UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICO FARMACEÚTICO BIÓLOGO TESINA IDENTIFICACIÓN DE METALOPROTEINASA 9 (MMP 9) POR ENSAYOS DE WESTERN BLOT PRESENTA MARIO DE JESÚS CASTAÑEDA OLGUÍN DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL DR. ANGEL RAMOS LIGONIO ORIZABA, VER. ENERO

2 Índice Página 1. Introducción 2. Marco teórico 2.1Matriz extracelular Colágenos Fibronectinas Proteoglicanos 2.2 Metaloproteínas Metaloproteinas e inflamación 3. Justificación 4. Objetivos 4.1Generales 4.2 Particulares 5. Materiales y métodos 5.1 Material biológico 5.2 Preparación de células mononucleares de sangre periférica Lisis de eritrocitos Conteo por exclusión con azul de tripano Interacción con mitógenos inespecíficos 5.3 Geles de poliacrilamida-sds 5.4 Western blot (Inmunotransferencia) 6. Resultados y Discusión 7. Conclusión 8. Referencias Bibliográficas

3 Índice de tablas Tablas Tabla l Tabla ll Componentes y cantidades para la preparación gel de poliacrilamida al 5% SDS Cantidades utilizadas para la preparación de la muestra para su posterior corrida electroforética

4 Índice de figuras Figura Página Figura 1 Estructura de la triple hélice de la colágena 6 Figura 2 Moléculas de adhesión que favorecen la unión de las plaquetas 9 Figura 3 Esquema de un monómero de proteoglicano 11 Figura 4 Estructura básica de las metaloproteínas 14 Figura 5 Fórmula para calcular el total de células viables y muertas 23 Figura 6 Cámara de neubauer y cuadricula de conteo 24 Figura 7 Placa de cultivo de 24 pozos 24 Figura 8 Ejemplificación de la placa con las muestras y el tiempo de interacción 25 Figura 9 Tubo eppendorf de 1.5 ml 25 Figura 10 Cassette con los componentes necesarios para realizar la transferencia 27 Figura 11 Equipo necesario para la transferencia del gel de poliacrilamida a la 27 membrana de nitrocelulosa Figura 12 Membrana de nitrocelulosa después del revelado 30 Figura 13 Gel de poliacrilamida-sds teñido con azul de coomassie. 32 Figura 14 Gel de poliacrilamida al 10% SDS teñido con azul de Coomassie con diferente concentración de extractos. 33 4

5 Lista de abreviaturas ADP: Adenosíl difosato BCE: Buffer de corrida electroforética CoA: Concanavalina A GAG: Glicosaminglicano kda: Kilodaltones LPS: Lipopolisacárido de E. coli. ml: Mililitro MEC: Matriz extracelular MMP: Metaloproteinasas de la matriz MMP9: Metaloproteinasa 9 OI: Osteogénesis Imperfecta PG: Proteoglicanos SDS: Duodecil sulfato de sodio SED: Síndrome de Ehlers-Danlos SMF: Síndrome de Marfan TEMED: Tetrametilnediamina tpa: Activador Tisular del plasminógeno upa: Urocinasa activadora del pasminógeno μl: Microlitro V: Volt 5

6 Resumen Antecedentes: La matriz extracelular (MEC) está conformada por una gran variedad de moléculas, existe un equilibrio entre la síntesis y la degradación de esta. Una remodelación desequilibrada se ha asociado con diferentes procesos patológicos. Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) son una familia de proteasas dependientes de zinc secretadas como zimógenos las cuales contribuyen a desencadenar una serie de procesos que concluyen en la degradación de los componentes de la matriz extracelular. La MMP-9 ó gelatinasa B pertenece a la subfamilia de las MMP que desempeñan un papel importante en la remodelación de tejidos normales y patológicos en los procesos inflamatorios. Objetivo: Identificar la presencia de MMP9 en monocitos humanos de sangre periférica por la técnica de western blot. Método: Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de humano activadas con mitógenos inespecíficos (Concanavalina A y Lipopolisacarido de E. coli) en intervalos de interacción de 24 hrs, 48hrs, 72 hrs y 96 hrs. Para su posterior separación por SDS-PAGE y su análisis por western blot enfrentado con anticuerpos anti MMP9 de humano hecho en conejo a una dilución 1:2000 y con un segundo anticuerpo anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina a una dilución de 1:5000. Resultados: Ausencia de la banda de MMP 9 esperada en la membrana de nitrocelulosa después del tratamiento con anticuerpos y reveladores. Conclusiones: Se logró obtener células mononucleares de sangre periférica, que se estimularon con mitógenos inespecíficos, sin embargo, bajo las condiciones utilizadas no se logró detectar la presencia de la MMP9. 6

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8 1. Introducción La matriz extracelular (MEC) está conformada por una gran variedad de moléculas, las cuales interaccionan entre sí generando una estructura tridimensional. Las macromoléculas que constituyen la MEC incluyen colagenasas que son las responsables de la resistencia mecánica de los tejidos conjuntivos, la elastina que le confiera cualidades de flexibilidad y elasticidad, proteínas de adhesión como fibronectinas y lamininas que son esenciales para la adhesividad. En condiciones fisiológicas, existe un equilibrio dinámico entre la síntesis y la degradación de los componentes de la matriz, lo cual ocurre de manera programada y equilibrada. Por el contrario una remodelación desequilibrada de la MEC se ha asociado con diferentes procesos patológicos como la artritis reumatoide, y la arterosclerosis representa condiciones patológicas en las cuales existen alteraciones en la estructura de la MEC. La MEC se puede degradar por las metaloproteinasas de la matriz (MMP), que son una familia de proteasas dependientes de zinc secretadas como precursores (zimógenos) que se activan mediante proteólisis de la MEC. Las metaloproteinas teniendo en cuenta el dominio de la estructura y la afinidad al sustrato, se dividió en cuatro grupos mayores: colagenasas, estromelisinas, gelatinasas y metaloproteinas tipo membrana. La MMP 9 es una metaloproteinasa de la familia de las gelatinasas, es una proteína de 92kDa (kilodaltones) cuya función principal es la degradación de las proteínas de la matriz extracelular tales como la laminina y elastina. Es por ello que un exceso en las concentraciones de la MMP9 es un factor de riesgo para el padecimiento de enfermedades crónico-degenerativas motivo por el cual ha sido objeto de estudio. El western blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de ellas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa tratados con anticuerpos para el posterior análisis de las proteínas. Por lo tanto la identificación de MMP 9 en cultivos celulares humanos por western blot resulta viable y de gran importancia, dado que una vez que se obtenga un control positivo de MMP 9, puede ser objeto de otros estudios para seguir evaluando su importancia, tanto en la homeostasia de la matriz extracelular como en diversas patologías. 8

