INMUNODIAGNOSTICO EN VETERINARIA. PRINCIPIOS Y APLICACIONES.

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1 INMUNODIAGNOSTICO EN VETERINARIA. PRINCIPIOS Y APLICACIONES. Autores: Lic. Sandra Cuello Portal, MSc.* y Lic. Ileana Rosado Ruiz-Apodaca, DrC.** * Grupo Virología, ** Grupo Biología Molecular-Bacteriología, CENSA. Prólogo. Las enfermedades infecciosas de los animales continúan siendo la principal amenaza a las especies productoras de alimentos en nuestro país y región. La rapidez y calidad del diagnóstico de laboratorio condiciona el éxito en la prevención y control de las mismas. Este documento reúne las técnicas serológicas más usadas en el diagnóstico veterinario compilando buena parte de la experiencia práctica disponible en la literatura científica universal y las experiencias personales de los científicos de nuestro centro que se desarrollan en la actividad. Está dirigido a profesionales, técnicos y estudiantes que se inician en el diagnóstico de laboratorio e investigación en el área veterinaria. Contiene aspectos generales sobre inmunología que permiten comprender el principio de las técnicas de diagnóstico inmunológico y la interpretación de sus resultados, así como elementos prácticos importantes a tener en cuenta en el uso de animales de laboratorio para obtener de forma satisfactoria los inmunosueros. En la última parte se hace referencia a técnicas moleculares que a pesar de los requerimientos técnicos (equipos y reactivos) que limitan su uso de forma extensiva en los laboratorios de diagnóstico veterinario de la red nacional, ofrecen una especificidad y sensibilidad mayor si se comparan con las técnicas serológicas. 1

2 INDICE 1. Elementos generales de Inmunologia La respuesta inmune 1.2. Antígenos. Características esenciales Moléculas de anticuerpos Características respuesta primaria y secundaria Reacción antígeno-anticuerpo. 2. Aspectos generales para el diagnóstico inmunológico Preparación de inmunógenos Producción de anticuerpos Policlonales Monoclonales. Su utilidad en el diagnóstico Preparación de conjugados. 3. Métodos de diagnóstico serológico Técnicas de aglutinación Seroaglutinación rápida en láminas Aglutinación en látex Inhibición de la hemoaglutinación Hemoaglutinación pasiva o indirecta 3.2. Técnicas de precipitación Inmunodifusión o difusión en gel de agar Técnicas inmunoenzimáticas Inmunoblotting o Western blot Inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa Neutralización Fijación de complemento. 4. Métodos de diagnóstico molecular Hibridación molecular Sondas de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa. 5. Referencias. 2

3 1.- Elementos generales sobre inmunología La respuesta inmune. La principal función del sistema inmune es proteger a los animales de organismos infecciosos y sus productos tóxicos. Este sistema involucra un amplio rango de mecanismos para localizar células extrañas, virus o macromoléculas, neutralizar estos invasores y eliminarlos por medio de proteínas y células que circulan, a través del cuerpo. Los diferentes mecanismos que constituyen esta vigilancia pueden ser divididos en dos categorías: Inmunidad no adaptativa o inmunidad innata e Inmunidad adaptativa o adquirida. Los sistemas inmune innato y adaptativo están formados por una serie de células, distribuidas por todo el organismo cuyas funciones se enumeran a continuación: Factores solubles Inmunidad Innata (inespecífica) Resistencia no mejorada por infección repetida Lisozima, proteínas de fase aguda ejemplo: interferon Inmunidad adaptativa (específica) Resistencia mejorada por infección repetida. Anticuerpos Células Fagocitos, células NK Linfocitos T La inmunidad no adaptativa actúa como una primera línea de defensa frente a los agentes infecciosos y la mayoría de los patógenos pueden controlarse antes que produzcan una infección declarada, es mediada por células que responden no específicamente a las moléculas foráneas e incluye sistemas como la fagocitosis, secreción de lisozimas y lisis celular por las células NK (del inglés natural killer). La inmunidad no adaptativa no aumenta por repetidas exposiciones a la molécula foránea. La fagocitosis ocurre por células fagocitarias de la estirpe monocitos/macrófago. Estas células son de diferentes tipos pero todas ellas se derivan de las células primordiales de la médula ósea y su función es englobar partículas, fagocitarlas y destruirlas. Las células NK (agresoras naturales) son leucocitos que pueden reconocer los cambios de la superficie celular que se producen en algunas células infectadas y en ciertas células tumorales. Las células NK se unen a estas células diana y las destruyen. Esta reacción se denomina citotoxicidad. 3

4 Si estas primeras defensas quedan superadas, se activa el sistema inmune adaptativo y se elabora una reacción específica para cada agente infeccioso que puede ser aumentada por reexposición. El sistema inmune adaptativo guarda memoria del agente infeccioso y puede impedir que cause enfermedad más tarde; por lo tanto sus características claves son la especificidad y la memoria. La respuesta de este sistema es mediada por células llamadas linfocitos T o B. Los linfocitos B secretan proteínas que se unen específicamente a moléculas foráneas. Las mismas son secretadas y conocidas como anticuerpos que forman parte de un grupo, el de las inmunoglobulinas, muy relacionado entre sí, englobado en las proteínas séricas. Para realizar su función se distribuyen en la sangre (respuesta inmune humoral) o atraviesan las mucosas que llegan a la superficie de estas (respuesta inmune de las mucosas). Los términos inmunoglobulina y anticuerpos son usados indistintamente. Los linfocitos T sintetizan receptores de superficie celular y juegan su papel destruyendo células con alteraciones en la superficie y produciendo linfoquinas. Las linfoquinas son sustancias, que entre otras cosas, activan a los macrófagos y mejoran la respuesta de los linfocitos B. Cualquier molécula que pueda unirse a un anticuerpo es conocida como antígeno. Cuando una molécula es usada para inducir una respuesta adaptativa es llamada inmunógeno. Los términos antígeno e inmunógeno son usados para describir diferentes propiedades de una molécula. Inmunogenicidad, no es una propiedad intrínseca de cualquier molécula, está definida sólo por su habilidad para inducir una respuesta adaptativa. La antigenicidad tampoco es una propiedad intrínseca de las moléculas sino que esta definida por su habilidad a unirse a un anticuerpo Antígenos. Características esenciales. Pueden funcionar como antígenos, péptidos, microorganismos y moléculas extrañas como proteínas, polisacáridos o carbohidratos, pero deben de cumplir con algunas características para garantizar su inmunogenicidad. El tamaño molecular es una de ellas; moléculas de talla grande son mejores inmunógenos que las de talla pequeña (menos de 1000 Da). La conjugación o unión covalente de estas últimas, denominadas haptenos, con moléculas de mayor peso molecular, denominadas transportadores ( carrier ) puede provocar una respuesta inmune en el animal, y una vez formados los elementos de respuesta (anticuerpo y linfocitos sensibilizados) se unirán a ellos sin necesidad de estar acopladas a su acarreador. 4

