dell N Standard SAA SY ed N Controllo SAA SY sono stati calibrati con riferimento al 1 st International Standard 1997 Serum Amyloid A Protein Lot No. 92/680 (6) N Reagente supplementare SAA. è costituito da una soluzione di tampone glicina-nacl contenente pirrolidone e detergenti come conservante. Conservanti: N Reagente SAA ricostituito gentamicina 6,25 mg/l, amfotericina 0,625 mg/l N Standard SAA SY ricostituito, N Controllo SAA SY ricostituito e N Reagente supplementare SAA sodio azide < 1 g/l) Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in vitro 2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose! La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive. 3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione di N Reagente SAA, N Standard SAA SY (umano) ed N Controllo SAA SY (umano) è stata esaminata per la ricerca dell HBsAg e degli anticorpi anti-hcv, anti-hiv1 e anti-hiv2. Solo i campioni risultati negativi vengono impiegati per la produzione. Tuttavia, poiché non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni (ad es. siero e plasma di paziente), tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico (7). Preparazione dei reagenti N Reagente SAA: ricostituire il contenuto liofilizzato di un flacone con 2 ml di acqua distillata e lasciar riposare per 15 minuti prima dell uso. Prima del primo utilizzo, agitare accuratamente per miscelare. N Standard SAA SY (umano) e N Controllo SAA SY (umano): ricostituire il contenuto liofilizzato del flacone con 0,5 ml di acqua distillata. Agitare delicatamente per miscelare. Attendere 60 minuti prima di utilizzarli N Reagente supplementare SAA: la soluzione è pronta all uso. Conservazione e stabilità Stabilità a +2/+8 C: vedi data di scadenza sull etichetta Stabilità dopo apertura: 4 settimana (N Reagente SAA ricostituito, N Standard SAA SY ricostituito, N Controllo SAA SY ricostituito ed N Reagente supplementare SAA), se conservati ben chiusi a +2/+8 C subito dopo l uso. Non congelare. Stabilità sui sistemi BN*: minimo 5 giorni per otto ore al giorno o periodo di tempo equivalente. Nota: La stabilità on-board dipende dai sistemi BN* utilizzati e dalle condizioni del laboratorio. Per maggiori informazioni fare riferimento al manuale d uso del sistema BN* II e BN Pro- Spec. La stabilità on-board dell N Controllo SAA SY sul sistema BN ProSpec è indicata nel manuale d uso del sistema. Materiale necessario ma non fornito Sistema BN* II o BN ProSpec N Diluente, codice OUMT Cleaner SCS, codice OQUB Tappi anti-evaporazione per BN* II (facoltativo), codice OVLE Altro materiale ed attrezzature come descritto nel manuale d uso dei sistemi BN* II o BN ProSpec Campioni in esame Si impiegano come campioni in esame sieri possibilmente freschi (conservati al massimo per 8 giorni a +2/+8 C) oppure conservati congelati. I campioni congelati possono essere conservati fino a 3 mesi (ad una temperatura di -25 C o inferiore) se vengono congelati entro 24 ore dal prelievo evitando ripetuti scongelamenti. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e, dopo centrifugazione, non devono contenere particelle o tracce di fibrina. I campioni lipemici o quelli congelati, che dopo scongelamento si presentino torbidi, prima del test, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 minuti a ca x g). Esecuzione del test Note 1. Per maggiori informazioni sull uso dello strumento, consultare il manuale d uso del sistema BN*. 2. I reagenti non devono essere utilizzati oltre la data di scadenza. 3. Utilizzare solo componenti (reagente, standard, controllo, reagenti supplementari) appartenenti a confezioni contrassegnate dallo stesso numero di lotto.) 4. Per i reagenti liofilizzati rispettare un tempo di ricostituzione sufficiente (almeno 15 min. dopo l aggiunta di acqua distillata per N Reagente SAA ed almeno 60 minuti per N Standard SAA SY ed N Controllo SAA SY). 5. Per la determinazione della SAA sul sistema BN* deve essere utilizzato un rotore separato. Il test può essere combinato con N High Sensitivity CRP ed N Latex Cistatina C. Protocollo analitico per i sistemi BN* Il protocollo analitico è riportato nel manuale d uso del sistema BN* e nel software dello strumento. Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento. Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento. Preparazione della curva di calibrazione Le curve di calibrazione vengono costruite con una calibrazione multi-punto. La serie di diluizioni dell N Standard SAA SY viene preparata automaticamente dallo strumento, utilizzando N Diluente. Le diluizioni dello standard devono essere utilizzate entro 30 minuti. Il valore teorico è indicato sull etichetta del flacone. Sul sistema BN ProSpec, tale valore può essere inserito tramite dischetto con i dati del lotto (codice OVLP). La curva di calibrazione, è valida 1 settimana e può essere utilizzata oltre tale periodo, finché il controllo di accuratezza, ad es. N Controllo SAA SY, rientra nell intervallo di accettabilità. Utilizzando un nuovo lotto o un nuovo flacone di reagente, è necessario preparare una nuova curva di calibrazione. L intervallo di misura dipende dalla concentrazione della proteina di ogni lotto di N Standard SAA SY. Per misure tipiche, fare riferimento al manuale d uso del sistema BN*. Valutazione dei campioni dei pazienti I campioni vengono diluiti automaticamente 1:400 con N Diluente. I campioni diluiti devono essere misurati entro 2 ore. Se il risultato ottenuto si trova al di fuori dell intervallo di misura, il test può essere ripetuto utilizzando una diluizione più alto o più bassa del campione. Per maggiori informazioni sulla ripetizione della misurazione con altre diluizioni, consultare il manuale d uso del sistema BN*. Controllo di qualità interno Impiegare l N Controllo SAA SY dopo la preparazione di ogni curva di calibrazione, al primo impiego di un flacone di reagente e con ogni serie di campioni. Come i campioni dei pazienti anche l N Controllo SAA SY viene diluito 1:400 con N Diluente e deve essere misurato entro 30 minuti. Il valore teorico dell N Controllo SAA SY è indicato sull etichetta. L intervallo di accettabilità è il valore teorico + 20%. I valore teorico può essere inserito nel sistema BN ProSpec tramite dischetto con i dati del lotto (codice OVLP).I valore teorico viene utilizzato come controllo di accuratezza. Se si utilizza come controllo di precisione, è necessario determinare prima il valore del controllo ed i limiti del controllo. Se il risultato del controllo si trova al di fuori dell intervallo di accettabilità, la determinazione deve essere ripetuta. Se anche questa seconda determinazione conferma la deviazione, è necessario preparare una nuova curva di calibrazione. Rilasciare i risultati dei pazienti, solo dopo aver identificato e rimosso le cause della deviazione. Risultati La valutazione dei risultati è eseguita in modo automatico mediante una funzione logit-log. Limitazioni della procedura I campioni torbidi o contenenti particelle possono influenzare il test. Pertanto, i campioni contenenti particelle, devono essere centrifugati prima del test. I campioni lipemici, che non possono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 min. a ca x g) non devono essere utilizzati per il test. A causa dell effetto matrice, i campioni delle indagini inter-laboratorio ed i campioni di controllo possono dare risultati differenti da quelli ottenuti con altri metodi. Pertanto è necessario valutare questi risultati in relazione ai valori di target specifici del lotto. Intervalli di riferimento In una popolazione con livelli normali di CRP (95 percentile = 5,0 mg/l, n= 483) il 95 percentile per N Latex SAA, è stato trovato a 6,4 mg/l. Tuttavia, ogni laboratorio dovrebbe determinare il proprio intervallo di riferimento, in quanto i valori possono variare a seconda della popolazione esaminata. Caratteristiche specifiche del test Sensibilità La sensibilità del test viene determinata dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende quindi dalla concentrazione dell analita nell N Standard SAA SY. Specificità Non sono note reazioni crociate dell anticorpo utilizzato. Precisione Nella determinazione di tre concentrazione di SAA (ca. 7, 55 e 192 mg/l) con N Latex SAA, sul sistema BN* sono stati trovati, con l aiuto dell analisi della varianza (n= 40) basata sulle NCLS Guideline EP5-T2 (8), coefficienti di variazione (CV) per la precisione intra-serie da 4,3 a 6,2% e coefficienti di variazione inter-serie da 2,8 a 4,7%. Il CV totale è risultato compreso tra 5,4 e 6,4%. Nota: I valori indicati per le caratteristiche specifiche de test rappresentano risultati tipici e non sono da considerarsi quali specifiche per l N Latex SAA. Bibliografia Vedi pagina 1. BN ProSpec è un marchio registrato della negli USA, in Germania e in altri Paesi. * BN è un marchio registrato della negli USA. OQMP G11 C0540 (16) H 4 Edizione Aprile 2003