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10 2. Marco teórico 2.1 Matriz extracelular Los tejidos no están hechos sólo de células. Una parte sustancial de su volumen es el espacio extracelular, que está lleno principalmente de una intrincada red de macromoléculas que consisten en la matriz extracelular. La matriz extracelular (MEC) se compone de una variedad de proteínas y polisacáridos que se secretan localmente y se ensamblan en una mezcla organizada en asociación cercana con la células que las produjo. (1) La MEC es una entidad estructuralmente compleja que rodea y soporta las células que se encuentran en los tejidos de los mamíferos. La MEC también es comúnmente conocida como tejido conectivo y está compuesta principalmente de 3 clases de moléculas (16) Proteínas Estructurales: colágeno y elastina. Proteínas Especializadas: Fibrilina, fibronectina y laminina. Proteoglicanos: Estos están compuestos de una proteína central a la cual se unen cadenas largas de unidades de disacáridos repetitivos llamados glicosaminglicanos (GAGs) formando así compuestos complejos de alto peso molecular que conforman la MEC (16) Los GAGs son cadenas de polisacáridos no ramificadas, que se componen de unidades que se repiten. Se les llama GAGs porque una de las dos azúcares en el disacárido que se repite, es siempre el azúcar amino. (N-acetilglucosamina o N- acetilgalactosamina).estas moléculas son cargadas muy negativamente por ello son las moléculas más aniónicas producidas por las células animales. (1) Las proteínas fibrosas están embebidas entre las moléculas de proteoglicano, y estas tienen funciones estructurales y adhesivas. Esta unión resiste fuerzas compresivas en la matriz así como también permiten la rápida difusión de nutrientes, metabolitos y hormonas entre la sangre y las células de los tejidos. Las proteínas fibrosas están constituidas por el colágeno, elastina, fibronectina y laminina. (9) 10

11 2.1.2 Colágenos Las proteínas colagénicas son el constituyente principal de la MEC, su nombre proviene del griego cola, que significa pegamento y genos, nacimiento. Las colágenas son las proteínas más abundantes en los animales, de los que constituyen una tercera parte de su masa proteica (9). Existen al menos 30 diferentes genes de colágeno dispersos en el genoma humano. Estos 30 genes generan una serie de proteínas que se combinan de varias formas para crear 20 diferentes tipos de fibrillas de colágeno, entre las que destacan, los tipos de colágeno I, II y III son los más abundantes y forman fibrillas de estructura similares. El colágeno tipo IV forma un retículo bidimensional y es el componente principal de la lámina basal de los epitelios. Los colágenos son predominantemente sintetizados por los fibroblastos pero las células epiteliales también sintetizan estas proteínas. (16) La estructura fundamental más alta de los colágenos es una proteína larga, tubular y de diámetro pequeño. El colágeno tipo I, tiene 300nm de longitud, 1.5nm de diámetro y consiste en 3 subunidades enrolladas, dos cadenas α1 y una cadena α2. Cada cadena consiste de 1050 aminoácidos característicamente enrollados entre sí en una hélice triple con rotación hacia la derecha (Figura 1). Existen 3 aminoácidos por cada vuelta de la hélice y cada tercer aminoácido es una glicina. Los colágenos también son ricos en prolina e hidroxiprolina. (16) Figura. 1: Estructuras de la triple hélice del colágeno 11

12 Los procolágenos son proteínas precursoras utilizadas para sintetizar los colágenos. Los procolágenos tipo I contienen unos 150 aminoácidos adicionales en el amino-terminal y 250 adicionales en el C-terminal. Estos pro-dominios son globulares y forman múltiples puentes de disulfuro entre sus cadenas. Estos puentes de disulfuro estabilizan a la proproteína y permiten que se forme la triple hélice. Las fibras de colágeno empiezan a ensamblarse en el retículo endoplásmico y en los complejos de Golgi. La secuencia de señalización es removida y se realizan varias modificaciones en las cadenas de colágeno. (16) El colágeno es muy importante para la funcionalidad de los tejidos, dependiendo de la manera en que se disponga, en la lámina basal, se constituye una red de soporte para el tejido epitelial que está sobre ella. Pero la función del colágeno no es solamente estructural, algunos colágenos (como el XIII) generan péptidos que regulan procesos importantes como la angiogénesis (1). Entonces el colágeno no sólo cumple una función estructural, también participa en el proceso de diferenciación de tejidos. Los productos de degradación de algunos colágenos se ha visto que tienen actividad, regulan la diferenciación de células de los capilares para que se formen nuevos vasos, y esto es muy importante en la remodelación de los tejidos o en el desarrollo de tumores también. Tiene un rol complejo en la regulación del comportamiento de las células que hacen contacto con ella, influenciando su supervivencia, desarrollo, migración, proliferación, forma y función. (1) Las alteraciones en la estructura del colágeno se deben a genes anormales o a un procesamiento anormal de las proteínas del colágeno, que resultan en varias enfermedades, por ejemplo, disdunción de órganos cardiovasculares ( aneurisma aórtico y arterial, mal funcionamiento de las válvulas cardiacas ) afecciones de la piel (cicatrización defectuosa y distensión inusual) daño en las articulaciones (hipermovilidad y artritis) en los ojos provocando dislocación del cristalino (17,18), el síndrome Alport, síndrome de Larsen y varias condro-displasias al igual que otros síndromes asociados a la osteogénesis imperfecta y el síndrome de Ehlers-Danlos. (17) 12