5 La complejidad de las moléculas es otro elemento importante, mientras más compleja mejor antígeno resulta. Por ejemplo el almidón y otros polisacáridos repetitivos son pobres antígenos a diferencia de complejos lipopolisacáridos de bacterias. La estabilidad estructural o degradabilidad de una sustancia también define su capacidad de estimular una respuesta inmune aún siendo extraña compleja y de talla adecuada. Moléculas inestables y que se destruyen muy rápidamente tampoco son buenas como inmunógenos y deben ser aplicadas con adyuvantes. Las regiones de un antígeno que interactúan con un anticuerpo son definidas como epitopos o determinantes antigénicos. Estructuralmente estos son sitios definidos que por lo general asocian aproximadamente 14 aminoácidos. Para una molécula determinada de antígeno, el número de sitios antigénicos dispuestos en la superficie de la molécula determina la valencia del antígeno, que crece con las dimensiones de la molécula antigénica Moléculas de anticuerpos. Una de las principales respuestas del organismo contra un antígeno foráneo es la inmunidad humoral caracterizada por la producción de anticuerpos por los linfocitos B. Actualmente se sabe que en este proceso intervienen dos tipos diferentes de moléculas: las inmunoglobulinas y los receptores antígeno específicos de las células T. La diversidad y la heterogeneidad son rasgos característicos de estas dos familias de moléculas capaces de reconocer a numerosos antígenos distintos. Están presentes en el suero y líquidos orgánicos y son producidos en grandes cantidades por las células plasmáticas. Los anticuerpos son glicoproteínas, que pertenecen a la familia de las globulinas, y quizás la característica más sobresaliente de éstas, es que actúan como puente entre una diversidad de antígenos prácticamente ilimitada (existen varios millones de antígenos potenciales) y un número finito de mecanismos efectores destinados a la eliminación física del agente invasor. Las inmunoglobulinas son proteínas tetraméricas compuestas por una o más copias de una unidad característica que se visualiza en forma de Y. Cada molécula contiene cuatro polipéptidos: dos copias idénticas de un polipéptido conocido como cadena pesada y dos copias idénticas de uno conocido como cadena ligera, unidos entre ellos por enlaces disulfuro inter e intracatenarios. 5

6 Para cumplir su doble función de unirse al antígeno, que puede ser muy variable, y a la vez llevar a cabo su función biológica de eliminarlo, las inmunoglobulinas deben tener una estructura adecuada con una región variable o sitios de combinación con el antígeno (paratopos) y una región constante o efectora de las funciones biológicas, que condiciona la ocurrencia de ciertas reacciones secundarias, como la unión a los tejidos y moléculas del huésped incluyendo diversas células del sistema inmunitario, células fagocíticas y el primer componente del sistema clásico del complemento, y la mayor efectividad de algunos inmunoensayos. Figura 1. Dominios inmunoglobulínicos. Cada asa de la cadena peptídica, formada por un enlace disulfuro intracatenario, representa un solo dominio y estos se denominan V H y C H, etc., como se indica. El extremo aminoterminal de la molécula hasta el aminoácido 110 constituye la región variable, dentro de la que se encuentran zonas hipervariables con una alta frecuencia de variación entre los aminoácidos que aparecen en esta región y son estos aminoácidos los que directamente se combinan con el antígeno. Los anticuerpos están divididos en 5 clases según el número de unidades Y y el tipo de cadena pesada que contengan, así existen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Las diferencias en este sentido determinan la participación de cada clase en diferentes tipos de respuesta inmune y un estado particular de la maduración de la respuesta tal como se muestra en la tabla siguiente: 6

7 Tabla 1. Principales clases de las inmunoglobulinas. Características IgG IgM IgA IgE IgD Cadena pesada γ µ α ξ δ Cadena ligera κ o λ κ o λ κ o λ κ o λ κ o λ Fórmula Molecular Estructura Y γ 2 κ 2 o γ 2 λ 2 (µ 2 κ 2 ) 5 o (α 2 κ 2 ) n o ξ 2 κ 2 o ξ 2 λ 2 δ 2 κ 2 o δ 2 λ 2 (µ 2 λ 2 ) 5 (α 2 λ 2 ) n Valencia para la unión del antígeno Concentración en suero Función , 4 o mg/ml 0,5-2 mg/ml 1-4 mg/ml ng/ml 0-0,4 mg/ml Respuesta secundaria Respuesta primaria Protección en las mucosas de las membranas Protección contra los parásitos ( ) n = 1, 2 o 3 Las moléculas de inmunoglobulinas de estas clases difieren también unas de otras en tamaño, carga, composición de aminoácidos y contenido de carbohidratos. Cada clase de inmunoglobulina tiene a su vez subclases determinadas también por el tipo de cadena pesada Características respuesta primaria y secundaria. Cuando un animal recibe un estímulo antigénico las células de su sistema inmune reconocen al antígeno y producen una reacción inmunitaria. Esta reacción inmunitaria puede adoptar la forma de inmunidad mediada por células o implicar la producción de anticuerpos dirigidos contra el antígeno. El tipo de reacción dependerá del modo como se presenta el antígeno a los linfocitos y muchas reacciones inmunológicas muestran ambas clases de respuesta. En el segundo y subsiguientes contactos con el antígeno, el tipo de 7