5 N Látex SAA Campos de aplicación Reactivos de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de amiloide A sérico (SAA) en sueros humanos y plasmas heparínicos, por medio de inmunonefelometría con partículas intensificadoras usando los Sistemas BN* II y BN ProSpec. Significado diagnóstico El amiloide A sérico (SAA) es una proteína de fase aguda, que muestra, en un plazo de pocas horas un fuerte aumento de su concentración, como respuesta a procesos infecciosos y no infecciosos. El aumento puede llegar a ser hasta 1000 veces la concentración inicial. El SAA está asociado con la lipoproteína de alta pureza HDL y puede modificar su metabolismo en el caso de infecciones. Al SAA se le otorga un significado especial, ya que su producto de disociación, el amiloide A (AA) fibrilar se puede acumular en diferentes órganos ocasionando una complicación seria de infecciones crónicas. La utilidad diagnóstica de la determinación de SAA está, entre otros, en el reconocimiento, calculo de actividad, desarrollo y controles de terapias, para procesos infecciosos, de forma análoga a la proteína C reactiva (PCR). Por el contrario, la determinación de SAA es de más valor informativo que la determinación de PCR, en el registro de infecciones vírales, en reacciones de rechazo de transplantes de riñones, en especial para pacientes inmunosuprimidos, así como, para pacientes con fibrosis quística bajo terapéutica con corticoides (1, 2). También para la artritis inflamatoria muestra el SAA una mejor correlación con la actividad de la enfermedad (3). La determinación paralela de PCR y SAA puede aumentar la sensibilidad del reconocimiento de infecciones (4). En pacientes con amiloidosis AA una terapéutica destinada a la normalización del nivel de SAA puede mejorar el desarrollo (5). Principio del método Las partículas de poliestireno recubiertas con anticuerpos contra SAA humana, al mezclarse con las muestras que contienen SAA forman agregados en los cuales se va a dispersar el rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada en el nefelómetro depende de la concentración de la correspondiente proteína en la muestra. La valoración se efectúa por comparación con un estándar de concentración conocida. Reactivos Contenido del envase comercial N Látex SAA, N de pedido OQMP N Reactivo SAA, 3 frascos c/u para 2 ml N Estándar SY-SAA (humano), 3 frascos c/u para 0,5 ml N Control SY-SAA (humano), 4 frascos c/u para 0,5 ml N Reactivo adicional SAA, 3 frascos c/u con 1,3 ml Composición y estandarización El N Reactivo SAA es un liofilizado de partículas de poliestireno recubiertas con anticuerpos de oveja contra SAA humana. El N Estándar SY-SAA (humano) se fabrica en base a sueros humanos con una concentración elevada de SAA. La concentración de SAA, después de la reconstitución del estándar, viene dada en la etiqueta del frasco. El N Control SY-SAA (humano) se fabricar en base a sueros humanos con una concentración elevada de SAA. La concentración de SAA, después de la reconstitución del control, viene dada en la etiqueta del frasco La concentración del N Estándar SY-SAA y del N Control SY-SAA se va a calibrar en relación al 1st International Standard 1997 Serum Amyloid A Protein Lot No. 92/680 (6). El N Reactivo adicional SAA está formado por una solución tampón de glicina-nacl a la que se le ha añadido pirrolidona y detergentes. Medios de conservación: N Reactivo SAA después de la reconstitución: Gentamicina: 6,25 mg/l, Anfotericina: 0,625 mg/l Reactivos N Estándar SAA y N Control SAA, después de la reconstitución, así como, el N Reactivo adicional SAA: Azida sódica < 1 g/l Advertencias y medidas de seguridad 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro. 2. En el manejo de diagnósticos in-vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente regla: No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo. 3. Cada donación individual de sangre, destinada a la preparación del N Reactivo SAA, N Estándar SY-SAA (humano) y del N Control SY-SAA (humano), ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 y anti-hiv2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos. Independientemente