13 El síndrome de Ehlers-Danlos (SED) se asocia con al menos diez diferentes desordenes que son clínica y bioquímicamente distintos, sin embargo, todos manifiestan debilidad estructural en el tejido conectivo como resultado de los defectos en la estructura de los colágenos. La osteogénesis imperfecta (OI) también abarca más de un desorden. Se han identificado por lo menos cuatro desórdenes clínica y bioquímicamente distintos y se los clasifica como tipo I (moderado), tipo II (perinatal letal), tipo III (deformante) y tipo IV (moderado deformante). Los cuatro tipos se caracterizan por múltiples fracturas y consecuentemente deformaciones óseas. (17) El síndrome de Marfan (SMF) se manifiesta como un desorden del tejido conectivo y se creía que era el resultado de colágenos anormales. Sin embargo, existe evidencia reciente que sugiere que el SMF es el resultado de mutaciones en la proteína extracelular, fibrilina, la cual es un constituyente integral de las microfibrillas no-colagenosas de la matriz extracelular. (17) Fibronectinas La fibronectina es una glicoproteína formada por una molécula asimétrica que consiste de dos subunidades similares de 220 kda, unidas por puentes disulfuro cerca de su región carboxi-terminal ( 10 ). Se encuentra en forma soluble principalmente como un dímero y en forma insoluble formando multímeros de alto peso molecular mantenidos por enlaces covalentes ( 28 ), los cuales son organizados en un componente fibrilar en la matriz extracelular ( 29 ). La fibronectina es una proteína adhesiva, que se encuentra libre en el plasma y constituye uno de los principales componentes de la matriz extracelular. Esta proteína ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de interactuar con diversas células y macromoléculas, influyendo en el comportamiento celular y en las reacciones bioquímicas de diversos sistemas, así como en una gran variedad de procesos fisiológicos como fagocitosis, proliferación, adhesión y migración celular. Entre sus principales funciones está la de intervenir en la remodelación de los tejidos durante la embriogénesis y participar en el proceso de cicatrización de una lesión vascular después de la formación de un coágulo de fibrina, formado por la activación del sistema hemostático (20). De manera general la fibronectina extracelular actúa como sustrato para la adhesión celular durante la 13

14 embriogénesis y la organogénesis y en este aspecto se ha demostrado que participa en múltiples sistemas como la diferenciación de las células hematopoyéticas (10). En condiciones fisiológicas la hemostasia tiene como función mantener el flujo normal de la sangre y la integridad del endotelio vascular. En caso de lesión de un vaso sanguíneo con pérdida de la continuidad de la pared vascular, la hemostasia actúa limitando la extravasación de sangre al formar un tapón plaquetario, el cual es consolidado por una malla de fibrina que se forma durante la activación de la coagulación. La fibrina formada en conjunto con la fibronectina, que es incorporada en forma covalente al coágulo por acción del factor XIIIa, sirve como matriz provisional durante el proceso de reparación tisular para la adhesión y migración celular dentro del tejido lesionado (21,22). Una vez formado el coágulo y cumplida su función hemostática, éste es disuelto por acción del sistema fibrinolítico para restaurar el flujo sanguíneo. El funcionamiento de las proteínas involucradas en el mecanismo de la fibrinólisis, es de vital importancia para que se den de forma apropiada los procesos de fibrinólisis, cicatrización y regeneración vascular (22,23).Entre los procesos de adhesión celular de importancia en la hemostasia, se encuentra la adhesión de las plaquetas, elementos formes de la sangre que desempeñan un papel crucial desde los primeros momentos de la activación del sistema hemostático (24). Figura 2: Moléculas de adhesión que favorecen la unión de las plaquetas a la matriz extracelular, expuesta por la lesión endotelial. 14

15 El potencial adhesivo de las plaquetas es expresado cuando el endotelio sufre daños causados por lesiones o alteraciones de la pared vascular. Bajo estas condiciones, componentes de la matriz extracelular como fibronectina, laminina, colágeno son expuestos sobre la superficie luminal de la pared vascular, con el consiguiente reconocimiento de estas proteínas por receptores específicos de las plaquetas. Adicionalmente, algunas proteínas adhesivas como fibronectina son liberadas de los gránulos seguido a la activación plaquetaria. Esta interacción plaquetas-proteínas de matriz, es la responsable del proceso inicial de adhesión plaquetaria a la pared vascular lesionada (Figura 2). Adicionalmente, varios estímulos como adenosíl difosofato (ADP) y tromboxano A 2 (producidos y liberados por las plaquetas activas), favorecen los procesos de adhesión, al exponer o activar receptores sobre la superficie celular, que permiten el reclutamiento de nuevas células dentro del tapón en crecimiento y las uniones plaquetas-plaquetas importantes para que ocurra el proceso de agregación plaquetaria (27) Proteoglicanos Los proteoglicanos (PG) son moléculas ubicuas que pueden ser encontrados como parte de la matriz extracelular, en las superficies celulares asociadas a la membrana celular o plasmática, o en el interior de las células cuya función principal es su participación en la organización estructural de los tejidos y en la regulación de algunos factores de crecimiento así mismo poseen propiedades adhesivas y antiadhesivas, promueven la angiogénesis y la fibrilogénesis de las moléculas colágenas, además representan un conjunto peculiar y diverso de proteínas cuyo rasgo estructural común es que todos ellos están conformados por una proteína central, generalmente rica en residuos de serina y treonina, a la cual se unen covalentemente a una o múltiples cadenas lineales de carbohidratos conocidos como glicosaminglicanos (GAG) entre los que destacan la heparina (1). La heparina abunda en los gránulos de los mastocitos que recubren los vasos sanguíneos, la liberación de la heparina de estos gránulos en respuesta a una lesión y su ingreso al suero conlleva a la inhibición de la coagulación sanguínea. Este fenómeno ha sido provechoso clínicamente en el uso de la heparina inyectable para las terapias anti-coagulantes (1). 15