8 respuesta depende en gran parte del resultado de la primera estimulación antigénica; pero la cantidad y la calidad de las respuestas son diferentes. La capacidad para desarrollar una respuesta secundaria se basa en la memoria inmunológica y constituye el fundamento del proceso de vacunación. La base celular de dicha memoria es la expansión de las poblaciones linfocitarias antígeno específicas durante la respuesta primaria, de modo que exista el mayor número de linfocitos B y T capaces de responder a ese antígeno. Las células B maduras difieren cualitativamente de sus homónimas no preparadas (linfocito inmaduro) porque aquellos son capaces de fabricar IgG con mayor rapidez y tienen generalmente una mayor afinidad hacia los receptores antigénicos a causa de la selección realizada durante la respuesta primaria. De forma general la respuesta de anticuerpos tiene las siguientes fases: 1. Fase de latencia durante la cual no se detectan anticuerpos. 2. Fase de incremento en la que el título de anticuerpos se eleva de forma logarítmica. 3. Fase de meseta, se estabiliza el título de anticuerpos. 4. Fase de descenso en la que los anticuerpos son catabolizados o se unen al antígeno y son eliminados de la circulación. El análisis de las respuestas consecutivas a los contactos antigénicos primario y secundario demuestran que esas respuestas difieren en cuatro aspectos principales: Evolución cronológica. La respuesta secundaria tiene una fase de latencia más corta, una meseta y una fase de descenso prolongadas. Título de anticuerpos. El nivel de anticuerpos durante la meseta es mucho más alto en la respuesta secundaria, generalmente 10 veces superior, al nivel alcanzado en la fase de meseta de la respuesta primaria. Clase de anticuerpos. En la respuesta primaria los anticuerpos IgM constituyen una proporción principal, mientras que la respuesta secundaria se compone casi por completo de anticuerpos IgG. Afinidad de los anticuerpos. La afinidad de los anticuerpos es por lo común mucho mayor en la respuesta secundaria. Esta es la denominada "maduración de la afinidad". Las características generales de las respuestas primarias y secundarias se resumen en la tabla siguiente: 8

9 Tabla 2: Características generales de las respuestas primarias y secundarias. Características Respuesta primaria Respuesta secundaria Intervalo después de 5-10 días 1-3 días la inmunización Pico de respuesta Pequeño Grande Isotipo IgM > IgG IgG, IgA e IgE Afinidad Baja muy variable Alta (maduración de la afinidad) Inducido por Todos los inmunógenos Sólo antígenos proteicos Inmunización Altas dosis, optimizado por adyuvantes Bajas dosis, usualmente no necesita adyuvante Reacción antígeno anticuerpo En la interacción antígeno anticuerpo se basan todas las técnicas inmunoquímicas. Depende enteramente de interacciones no covalentes que incluyen puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones electrostáticas y enlaces hidrofóbicos. La afinidad es una medida de la fortaleza de unión de un epitope a un anticuerpo. Por la naturaleza no covalente y reversible de esta unión sigue termodinámicamente los principios de una interacción bimolecular reversible donde la constante de afinidad Ka se describe como: Ka = [ Ac - Ag] / [Ac] x [Ag] [Ac] = concentración molar de los sitios de unión no ocupados del anticuerpo. [Ag] = Concentración molar de los sitios de unión no ocupados del antígeno. [Ac - Ag] = concentración molar del complejo antígeno anticuerpo. En términos prácticos la afinidad describe la cantidad de complejos antígeno-anticuerpo que pueden ser encontrados en el equilibrio. Anticuerpos de alta afinidad pueden unirse a una gran cantidad de antígenos en un período de tiempo menor que los de baja afinidad; lo que indica que en las interacciones de alta afinidad hay un buen reconocimiento de los epitopes por los paratopes del anticuerpo. 9

10 La afinidad de la interacción Ag-Ac puede ser afectada por cambios en la temperatura, el ph y el solvente, elementos a observar en los ensayos inmnoquímicos. En función de la afinidad del anticuerpo la formación del complejo puede ser manipulada variando la concentración de antígeno o de anticuerpo. Pequeños cambios en la estructura del antígeno pueden afectar profundamente la fortaleza de interacción antígeno anticuerpo. Se describe que la pérdida de un simple puente de hidrógeno en la interfase puede reducir la fuerza de interacción mil veces. La avidez es una medida de la estabilidad de la unión Ag-Ac, aspecto que determina el éxito de los ensayos inmunoquímicos. Como habíamos visto, los anticuerpos por su estructura tienen más de un sitio de unión con el antígeno, es decir son multivalentes (tabla 1), por ejemplo las IgG y algunas IgA son bivalentes y las IgM son decavalentes. Por su parte, los antígenos son multivalentes cuando contienen varios epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos diferentes o múltiples copias de un mismo epitopo como es el caso de los homopolímeros que se usan en algunos ensayos. Cuando los anticuerpos y antígenos forman complejos multivalentes la fuerza de interacción aumenta grandemente haciendo la reacción prácticamente irreversible. A continuación ilustramos algunos ejemplos: Fig. 2. Uniones bivalentes de anticuerpos a antígenos poliméricos incrementan la avidez. Este tipo de interacción puede ocurrir en todas las técnicas inmunoquímicas. 10

11 Fig. 3. Anticuerpos policlonales que se unen a un antígeno y tiene múltiples epitopos formando un gran complejo multimérico. Esto ocurre en reacciones de inmunoprecipitación. Fig. 4. Anticuerpos policlonales unidos a un antígeno que tiene múltiples epitopos creando un buen blanco para uniones multiméricas o reactivos secundarios. Es útil en muchas técnicas inmunoquímicas que emplean reactivos secundarios. Fig. 5. Antígenos inmovilizados sobre un soporte sólido a altas concentraciones promueven una alta avidez. Está presente en inmunoblotting y otros ensayos. 11