de esto, todos los muestras obtenidos a partir sangre humana (por ej., sueros y plasmas de pacientes) deben ser manipuladas con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos (7). Preparación de reactivos N Reactivo SAA: Reconstituir el liofilizado contenido en un frasco con 2 ml de agua destilada. El reactivo se puede utilizar 15 min. después de reconstituido y debe agitarse cuidadosamente, antes de usarse por primera vez. N Estándar SY-SAA (humano) y N Control SY-SAA (humano): Disolver el liofilizado contenido en el frasco en 0,5 ml de agua destilada. Mezclar la solución cuidadosamente por agitación. Después de 60 min. está el estándar o el control listo para ser usado. N Reactivo adicional SAA: La solución viene lista para el uso. Estabilidad y condiciones de almacenamiento Almacenamiento entre +2 y +8 C La fecha de vencimiento viene dada en la etiqueta. Estabilidad después de abierto: 4 semanas (el N Reactivo SAA reconstituido, N Estándar SY-SAA reconstituido y el N Control SY- SAA reconstituido, así como también, el N Reactivo adicional SAA), siempre que las soluciones inmediatamente después de ser empleadas, se guarden en recipientes perfectamente cerrados y se mantengan entre +2 y +8 C. Los reactivos no se deben congelar. Estabilidad en los sistemas BN*: El N Reactivo SAA y el N Reactivo adicional SAA mínimo 5 días, ocho horas por día o un periodo de tiempo comparable. Advertencia: La estabilidad on board depende del sistema BN* utilizado, así como de las condiciones del laboratorio. Para más información consultar las instrucciones de manejo de los sistemas BN* II y BN ProSpec. La estabilidad on board del N Control SY-SAA en el sistema BN ProSpec viene dada en las instrucciones de manejo del sistema. Material adicional necesario Sistemas BN* II o BN ProSpec N Diluyente, N de pedido OUMT Cleaner SCS, N de pedido OQUB Tapón protector de evaporación para el BN* II (opcional), N de pedido OVLE Materiales e instrumental necesarios como está descrito en las instrucciones de manejo de los sistemas BN* II o BN ProSpec. Material a investigar Para las medidas se deben usar, en lo posible, muestras de suero frescas, (máx. conservadas 8 días entre +2 y +8 C) o muestras de suero humano conservadas congeladas y muestras de plasmas heparínicos. Si las muestras se congelan dentro de las 24 horas siguientes a su toma, éstas se pueden almacenar congeladas por debajo de 25 C hasta 3 meses, siempre que se evite su repetida congelación y descongelación. Las muestras deben estar completamente coaguladas y no deben contener partículas o restos de fibrina, después de la centrifugación. Las muestras lipémicas o las muestras congeladas, que presenten turbidez después de su descongelación, deben ser aclaradas por centrifugación (10 min. a aprox x g) antes de empezar la determinación. Procedimiento Advertencias: 1. Los detalles sobre el manejo de los sistemas BN* se deben tomar del correspondiente manual de operaciones. 2. Los reactivos sólo se deben utilizar hasta la fecha de vencimiento dada en la etiqueta. 3. Sólo se deben combinar componentes del testkit (Reactivo, Estándar, Control y Reactivos adicional) que tengan el mismo número de lote. 4. Mantener los tiempos de reconstitución de los reactivos liofilizados (por lo menos 15 min. para el N Reactivo SAA y 60 min. para en N Estándar SY-SAA o para el N Control SY-SAA después de agregar el agua dest.). 5. Para la determinación de SAA en los sistemas BN* II se debe utilizar un rotor de cubetas propio. La determinación se puede combinar con N High Sensitivity CRP y N Látex Cistatina C. Protocolos del test en los sistemas BN* Los protocolos de ensayo para sueros y plasmas vienen descritos en las correspondientes instrucciones de manejo, así como también, en el software del aparato correspondiente. Todas las etapas van a ser realizadas por el sistema de forma completamente automática. Preparación de la curva de referencia Las curvas de referencia se hacen sobre una calibración de varios puntos. Para su elaboración se preparan automáticamente una serie de diluciones del N Estándar SY-SAA con el N diluyente. Las diluciones del estándar deben ser usadas dentro de la media hora siguiente. El valor teórico viene dado en la etiqueta del frasco correspondiente. En el sistema BN ProSpec se debe leer en el disquete de datos sobre