16 Los PG tienen tamaños extraordinariamente variables, la proteína central puede ser tan pequeña como 10kDa o tan grande como 400 kda, a la cual se puede unir una o múltiples cadenas de GAG (Figura 3). Entre los proteoglicanos más importantes se encuentra el agrecán que es una macromolécula compleja presente en el cartílago y el versican es un proteoglicano rico en condroitín y dermatán-sulfato, que se encuentran en vasos sanguíneos, cerebro, piel y cartílago. Figura 3: Esquema de un monómero de proteoglicano Dada su diversidad estructural los proteoglicanos también tienen una diversidad de funciones tanto en la matriz extracelular como en la célula. En la matriz extracelular mantienen hidratada la matriz extracelular, las cadenas de GAG pueden generar geles de poros de diferente tamaño, por lo que pueden intervenir como filtro selectivo en la regulación del tráfico de moléculas y de células, seleccionándolas en función de su tamaño, su carga o ambas cosas. Los PG y GAG se asocian formando enormes complejos poliméricos. También se asocian con otros elementos de la matriz extracelular como el colágeno y con redes proteicas de la lámina basal formado estructuras muy complejas (8). En la membrana plasmática no todos los proteoglicanos son componentes secretados a la matriz extracelular. Algunos son componentes integrales de las membranas plasmáticas. 16

17 Algunos actúan como correceptores que colaboran con los receptores de la superficie celular, tanto en la unión celular a la matriz extracelular como iniciando las respuestas de las células a algunas proteínas de señalización los más caracterizados son los sindícanos. Los proteoglicanos desempeñan un papel importante en la señalización celular ya que unen diversas moléculas de señalización pudiendo aumentar o disminuir su capacidad señalizadora (10). Los PG también se unen y regulan las actividades de otros tipos de proteínas de secreción, como enzimas proteolíticas y sus inhibidores, la unión de los proteoglicanos podría afectar a la enzima por alguno de estos mecanismos. Se cree que los proteoglicanos actúan de todas estas maneras: Inmovilizando a la proteína cerca del lugar donde se secreta, restringiendo su alcance de acción, bloqueando estéricamente la actividad de la proteína, proporcionando una reserva de proteína para su liberación posterior, protegiendo a la enzima frente a degradaciones proteolíticas, prolongando su acción ó alterando o concentrando la proteína haciendo más efectiva su exposición a los receptores de superficie celular (10). 2.2 Metaloproteinas Las Metaloproteínas (MMP) son un número de enzimas estructuralmente relacionadas capaces de digerir la matriz extracelular y los componentes de la membrana basal. Teniendo en cuenta el dominio de la estructura y la afinidad al sustrato, se dividió en cuatro grupos mayores: colagenasas, estromelisinas, gelatinasas y metaloproteinasas tipo membrana. La degradación de la matriz extracelular es un complejo proceso de multifases que involucra una familia de endopeptidasas dependientes del zinc, conocidas como metaloproteinasas de la matriz (MMPs) (3). Las MMP intervienen en la mayoría de los procesos fisiológicos que requieren la remodelación de la matriz extracelular y tienen un papel bien definido en procesos celulares diversos como la proliferación y la apoptosis. Además de esta función reparadora y de remodelación (reabsorción ósea, recambio endometrial, etc), la presencia de niveles elevados de algunas MMP se ha asociado a la destrucción tisular en una amplia variedad de procesos patológicos como diseminación de metástasis tumorales, artritis, formación de aneurismas, ateroesclerosis, etc (3). 17

18 Las metaloproteínas son proteínas que contiene un ion metálico como cofactor. Sus funciones son muy variadas en las células, actuando como enzimas, proteínas de transporte y almacenamiento, y en la transducción de señales, aproximadamente un cuarto a un tercio de todas las proteínas requieren metales para llevar a cabo sus funciones (11). Las metaloproteínas (MMP) son una familia de proteasas de al menos 21 miembros y se caracterizan por compartir las siguientes características: a) Presentan una homología estructural. b) Tienen un dominio catalítico que contiene átomos de zinc. c) Son secretadas en forma de zimógenos inactivos y posteriormente activadas por la lisis de una secuencia pro-peptídica y por reacciones autolíticas posteriores. d) Son inhibidas por los inhibidores tisulares específicos de metaloproteinasas (TIMPs) (12) La estructura básica de las MMP presenta una serie de dominios característicos: un péptido señal que dirige la secreción al exterior de la célula, un propéptido que mantiene a la enzima inactiva hasta que sufre un corte proteolítico y un dominio catalítico carboxi-terminal que une zinc. Sobre esta estructura básica aparecen diversas variantes, como un dominio de tipo hemopexina que media en la especificidad del sustrato y las interacciones con inhibidores endógenos, o un dominio transmembranario en el caso de las MMP asociadas a la membrana plasmática (31) (figura 4). Se han descrito cuatro subgrupos atendiendo a su estructura y especificidad de substrato: a) Colagenasas: Degradan preferentemente colágenos fibrilares de tipo I, II y III. A este subgrupo pertenecen la MMP-1 o colagenasa intersticial, la MMP-8 o colagenasa del neutrófilo y la MMP-13. La MMP-1 es producida por diferentes tipos celulares como los fibroblastos, células endoteliales o las células mesoteliales. La MMP-8 está almacenada en los gránulos del neutrófilo (13). 18