12 Como los anticuerpos pueden reconocer regiones relativamente pequeñas de un antígeno, ocasionalmente pueden reaccionar con epitopos similares en otras moléculas. Esta es la base de las reacciones cruzadas que pueden ocurrir en las técnicas inmunoquímicas y que por lo general resultan indeseables. Aunque epitopes similares pueden encontrarse en moléculas relacionadas esto no implica una relación funcional entre las mismas. 2.- Aspectos generales para el diagnóstico inmunológico Preparación de inmunógenos. Como habíamos señalado, proteínas, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos y otros compuestos sintéticos o naturales pueden actuar como poderosos inmunógenos, pero resulta importante seleccionar la forma de presentación de los mismos al animal para lograr una fuerte y apropiada respuesta. En la preparación de un antígeno el primer aspecto a tener en cuenta es el grado de pureza que debe tener el mismo en función del objetivo del anticuerpo resultante de la inmunización. Si se quiere obtener un anticuerpo de alta especifícidad que sólo reconozca al antígeno apropiado entonces es esencial que el antígeno sea purificado o que la preparación de antígeno sea utilizada para obtener anticuerpos monoclonales. La purificación puede realizarse por extracción diferencial, fraccionamiento subcelular o por técnicas de cromatografía. Cuando se usan antígenos proteicos si el polipéptido de interés puede verse como una sola banda en geles de poliacrilamida, la banda cortada del gel puede ser utilizada como inmunógeno con buena respuesta. Cuando los anticuerpos que se quieren lograr no requieren de alta especificidad pueden utilizarse preparados antigénicos sin purificar. Debe tenerse en cuenta que en una mezcla de antígenos la inmunogenicidad de los compuestos varía, así los anticuerpos producidos contra algunos de los compuestos pueden dominar la respuesta. Esto puede determinarse sólo de forma empírica. La fuente del antígeno determina en última instancia los procedimientos a emplear para la extracción del mismo y su purificación de ser necesario. Diferentes métodos han sido empleados para la obtención de antígenos y en la mayoría de los casos se utilizan combinaciones de los mismos. Es importante tener en cuenta que el método o los métodos seleccionados para la obtención del antígeno no produzcan alteraciones o la 12

13 desnaturalización del mismo porque esto se reflejará en la especificidad de los anticuerpos inducidos por la proteína alterada o desnaturalizada. Diversos métodos han sido empleados en la obtención y purificación de antígenos. De forma general entre los métodos más empleados podemos citar: Congelación y descongelación. Durante este proceso se forman cristales de hielo que rompen la membrana de la célula, liberando su contenido al medio externo. Sonicación. El empleo de ondas sónicas produce implosión y cavitación de los tejidos desintegrándolos. La sonicación se lleva a cabo por debajo de 18 amplitudes. Se debe de tener precaución para evitar el exceso de calor y la formación de espuma en el material sometido a la sonicación. Maceración. En este procedimiento los tejidos se maceran ejerciendo movimientos de rotación y hacia abajo en un mortero. En ocasiones para lograr una mejor destrucción del tejido es necesario añadir al material a macerar arena de mar, polvo de vidrio, etc. Precipitación con sulfato de amonio. Es muy utilizado en la separación de la inmunoglobulinas de los demás componentes del suero. También es utilizado en la obtención de antígenos virales solubles. Filtración. Permite la separación de restos celulares de las fracciones solubles, que dependen del tamaño del poro del filtro o de las membranas utilizadas que retienen moléculas de diferentes pesos moleculares. Centrifugación. Permite la separación de restos celulares de las fracciones solubles de acuerdo a las gravedades a las cuales se centrífuga la muestra. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Permite la migración a través de un gel de las moléculas de acuerdo a su tamaño en presencia de un campo eléctrico. Los antígenos bacterianos de acuerdo con el lugar donde se localizan pueden clasificarse en: antígenos capsulares, antígenos de la pared (somáticos), antígenos flagelares y toxinas de excreción. La naturaleza química de los mismos es proteica y polisacarídica en el caso de los capsulares y gluco-lipoproteica para los somáticos. Como inmunógenos bacterianos pueden ser utilizadas células completas, fracciones celulares puras (cápsula, pared, flagelos, etc) o proteínas específicas puras. Estos mismos elementos pueden ser utilizados como antígenos en los ensayos inmunoquímicos dependiendo de los propósitos y exigencias de la técnica; por ejemplo los antígenos somáticos son utilizados en técnicas de aglutinación o precipitación como es el caso de la inmunofluorescencia e inmunotransferencia, mientras que los antígenos solubles son empleados en técnicas de inmunodifusión y el ELISA. 13

14 Los antígenos virales pueden ser preparados a partir de partículas virales purificadas o de proteínas específicas de la cápsida, tanto para ensayos inmunoquímicos como para inmunógenos. En la actualidad se emplean con frecuencia los antígenos y proteínas, obtenidos por vía recombinante, los que ofrecen ventajas con respecto a los convencionales debido a que es más fácil su purificación, se obtiene una buena respuesta y se elimina el riesgo de trabajar con organismos vivos, sobre todo, en aquellos que tienen alta patogenicidad. De forma general los antígenos pueden ser vivos o inactivados. Los antígenos vivos son partículas completas que se multiplican en el hospedero, son fáciles de aplicar y confieren tanto inmunidad humoral como celular y por lo general son aplicados cuando se requiere obtener respuesta contra proteínas internas de la partícula antigénica. Tienen la desventaja de que para inducir una buena respuesta se requiere del crecimiento o la multiplicación del mismo en los tejidos y mientras mayor sea la cantidad de antígeno producida mejor será la respuesta inmune, pero las lesiones provocadas en los tejidos pueden ser más graves. Los antígenos inactivados causan menos respuestas adversas que los antígenos vivos porque no se multiplican o crecen en el huésped y por lo tanto la respuesta es a las proteínas externas de la partícula antigénica. Para obtener una buena respuesta inmune con el empleo de estos antígenos se requiere de un alto contenido del mismo y además del uso de adyuvantes, generalmente de tipo oleoso. Tienen la desventaja de que no inducen respuesta inmune en mucosas (importante en la protección contra bronquitis infecciosa) ni de tipo celular, determinante en la protección contra la enfermedad de Marek. Es conveniente señalar que en la práctica veterinaria de acuerdo al tipo de protección que se desee obtener frente a diferentes enfermedades se utiliza tanto el uso de antígenos vivos como inactivados o una combinación de los mismos, es decir primero se realiza la inmunización con el antígeno vivo y posteriormente se emplea en dosis de recuerdo el antígeno inactivado y se obtiene una respuesta más elevada y duradera en el tiempo Producción de anticuerpos. La producción de anticuerpos es el resultado final de la activación de los linfocitos B por un antígeno, el cual reacciona específicamente con el epitopo que estimula su producción. Los anticuerpos producidos en una respuesta humoral a un estímulo antigénico son heterogéneos en especificidad y pueden incluir todos las clases de inmunoglobulinas. La heterogeneidad de esta respuesta es debida a los múltiples determinantes antigénicos que 14