el lote (N de pedido OVLP). La curva de referencia es válida para 1 semana. Esta curva puede ser utilizada por más tiempo, siempre que el N Control SY-SAA se encuentre dentro de su rango de confianza al repetir la medida. Al utilizar un nuevo lote de reactivos se debe hacer una nueva curva de referencia. El rango exacto de medida depende de la concentración del analito en cada lote del N Estándar SY- SAA. Rangos de referencia típicos vienen descritos en el manual de operaciones del sistema BN* correspondiente. Medida de las muestras de pacientes Las muestras van a ser automáticamente diluidas 1:400 con N Diluyente y deben ser utilizadas dentro de las 2 horas siguientes. Para valores que se encuentren por fuera del rango de medida, se puede repetir la medición con una dilución mayor o menor de la muestra. La repetición de las medidas a otras diluciones de las muestras vienen descrita en las instrucciones de manejo de los sistemas BN*. Control de calidad interno El N Control SY-SAA se debe usar, en la elaboración de cada curva de referencia, al usar un frasco del reactivo por primera vez, así como también, con cada serie de muestras. El N Control SY-SAA se trata en su preparación y valoración como una muestra de paciente, diluyéndose automáticamente 1:400 con N Diluyente y debe también ser medido dentro de los 30 minutos siguientes. El valor teórico del N Control SY-SAA viene dado en la etiqueta del frasco. Como rango de confianza es válido el valor teórico ± 20 %. En el sistema BN ProSpec se puede leer el valor teórico en el disquete de datos sobre el lote (N de pedido OVLP). Los valores teóricos dados sirven como controles de exactitud. Para utilizarlos como controles de presición el usuario debe, en un tiempo previo, determinar los valores de control y los límites de control. Cuando los resultados de las medidas de control se encuentren por fuera del rango de confianza, se debe repetir la determinación del control. Si al repetir la medida se confirma la desviación, se debe realizar una nueva curva de referencia. Los resultados de los pacientes solamente se pueden dar, cuando se encuentre y se elimine la causa de esta desviación. Cálculo de los resultados del análisis Los resultados se calculan automáticamente mediante una función log-logit. Limitaciones del Procedimiento La presencia de turbidez o partículas en la muestra puede alterar la determinación, por lo cual, las muestras que contienen partículas deben ser centrifugadas antes de la determinación. Muestras altamente lipémicas que no se puedan aclarar por centrifugación (10 min. a x g), deben ser excluidas de la determinación. Debido a los efectos matriz, las muestras control y las muestras para analizar inter-laboratorios pueden producir resultados diferentes, dependiendo del método utilizado para la determinación. Por esta razón es necesario evaluar estos resultados en relación con valores objetivo específicos del método. Valores esperados Para una población con un contenido normal de PCR en el suero (95. percentile = 5,0 mg/l, n = 483) se encontró el 95. percentile para el N Látex SAA en 6,4 mg/l. Sin embargo, cada laboratorio deberá determinar su propio rango de referencia, ya que éste está influenciado por muchos factores, los cuales pueden ser diferentes para cada colectivo estudiado. Características del test Sensibilidad La sensibilidad de la determinación va a estar fijada por el límite inferior de la curva de referencia y depende de la concentración de la proteína en el N estándar SY-SAA. Especificidad No se conocen reacciones cruzadas entre los anticuerpos utilizados. Precisión En la determinación de 3 concentraciones de SAA (aprox. 7 mg/l, 55 y 192 mg/l) con el N Látex SAA en los sistemas BN * se obtuvieron, mediante análisis de varianza (n= 40) en base a las NCCLS Guideline EP5-A (8), coeficientes de variación (CV) de 4,3 hasta 6,2%, para la precisión en la serie (n = 20) y de 2,8 hasta 4,7% en la determinación día a día. El CV total se encontró entre 5,4 y 6,4%. Nota: Los valores dados para las características del test representan valores típicos y no se deben tomar como especificaciones para el N Látex SAA. Bibliografía Ver página 1. BN ProSpec es una marca de fábrica registrada de en USA, Alemania y en otros países. * BN es una marca de fabrica de en USA. OQMP G11 C0540 (16) H 5 Edición Abril 2003