19 Figura 4: Estructura básica de las metaloproteínas b) Gelatinasas: Degradan gelatina, fibronectina, colágenos de la membrana basal o formadores de red (tipo IV) y en menos medida colágenos fibrilares (tipo I y V). A este subgrupo pertenecen la MMP-2 o gelatinasa A y la MMP-9 o gelatinasa B. Ambas son liberadas por diferentes elementos celulares. La MMP-9 además, se almacena en los gránulos del neutrófilo (13). c) Estromalisinas: Degradan glicoproteínas y proteoglicanos. A este subgrupo pertenecen la MMP-3, MMP-7 o matrilisina, MMP-9 y MMP-11 (13). d) Metaloproteinasas transmembrana (MT-MMP): Se caracterizan por presentar una secuencia de aminoácidos que permite su inserción en la membrana celular. Tienen la capacidad de activar a otras metaloproteínas y degradan algunos componentes de la MEC. Se han reconocido cinco miembros de este subgrupo (MT-MMP1-5) (13). e) Otras metaloproteinas: En este grupo se encuentra la MMP-12 metaloelastasa o macrófago elastasa, degrada colágeno tipo IV y elastina, y es secretada por los macrófagos. La expresión de la actividad de las MMP esta controlada a tres niveles: 1) Transcripción Genética. 2) Activación de la Proenzima (pro-mmp). 3) Inhibición por inhibidores tisulares específicos (6) 19

20 En la mayoría de células, los genes que codifican las diferentes metaloproteínas no se expresan de forma constitutiva, pero pueden ser inducidos por diferentes agentes como factores de crecimiento, oncogenes y citoquinas (6). Las MMP son secretadas en forma de de proenzimas y activadas a nivel pericelular por la lisis de una secuencia propeptídica, a excepción de la MMP-8 que es secretada en forma activa. La plasmina, metaloproteinasa de transmembrana, catepsina G y otras proteinasas, se han implicado en la activación de las metaloproteinasas (3). Las MMP tienen un papel importante en numerosos procesos fisiológicos del organismo, como en la embriogénesis de órganos y tejidos, la involución uterina en el periodo postparto, la ovulación y menstruación, la cicatrización de heridas o la remodelación ósea y de la placa de crecimiento epifisaria (3). Todas las MMP tienen en su estructura tres regiones o dominios diferentes: el dominio propéptido (prodominio), el dominio catalítico y el extremo carboxi-terminal, cada uno de ellos con una función específica (Figura 2). Se ha demostrado que el paso primordial en la activación de la forma latente de las MMP se basa en el mecanismo llave de la cisteína (Cys), de manera que la proteolisis y la escisión del propéptido iniciada por proteinasas tisulares o plasmáticas (plasmina, calicreínas, catepsinas) u otras MMP desestabilizan la unión Cys-Zn2 + y convierten la MMP en su forma activa (13). El activador fisiológico principal de las MMP es la plasmina generada a partir del plasminógeno por acción del activador tisular del plasminógeno (tpa) unido a la fibrina y por la urocinasa activadora del plasminógeno (upa) unida a un receptor de la superficie celular. Varios tipos de células, entre ellas las musculares lisas, las endoteliales y las implicadas en la remodelación de los tejidos, especialmente los macrófagos (13). 20

21 2.2.1 Metaloproteinas e Inflamación La inflamación es un proceso complejo e inespecífico, que se caracteriza por modificaciones locales y coordinadas de los vasos sanguíneos y el tejido conectivo; se relaciona con el proceso de reparación, que consiste en la regeneración de las células parenquimatosas dañadas, y con la cicatrización, que se caracteriza por la proliferación de tejido fibroblástico (8). En forma resumida, el proceso inflamatorio se inicia cuando los leucocitos que viajan por el centro del torrente sanguíneo se adhieren al endotelio, atraídos por moléculas que produce el propio endotelio y otras células inflamatorias; luego el leucocito migra entre las células endoteliales y llega al foco inflamatorio, donde producirá la destrucción tisular. Entre las principales características de la inflamación se encuentra el aumento del flujo sanguíneo, el aumento de la permeabilidad capilar y venular y la movilización de células inflamatorias hacia el foco en que se produjo el daño (8). La MMP-9 ó gelatinasa B pertenece a la subfamilia de las MMP que desempeñan un papel importante en la remodelación de tejidos normales y patológicos en los procesos inflamatorios. La MMP-9 es un producto importante de la secreción de los macrófagos y un componente de los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos. La enzima también es secretada por los linfocitos y las células del estroma a la estimulación de las citocinas inflamatorias, o tras la entrega de bi-direccional de las siguientes señales de activación de la integrina-mediada por células-célula o célula-matriz extracelular (MEC) de contactos. Dado que la integridad de la arquitectura de los tejidos depende estrechamente del delicado equilibrio entre el MMP y sus inhibidores, la excesiva producción de MMP-9 está relacionada con el daño tisular y las enfermedades degenerativas inflamatorias. Como consecuencia, la regulación de la transcripción de genes y expresión específica de tejido de la MMP-9 en los estados normales y patológicos se están investigando activamente para allanar el camino para nuevas dianas terapéuticas. El objetivo de este trabajo es ofrecer una visión general de los acontecimientos recientes en el ámbito de la MMP-9 la expresión de genes en diferentes tipos de células (8). 21