15 activan las células B; por lo que el suero de cualquier animal contienen una mezcla heterogénea de moléculas de inmunoglobulinas y la especificidad de estas moléculas será reflejo de la historia y exposición antigénica del organismo en el pasado. En la obtención de antisueros intervienen diversos factores que deben conjugarse para lograr buenos resultados. Entre ellos se encuentran la cantidad de antígeno, su forma física y grado de pureza, el esquema de inmunización, uso de adyuvante, la vía de inoculación y la especie animal entre otros. Por otro lado en la preparación de antisueros debe decidirse contra qué componente del antígeno se desea obtener el anticuerpo. También debe de tenerse en cuenta el tiempo en que se sangra el animal para obtener el suero. Los antisueros adquiridos entre la segunda y tercera semana después de la inmunización, aunque sus títulos son relativamente bajos, tienen menos reacciones cruzadas o inespecíficas con otros antígenos que los obtenidos tardíamente. Para hacer más inmunogénicos los antígenos y obtener títulos elevados de anticuerpos, es recomendable la utilización de adyuvantes. Los adyuvantes son compuestos que generalmente se agregan al antígeno haciéndolo más inmunogénico e inducen la respuesta inflamatoria que atrae células inmunocompetentes que procesan adecuadamente al antígeno, dependiendo del adyuvante, estimulan a las células para liberar factores que activan la respuesta inmune como es el caso de los oleosos. Uno de los adyuvantes más utilizados es el adyuvante incompleto de Freund s (AIF), el cual es un aceite mineral con un emulsificante para que los antígenos que se encuentran en fase acuosa puedan integrarse a la fase oleosa. Una mejor respuesta se obtiene con este adyuvante cuando se le añaden micobacterias muertas, que estimulan una fuerte respuesta inflamatoria y provoca un granuloma en el sitio de aplicación, y se denomina adyuvante completo de Freund s (ACF). También se usa como adyuvante el hidróxido de aluminio que estimula la respuesta inmune en menor grado que los adyuvantes oleosos, pero es relativamente inocuo y no provoca la inflamación del ACF Anticuerpos Policlonales. En las técnicas de diagnóstico comúnmente empleadas se han utilizado durante muchos años las preparaciones policlonales de anticuerpos, obtenidas por inmunizaciones repetidas en diversas especies animales entre las que se destacan conejos, cabras, ovejas, caballos, aves, etc. con antígenos purificados o microorganismos vivos. Su producción es relativamente simple y de bajo costo, además poseen buena estabilidad a las variaciones de ph y las concentraciones de sales. 15

16 Frente a la inmunización con un antígeno completo la respuesta de anticuerpos está formada por los productos de un número variable y siempre cambiante de clones de linfocitos B (respuesta policlonal). Los epitopes reconocidos por cada clon (es decir, por cada anticuerpo), la afinidad y la clase de los anticuerpos son diferentes y pueden cambiar con el decursar del proceso de inmunización. En una respuesta típica se activan, proliferan y diferencian solo los linfocitos con receptores específicos para los determinantes del antígeno, bajo la influencia de diversas citocinas producidas por las células T auxiliadoras. Parte de cada clon expandido madura hacia células plasmáticas que producen inmunoglobulinas de tipo M específicas, de baja afinidad. Durante la inmunización continua, parte de la población activa comienza a producir inmunoglobulina del tipo gamma (IgG), debido a un cambio de clase. Otra parte se convierte en células de "memoria. La inmunización repetida (hiperinmunización) actúa como ciclos progresivos de selección de los clones con receptores de mayor afinidad. Antígeno Inmunización Respuesta clonal de linfocitos B Fig. 6. Producción de Anticuerpos Policlonales. Al inmunizar un animal con el antígeno se produce la activación de varios clones de linfocitos B con receptores específicos para diferentes determinantes antigénicos. La proliferación y diferenciación de estos clones lleva a la generación de células plasmáticas, secretoras de los respectivos anticuerpos específicos. La sangre del animal contiene una mezcla de inmunoglobulinas de distintas subclases, afinidad y especificidad fina (epitopo reconocido) para el antígeno. 16 Preparación policlonal de anticuerpos

17 Todo lo anterior nos indica que en la práctica es imposible controlar la composición de las preparaciones de anticuerpos policlonales que se obtienen de animales inmunizados. Estas preparaciones son heterogéneas para los anticuerpos que contienen en términos de isotipo, afinidad y epitopo reconocido. Además de ser diferentes de animal a animal inmunizado, e incluso, en un mismo animal a distintos tiempos del proceso de inmunización. Por lo tanto, una cuestión importante a tener en cuenta en los anticuerpos policlonales es el problema de la reactividad cruzada frente a determinantes antigénicos de otros antígenos de diferente origen, lo que trae serias limitaciones a los ensayos. Las reacciones cruzadas se pueden reducir realizando absorciones apropiadas, pero ello frecuentemente ocasiona una pérdida de título. Cuando el ensayo requiere que el anticuerpo producido sea sólo contra un determinante antigénico y que sea de un solo tipo es decir, con especificidad, afinidad y clase conocidos, tendría que ser elaborado a partir de un solo clon de células B, un anticuerpo monoclonal, lo que nos proporcionaría una preparación estable y reproducible de anticuerpos uniformes Anticuerpos Monoclonales. Su utilidad en el diagnóstico. La posibilidad de obtener preparaciones específicas, repetibles e inagotables de anticuerpos con funciones predefinidas (anticuerpos monoclonales) se hizo realidad entre como resultado de los experimentos realizados por Kohler y Milstein. Estos investigadores aprovecharon la existencia de mielomas murinos y realizaron fusiones entre ellos y linfocitos provenientes de ratones BALB/c inmunizados con antígeno definidos, y obtuvieran hibridomas de crecimiento continuo en cultivo capaces de secretar una variedad de anticuerpos reactivos contra el antígeno empleado para inmunizar los ratones. 17

18 Antígeno Mielomas en cultivo Inmunización Respuesta clonal de linfocitos B Linfocitos B Mielomas Hibridomas Clonaj Anticuerpos monoclonales Fig. 7. Producción de anticuerpos monoclonales. Las células esplénicas del ratón inmunizado se fusionan con células de mieloma adaptadas a cultivo. Los hibridomas resultantes se clonan, y se obtienen de esta forma líneas celulares que secretan al sobrenandante del cultivo anticuerpos monoclonales de subclase, afinidad y especificidad fina idénticas. La producción de hibridomas de ratón productores de anticuerpos monoclonales es una tecnología noble que funciona en laboratorios con un equipamiento muy diverso, condiciones y experiencia y consta de forma general de los siguientes pasos o etapas: 1.- Selección de la cepa y condiciones del ratón a inmunizar. 18

19 2.- Definición del esquema de inmunización. 3.- Desarrollo de un método analítico adecuado para el tamizaje de anticuerpos específicos. 4.- Inmunización, titulación y selección de los animales donantes. 5.- Preparación del mieloma parental. 6.- Fusión. 7.- Tamizaje de los anticuerpos y selección de los hibridomas. 8.- Clonación de hibridomas. Retamizaje. Cultivo y congelación de clones. 9.- Caracterización inicial de los anticuerpos Producción y purificación de anticuerpos para la caracterización y aplicación. Gracias a las características de la técnica de generación de hibridomas los anticuerpos monoclonales resultantes no sólo pueden ser seleccionados para su especificidad, sino también para aquellas funciones efectoras deseadas o propiedades útiles para el investigador (isotipo, afinidad, capacidad de aglutinación neutralización captura, etc.). Los anticuerpos monoclonales permiten obtener la especificidad, reproducibilidad e inagotabilidad, imposibles de lograr por técnicas convencionales de inmunización y preparación de antisueros y los ha convertido rápidamente en uno de los elementos básicos para el desarrollo de la biomedicina moderna. En el campo del diagnóstico tiene una enorme aplicación ya que son reactivos ideales por su especificidad, estabilidad y producción ilimitada, que permiten la diferenciación de cepas de gran similitud, imposibles de ser diferenciadas por los anticuerpos policlonales como ocurre, por ejemplo, entre el virus de la peste porcina clásica y el de la diarrea viral bovina Preparación de conjugados. Con el amplio uso de las técnicas más avanzadas en la serología se ha incrementado el uso de anticuerpos o antígenos marcados con una enzima (conjugados) para poder visualizar la reacción antígeno-anticuerpo. Los conjugados resultantes deben de tener tanto actividad inmunológica como enzimática y la reacción es cuantificada por el desarrollo de color después de la adición de sustrato. Generalmente las enzimas son conjugadas a los anticuerpos, otros sistemas usan la conjugación de enzimas a reactores seudoinmunes como la proteína A de Staphylococcus que se une al fragmento Fc de la IgG de la mayoría de las especies de mamíferos. Otro sistema utilizado es el de biotina-avidina por su alta afinidad de unión. También para incrementar la sensibilidad del ensayo se han utilizado sustratos de alta energía como los fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivos. 19

20 Las enzimas y sus respectivos sustratos más comúnmente utilizados se muestran en la siguiente tabla: Tabla 3. Enzimas y sustratos más utilizados en la producción de conjugados. Enzima Sustratos Peroxidasa Ortofenilendiamina (OPD) Ácido azinodietilbenzotiazolinesulfónico (ABTS) Ácido 5-aminosalicílico (5-AS) Tetrametilbenzidina (TMB) Hidroximetilbenzidina Fosfatasa alcalina p-nitrofenil fosfato β-galactosidasa o-nitrofenil β galactopiranósido Ureasa cambio de ph en presencia de un indicador (púrpura de bromocresol) La más utilizada en el diagnóstico es la peroxidasa debido a que es la más sensible. Muchas firmas comerciales producen conjugados antiespecies pero se debe de tener cuidado en seleccionar exactamente el antisuero requerido para el ensayo particular. El conjugado debe de ser titulado en el sistema de elección, así como también contra el tipo de antígeno particular. Un buen conjugado debe ser usado como mínimo en una dilución de 1/1000 y un buen título de conjugado oscila entre 1/5000 y 1/ En nuestro laboratorio han sido producidos conjugados enzimáticos antiespecies, fundamentalmente con las enzimas peroxidasa y la fosfatasa alcalina, con resultados satisfactorios. Un elemento importante a tener en cuenta para el buen funcionamiento y mayor utilización de los mismos es su conservación, la cual debe de ser a -20 C. Para ello es imprescindible añadir glicerol volumen a volumen para evitar las congelaciones y descongelaciones repetidas del conjugado enzimático que pudieran afectar la actividad inmunológica del mismo. 3.- Métodos de diagnóstico serológico. 20