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23 3. Justificación Las metaloproteinasas intervienen en la mayoría de los procesos fisiológicos que requieren la remodelación de la matriz extracelular y tienen un papel bien definido en procesos celulares diversos como la proliferación y la apoptosis. Además de esta función reparadora y de remodelación (reabsorción ósea, recambio endometrial, etc. La presencia de niveles elevados de algunas metaloproteinasas se ha asociado a la destrucción tisular en una amplia variedad de procesos patológicos como diseminación de metástasis tumorales, artritis, formación de aneurismas, ateroesclerosis, etc. Existe un interés creciente por conocer el papel que puedan desempeñar las metaloproteinasas, y en especial en aquellas enfermedades en las que la desestructuración de la matriz extracelular es un hallazgo característico. En este sentido se ha demostrado la implicación de la metaloproteinasas (MMP9) en algunas vasculopatías, especialmente en la formación de aneurismas, artritis reumatoide y la ateroesclerosis, lo que ha llevado a estudiar la inhibición de las metaloproteinasas en modelos experimentales de enfermedades vasculares. Es por ello que su búsqueda e identificación en células humanas de sangre periférica es de vital importancia primeramente para obtener un control positivo de las mismas y con ellos comenzar nuevos análisis y pruebas que puedan desencadenar nuevos estudios y resultados concluyentes en su participación y efecto en las enfermedades anteriormente mencionadas. La tipificación de la MMP-9 en esta investigación como control positivo daría como resultado el primer paso para poder encontrar nuevas estrategias terapéuticas en la lucha contra distintas patologías del sistema circulatorio. 23

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25 4. Objetivos 4.1 Generales Identificar la presencia de MMP9 en monocitos humanos de sangre periférica por la técnica de western blot. 4.2 Particulares Purificar células mononucleares de sangre periférica de humano Activar células mononucleares de humano con mitógenos inespecíficos Determinación de la presencia de la MMP9 por ensayos de western blot en monocitos humanos activados 25

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27 5. Materiales y Métodos El desarrollo de este trabajo fue realizado en el LADISER inmunología y biología molecular de la facultad de ciencias químicas de la Universidad Veracruzana de la ciudad de Orizaba Veracruz. 5.1 Material biológico El material de partida para realizar la investigación fue sangre periférica extraída por punción venosa, con ayuda del equipo vacutainer que se fundamenta en la extracción de sangre intravenosa al vacío y específicamente de la región cubital del brazo. Se utilizaron tubos sin anticoagulante y en cantidades aproximadas de 7 ml de sangre por tubo, extrayendo dos tubos por cada paciente, la selección del paciente era arbitraria esto quiere decir que no dependía del género ni el estado de ayuno que tuviera cada paciente. Una vez que se obtuvo la muestra en los tubos vacutainer en esterilidad (campana de flujo laminar) se procedió a decantar el contenido a tubos falcon de 15 ml en el cual contenían citrato de sodio 0.1M estéril y que fue agregado en una proporción del 5% usado como anticoagulante. 5.2 Preparación de células mononucleares de sangre periférica Lisis de eritrocitos Homogenizado el contenido de los tubos se procedió a centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos para separar el paquete globular del plasma desechando este último. Teniendo el paquete globular se agregaron 5 ml de buffer PBS 1X (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na 2 HPO 4 7H 2 O 4.3mM, KH 2 PO 4 1.4mM) ph 7.4 estéril a forma de lavado, para posteriormente centrifugar nuevamente durante 5 minutos a 1500 rpm. Una vez terminada la centrifugación se eliminó el sobrenadante dejando intacto el paquete globular que se encontraba en el fondo, agregando nuevamente 5 ml de PBS 1x ph 7.4 estéril. Esto se realizó hasta que el sobrenadante quedó completamente traslúcido. El procedimiento se realizó en total esterilidad dentro de la campana de flujo laminar. 27

28 Una vez terminados los lavados se agregó al paquete globular en proporción 2:1 buffer de lisis ACK (NH 4 Cl 10mM, EDTA 0.1mM, KHCO 3 10mM) ph 7.4 estéril atemperado el cual se dejó actuar por 10 minutos. La correcta acción del buffer ACK se observa por un cambio de la coloración rojiza de la sangre a un color rojo carmín opalescente. La acción del buffer ACK se detuvo agregando 5mL de PBS 1X ph 7.4 estéril, para posteriormente centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos, después de la centrifugación en el fondo del tubo se observó una pastilla de color blanco que fue el concentrado de glóbulos blancos obtenido después de la acción del buffer. Todo el sobrenadante se desechó quedándonos solo con la pastilla, todo el procedimiento se realizó en esterilidad dentro de la campana de flujo laminar. Se eliminó la mayor cantidad de sangre que quedó en el tubo, posteriormente se realizaron lavados a la pastilla resuspendiendo con 5mL PBS 1X ph 7.4 estéril y centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar todos los restos de eritrocitos. Los lavados se realizan hasta que la pastilla queda limpia de restos de eritrocitos Conteo por exclusión con azul de tripano La pastilla lavada y limpia de eritrocitos se resuspendió en 1mL de medio DMEM suplementado con: suero fetal bovino 10%, aminoácidos no esenciales 1%, L-glutamina 2mM, penicilina 100u/mL, Sulfato de estreptomicina 100 µg/ml) ph 7.4 estéril, todo esto se agregó en tubos falcon de 15 ml colocado sobre hielo para evitar que las células se adhieran al plástico. Posteriormente se realizó una dilución 1:250 (1μL de las células con medio DMEM como diluyente). Se tomaron 10 μl de la dilución y se le agregaron 10μL de azul de tripano al 0.4%, las células se dejaron reposar a temperatura ambiente por 2 minutos. Células Vivas: # células / 4 = x 250 x 2 x = Células Muertas: # células / 4= x 250 x 2 x 10000= Figura 5: Fórmula para calcular el total de células viables y muertas 28