21 La serología es la disciplina que estudia la respuesta humoral frente a las enfermedades y vacunaciones. El desarrollo de la biología molecular y la utilización de los anticuerpos monoclonales ha permitido disponer en los últimos años de reactivos de diagnóstico de gran sensibilidad, especificidad, de fácil y sencilla realización e interpretación. En la mayoría de las enfermedades infecciosas, las técnicas serológicas constituyen la base del diagnóstico de laboratorio para los programas de control y erradicación. Estas pruebas son de gran utilidad cuando se cuenta con una historia completa del rebaño, sin embargo, pueden tener poco o ningún valor por sí solas y confundir con frecuencia a quién trata de interpretarlas. Cuando realizamos una simple determinación de anticuerpos, cualitativa o cuantitativa, lo único que podemos deducir es que los animales estuvieron en contacto con el antígeno, pero difícilmente podremos determinar, bajo condiciones prácticas, si fue en forma de vacuna, si fue un brote de campo o en el caso de animales muy jóvenes si se trata de anticuerpos maternos. En cambio un diagnóstico serológico con una buena historia clínica y seguimiento de las pruebas puede ayudarnos a corroborar un diagnóstico clínico, así como la evolución de la respuesta a la vacunación, el estado inmunológico, en general del rebaño y en algunos casos la resistencia que podemos esperar de un grupo determinado. Para corroborar el diagnóstico generalmente se requieren dos muestras: una tomada antes o en el momento de la aparición de los signos, la que se denomina suero de fase I, y otra muestra obtenida en la convalescencia, denominada suero fase II, alrededor de cuatro semanas después. En aquellos casos en que no se vacuna contra la enfermedad la presencia de anticuerpos en una muestra será suficiente para diagnosticar la presencia de la enfermedad. Cuando se piensa establecer pruebas de diagnóstico inmunológico para reconocer un agente es recomendable analizar: 1. Características del agente para determinar los antígenos importantes. 2. La patogenia de la enfermedad que provoca. 3. Posible tipo de respuesta inmune de acuerdo con la especie animal que afecta. 4. Las características de las diversas pruebas, tales como funcionamiento, sensibilidad, clases de anticuerpos que reconocen así como sus ventajas y desventajas. También se deben de tener en cuenta las siguientes consideraciones para seleccionar la técnica a utilizar: 21

22 a)- El volumen de reactivos (antígeno y antisuero) debe ser pequeño porque en pocas ocasiones se cuenta con gran cantidad de los mismos. b)- El ensayo debe ser lo suficientemente sensible para detectar niveles bajos de anticuerpos y además ser específica para los anticuerpos que se buscan. Cuánto más purificado sea el antígeno menores serán las reacciones cruzadas y la prueba resultará más específica. c)- La prueba debe ser reproducible, sencilla de aprender y llevarla a cabo. d)- La técnica no debe ser afectada por factores inespecíficos y estos deben ser fáciles de eliminar. e)- El ensayo de elección debe ser validado con una prueba que ya esté establecida y que sea confiable. Si no se aplican estos criterios, en muchos casos las pruebas pueden fallar o no tener la eficiencia necesaria. Las técnicas serológicas se pueden dividir en tres categorías: Las pruebas de unión primaria. Son las más sensibles en términos de cuantificar los anticuerpos detectados. Miden la interacción entre el antígeno y el anticuerpo por la cantidad de complejo inmune formado. La reacción no se puede reconocer a simple vista por lo que se usan métodos en los que se marca el antígeno o el anticuerpo con una molécula como los isótopos en los radioinmunoensayos, con enzimas como en las pruebas inmunoenzimáticas, con fluorocromos que pueden ser detectados en el microscopio de fluorescencia, con sustancias opacas al microscopio electrónico como la ferritina, etc. Las pruebas de unión secundaria. Miden los resultados de la interacción antígeno anticuerpo in vitro y se observa una reacción notoria a simple vista. La formación de complejos inmunes se mide indirectamente y aquí cambia el estado de dispersión del antígeno o se modifica el anticuerpo. Si el antígeno es soluble se observa precipitación, si es particulado se presenta aglutinación o puede haber lisis de un sistema indicador como con los glóbulos rojos en la fijación de complemento. Por lo general, estas pruebas son menos sensibles que las pruebas de unión primaria pero son fáciles de realizar. Las pruebas de unión terciaria. Miden el efecto protectivo de los anticuerpos in vivo. En estas reacciones pueden presentarse manifestaciones visibles generalmente de tipo inflamatorio. Estas reacciones se denominan de hipersensibilidad y pueden ser de tipo temprano o tardío, según el tiempo que tardan en aparecer. Los reactivos más empleados en las pruebas serológicas son: 22

23 Suero: Es la fuente común de anticuerpos. Puede ser guardado en congelación y utilizado cuando sea necesario. La actividad del complemento puede ser inactivada en los casos que sea requerido por calentamiento del suero a 56ºC por 30 minutos. En general se aconseja obtener los sueros de forma individual, evitando hacer mezclas, porque al hacerlo se diluyen los sueros mutuamente y un solo suero positivo en una mezcla de cinco o diez, puede convertir la prueba en positiva, enmascarando, por ejemplo, animales que no respondieron a una vacuna. Complemento: Es un complejo de enzimas interactuantes, las cuales al ser activadas reaccionan en cascada tendiendo a la disrupción de las membranas celulares y la destrucción de células infectadas o microorganismos invasores. Es una parte esencial de las defensas del organismo pero debe ser cuidadosamente regulado debido a que la activación no controlada puede tender a una masiva destrucción celular. Es un constituyente normal del suero fresco y el complemento del suero de curiel es muy eficiente en las pruebas hemolíticas. El suero utilizado como fuente de complemento para las técnicas serológicas debe ser guardado en congelación en pequeños volúmenes y una vez descongelado debe ser usado rápidamente. Antiglobulinas: Las inmunoglobulinas son moléculas complejas por lo que funcionan como antígeno cuando son inyectadas en un animal de diferente especie. Son esenciales en muchas pruebas inmunológicas. Anticuerpos monoclonales: Debido a su pureza y especificidad pueden ser usados como reactivos químicos estándares. Son frecuentemente usados en el inmunodiagnóstico sustituyendo el antisuero. Las técnicas serológicas muestran la reactividad entre el antígeno y el anticuerpo. Estos dos componentes tienen un propósito principal en el diagnóstico: a)- Identificar un aislado desconocido con un antisuero conocido. b)- Para la detección en el suero de anticuerpos contra un antígeno determinado. Los métodos serológicos deben de tener una sensibilidad y especificidad apropiada y un incremento en la sensibilidad reduce la especificidad del mismo y viceversa. La rapidez es una consideración secundaria: la sensibilidad y la especificidad no deben de ser sacrificadas en función de la velocidad. Además las diferentes técnicas serológicas varían en las concentraciones de anticuerpos (tabla 4) y en las diferentes clases de inmunoglobulinas (tabla 5) detectadas por ellas. 23