29 Finalmente se cargaron 10 μl en la cámara de neubauer y se procedió a contar en la cuadrícula para glóbulos blancos (Figura 6), para realizar el conteo de células vivas y muertas para su posterior plaqueo. (Figura 5) Figura 6: Cámara de neubauer y cuadrícula de contaje Interacción con mitógenos inespecíficos Posteriormente, se realizaron suspensiones celulares para tener 2x10 6 células / ml en cada pozo en presencia de medio DMEM completo, las células se plaquearon en cajas de 24 pozos de fondo plano (Corning) por triplicado. (Figura 7) Figura 7: Placa de cultivo de 24 pozos 29

30 Las condiciones fueron las siguientes: un pozo sin estimulo ( S / E ), otro con LPS (células estimuladas con lipopolisacárido de E. coli 10 μl / 10 μg) y otro con CoA (células estimuladas con Concanavalina A 100μL / 4 μg / ml ) Se rotularon con el tiempo de interacción que tienen con el mitógeno, lipopolisacárido de E. coli (LPS) y Concanavalina A (CoA), quedando de la siguiente manera: 24 hrs, 48 hrs, 72 hrs y 96 hrs. (figura 8) S/E LPS CoA 24hrs S/E LPS CoA 48 hrs S/E LPS CoA 72 hrs S/E LPS CoA 96hrs Figura 8: Ejemplificación de la placa con las muestras y el tiempo de interacción. Terminado el plaqueo, las células fueron incubadas a una temperatura de 37 C en una atmósfera húmeda de CO 2 al 5%. Transcurrido el tiempo de interacción, las células fueron recuperadas en tubos eppendorf de 1.5mL (Figura 9). Figura 9: Tubo eppendorf de 1.5ml 30

31 Las muestras fuero centrifugadas durante 5 min a 1500rpm a 4 C, separando el sobrenadante de la pastilla que se deposito en el fondo. Las células adheridas a la placa de cultivo fueron tratadas con 500 μl de buffer de lisis RIPA (Tris-HCl ph 6.8, NaVO 3 10mM, Triton x %, NaF 10mM, NEM 5mM, IAA 3mM, PMSF 1mM, leupeptina 1μg/mL, E mM) es un buffer formado por inhibidores de proteasas. Terminado todo se recuperó completamente el buffer RIPA de cada pozo y se realizó un pool con cada una de las células obtenidas del sobrenadante, posteriormente todo se guardó en un tubo de 1.5 ml dónde se encuentra la pastilla del mismo pozo, obteniendo así el extracto total de proteínas y esta se guardó a -20 C hasta su uso. 5.3 Geles de poliacrilamida-sds Las proteínas se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10% conteniendo SDS en presencia de amortiguador de muestra (glicerol 2%, SDS 10%, Tris- HCl 50mM ph 6.8, beta-mercaptoetanol 200mM, azul de bromofenol 0.2%) y después fueron visualizadas por tinción con azul de Coomassie. Las condiciones para la realización del gel se muestran en la tabla I. Tabla l: Compuestos y cantidades para la preparación gel de poliacrilamida al 10% SDS Para la identificación de la MMP9 se utilizaron todos los extractos obtenidos después del tiempo de interacción con los mitógenos (LPS, CoA), la muestra fue cargada en los geles de poliacrilamida-sds en presencia de amortiguador de muestra y hervida a 95 C para desnaturalizar y observar mejor su recorrido en el gel. La muestra se corrió en presencia de buffer de corrida electroforética (Tris base 0.025M, SDS 0.1%, Glicina 0.2M), con un primer voltaje de 200V para sacar la muestra del pozo y a 180V para la separación. 31

32 5.4 Western blot (Inmunotransferencia) Las proteínas separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida se transfirieron mediante la aplicación de un campo eléctrico a una membrana de nitrocelulosa. Figura 10: Cassette con los componentes necesarios para realizar la transferencia La transferencia se realizó colocando dentro de los casetes el material necesario (figura 10) después todo el equipo se introdujo a la cuba en presencia de buffer de transferencia ( BCE 10X, metanol absoluto y agua destilada) el cual debe de estar frio, se corre a 80 V por 1 hora (figura 11). Figura 11: Equipo necesario para la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. 32

33 Terminada la transferencia, la membrana de nitrocelulosa debe de ser la que contenga la muestra y el gel debe de estar completamente transparente. La membrana debe ser recortada al tamaño en dónde corrió la muestra eliminando el exceso de membrana. Posteriormente la membrana se trató con buffer TBST leche al 2% (NaCl 150mM, Tween %, leche descremada 2% y Tris-HCl 10mM ph 7.4) durante 40 minutos para bloquear la membrana evitando la fijación de otras proteínas. Finalizado el tiempo de bloqueo, la membrana se lava con PBST 1X (TBS 10X, Tween 20 10%, agua desionizada.) 4 veces durante 10 minutos. Terminado los lavados se agregó a la membrana como anticuerpo primario anti MMP-9 de humano hecho en conejo a una dilución 1:2000, El anticuerpo se dejó incubar a temperatura ambiente durante 2 horas en agitación constante. Pasado el tiempo de incubación del primer anticuerpo se recuperó y se realizaron nuevamente 4 lavados con TBST 1X por 10 minutos para eliminar los residuos del primer anticuerpo. Los anticuerpos unidos a la membrana fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina a una dilución 1:5000 que se dejo en incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación constante, para posteriormente lavar en 4 ocasiones la membrana con PBST 1X y luego fue revelado durante 30 minutos con NBT y BCIP (sigma), y buffer AP 1X (Tris-HCl 100mM, NaCl 100mM, MgCl 2 5mM, Tween %, ph 9.5) 33