24 Tabla 4. Sensibilidad aproximada de algunas pruebas inmunológicas. Técnica Proteína (µg/ml) Radioinmunoensayo 0,0001 ELISA 0,0005 Inmunodifusión 30 Aglutinación bacteriana 0,05 Inhibición de la hemoaglutinación 0,005 Fijación de complemento 0,05 Virus neutralización 0,00005 Tabla 5. Papel de las inmunoglobulinas en las diferentes pruebas diagnósticas. Clases de Inmunoglobulinas IgG IgM IgA IgG (T) Aglutinante Fijadora de complemento Precipitante ± ± Neutralizante Tiempo de aparición después de la exposición al antígeno 3-7 días 2-5 días 3-7 días 3-7 días Tiempo para alcanzar pico 7-21 días 5-14 días 7-21 días 7-21 días Técnicas de aglutinación. Las reacciones de aglutinación son causadas por el agrupamiento de partículas de antígenos recubiertos por los anticuerpos que los reconocen en presencia de ciertos electrolitos. Los procedimientos de aglutinación son ampliamente usados en el diagnóstico bacteriológico para detectar antígenos y cuantificar anticuerpos. Se caracterizan por su sencillez y gran sensibilidad. En estas pruebas son particularmente eficientes las 24

25 inmunoglobulinas del tipo M, por lo que la prueba es positiva desde las primeras etapas del desarrollo de los anticuerpos. Las inmunoglobulinas G que se desarrollan posteriormente no son tan eficientes en la aglutinación, se requiere una alta concentración de ellas para que la reacción sea positiva, por lo que frecuentemente esta prueba resulta negativa en la fase crónica de la enfermedad. Las aplicaciones prácticas de esta prueba son pruebas de aglutinación en placas para detectar anticuerpos contra Salmonella pullorum, S. gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, M. synovae, etc Seroaglutinación rápida en lámina: Es corrientemente empleada en la detección de niveles de anticuerpos contra enterobacterias, brucellas y rickettsias y en la detección directa de las mismas con anticuerpos monoclonales reactivos. Se basa en el principio de que la bacteria puede agregar en presencia de anticuerpos contra sus determinantes antigénicos. Es necesario emplear antígenos bacterianos como controles positivos. Actualmente esta técnica se encuentra entre los métodos más empleados para la detección de anticuerpos contra la micoplasmosis en las aves pero por su baja especificidad no permite diferenciar la especie de micoplasma por lo que debe ser usada como una prueba de tamiz Aglutinación en látex: Es muy empleado en el diagnóstico actual. Las partículas de látex son pequeñas esferas de poliestireno, todas con diámetro y superficie química uniforme, suspendidas en agua en gran cantidad por mililitro dando un aspecto lechoso. Estas partículas pueden unirse con anticuerpos u otras proteínas mediante interacciones hidrofóbicas entre sitios de la proteína y la superficie de poliestireno de las partículas. Cuando tiene lugar esta unión se dice que las partículas están sensibilizadas y constituyen así una herramienta para el diagnóstico que puede ser sensible, con capacidad para detectar concentraciones inferiores a 5 µg/ ml. El procedimiento operacional para esta técnica es también muy simple y puede ser realizado en condiciones de campo por cualquier persona entrenada. El principio de la misma consiste en poner a reaccionar una gota de reactivo de látex sensibilizado con 25

26 inmunoglobulinas específicas, con una gota de muestra (orina, suero, etc.) que se mezclan con la ayuda de un agitador y movimientos de rotación de la placa de reacción. Si la muestra contiene el antígeno que las IgG reconocen en pocos segundos el látex comienza a aglutinar, se forman grandes grumos visibles y el aspecto lechoso del reactivo desaparece Inhibición de la hemoaglutinación. La hemoaglutinación es la propiedad biológica que tienen algunos virus y bacterias para unirse a los receptores de membrana (formados por residuos del ácido N-acetilmurámico) de los glóbulos rojos de mamíferos y aves, siendo los más utilizados los de pollos. Para poder hacer visible la hemoaglutinación son necesarias 10 6 partículas de antígeno por lo que no es una técnica de alta sensibilidad. Los anticuerpos pueden unirse de forma cruzada con antígenos particulados los cuales provocan su aglutinación, que puede ser producida mezclando una suspensión de antígeno con su antisuero. La capacidad para producir la aglutinación es diferente para cada clase de anticuerpo y los de tipo IgM son considerados los más eficientes. Los anticuerpos dirigidos contra estos antígenos pueden inhibir la hemoaglutinación al bloquear los sitios de unión del antígeno con los glóbulos rojos y esta prueba serológica es la llamada inhibición de la hemoaglutinación o IH. Es un método altamente sensible y específico. Además de ser un método rápido, sencillo y barato ha sido históricamente la prueba serológica a elegir para la identificación de virus hemaglutinantes. Aunque con esta prueba se determinan solo anticuerpos circulantes y no es posible relacionar el título directamente con la protección, resulta de gran utilidad para saber si los animales están infectados o si ha reaccionado adecuadamente a la vacuna. Cuando se conoce bien el esquema de vacunación, es posible asumir que los animales están protegidos al encontrar cierto título, un ejemplo en la vacunación contra la enfermedad de Newcastle se conoce que cuando hay títulos de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación iguales o superiores a 1/8 los animales están protegidos. La determinación en el suero de anticuerpos contra la hemoaglutinina se realiza añadiendo el mismo volumen de 4 u 8 unidades hemoaglutinantes de antígeno a cada dilución de suero y mediante la adición de eritrocitos se evidencia la presencia o no de anticuerpos en el suero. Si el suero es positivo, es decir tiene anticuerpos contra el antígeno, los eritrocitos descienden y forman un precipitado (botón) en el fondo del tubo o microplaca; por el contrario si el suero es negativo se observará la presencia de un 26