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35 6. Resultados y Discusión Después de realizar la electroforesis y la inmunotransferencia de proteínas a la membrana de nitrocelulosa y utilizar los anticuerpos anti-mmp 9 y anti-conejo acoplado a AP, se obtuvieron resultados negativos, esto quiere decir que hay ausencia de la MMP 9 en la membrana, considerando que no hay presencia de la banda esperada de 92kDa como se muestra. (Figura 12). Figura 12: Membrana de nitrocelulosa después del revelado En todos los ensayos realizados no fue posible encontrar la MMP 9 a pesar de que el anticuerpo es especifico y selectivo, no fue lo suficientemente sensible para poder unirse a la MMP 9 que probablemente se encontraba en la membrana pero no en cantidades adecuadas para que el anticuerpo pudiera unirse a esta. Las muestras fueron tratadas con mitógenos como la Concanavalina A y el lipopolisacárido de E. coli que se ha demostrado que intervienen en el ciclo celular estimulando la división celular, la proliferación de diferentes tipos celulares y en ambos casos intervenir en la expresión de las metaloproteinas. 35

36 Por tanto las muestras tenían el medio idóneo para que la MMP9 permaneciera viable o en su defecto pudiera crearse y con esto ser detectada en el western blot. Los tiempos y características de interacción con los mitógenos Concanavalina A y lipopolisacárido de E. coli fueron establecidos a intervalos de 24hrs, 48hrs, 72 hrs y 96 hrs y en una temperatura de 37 C en una atmósfera húmeda de CO 2 al 5%. Todo esto para que las células (monocitos) no sufran estrés y tengan las mejores condiciones para que con ayuda de los mitógenos estimulen el ciclo celular y con los tiempos de interacción prolongados y las condiciones óptimas de temperatura y ambiente los monocitos puedan expresar metaloproteinas y dentro de estas la MMP 9. Los mitógenos fueron elegidos por que se ha demostrado que el lipopolisacárido aumenta la expresión génica, además de que permite extraer proteínas del citoplasma y de la membrana todo esto para que las proteínas sean detectables. La Concanavalina A además de ser un mitógeno de linfocitos se utiliza para identificar glicoproteínas y polisacáridos todo esto basado en la solubilidad de las proteínas en agua o en soluciones salinas además de que estimula la formación de las metaloproteinasas de la matriz extracelular. El western blot se basa en la separación de proteínas según su peso molecular en un gel de electroforesis de poliacrilamida, para posteriormente transferirla a una membrana de nitrocelulosa en la cual se le agregaran anticuerpos específicos para la proteína que se encuentra inmovilizada dentro de la membrana. Atendiendo a esto, la cantidad de proteínas que se encontraban en la membrana después de la transferencia era la adecuada tal como lo podemos corroborar con el gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie (figura 13). En el cual los carriles 2, 4 y 6 son muestras de 72 hrs estimuladas con Concanavalina A, en el que se observan bandas de gran tamaño perteneciente a la albumina proteína de 69kDa y otras bandas cuya identidad se desconocen, pero con esto podemos inferir que nuestra membrana si había proteínas y no se trabajo con una membrana vacía. 36

37 Figura 13: Gel de poliacrilamida-sds teñido con azul de coomassie. Carriles 1,3, y 5 muestras de 72 hrs estimuladas con LPS. Carriles 2, 4 y 6 muestras de 72 hrs estimuladas con Concanavalina A. En el gel no se puede observar una separación tan grande porque la muestra que se corrió estaba con buffer de muestra y buffer ripa, además de que pudo haber quedado restos de medio DMEM por lo tanto es que se ve un conglomerado de proteínas en la parte central del gel. En la investigación no se pudo correr dentro del gel con un control positivo de MMP9, dado que el objetivo de esta investigación es encontrarlo para que posteriormente se pueda seguir con trabajos posteriores. El buffer RIPA se uso porque se obtiene una lisis celular eficiente y una gran solubilización de las proteínas presentes además contiene inhibidores de proteasas todo esto para prevenir la proteólisis y mantener las proteínas integras. La separación electroforética antes realizada para la posterior transferencia a la membrana de nitrocelulosa, pudo no ser la adecuada, que los poros de la matriz de poliacrilamida no hayan sido los adecuados y que por lo tanto la MMP 9 migrará junto con otras proteínas y esto evitara que el Ab pudiera reconocerlo. El primer anticuerpo tiene cruza con rata, ratón y humano es por eso que su uso es viable y es útil para la identificación de la MMP 9 humana y el segundo anticuerpo acoplado a fosfatasa alcalina se puede unir al primer anticuerpo dado que el primero fue hecho en conejo. 37

38 La cantidad de muestra elegida para la corrida electroforética se decidió realizando un gel con diferentes cantidades de extracto (Tabla ll), buffer de muestra y betamercapto etanol todo con la finalidad para elucidar la cantidad necesaria de muestra para que se pudieran observar bandas grandes y migraran de buena forma a través del gel (Figura 14) Figura 14: Gel de poliacrilamida al 10% SDS teñido con azul de Coomassie. En el carril No. 5 se observa la banda con una concentración de 80μL del extracto total de proteína. Tabla ll: Cantidades utilizadas para la preparación de la muestra para su corrida electroforética 38

39 La ausencia de la banda correspondiente a la MMP9 no es visible por diferentes variables tales como la proteólisis durante el tratamiento antes realizado, que los mitógenos utilizados no fueron capaces de acelerar o inducir la traducción de las metaloproteinas en este caso de la MMP 9, o en otra situación, que la cantidad de MMP 9 inmovilizada en la membrana no se encontraba en suficiente concentración para que el anticuerpo pudiera unirse a ella. En la preparación del material biológico, se utilizó buffer PBS 1X estéril todo esto para que las células que se estaban tratando siguieran dentro de un ambiente con concentración de sales idéntica a la del organismo, todo esto para que se mantuvieran viables. El buffer de lisis ACK tiene como objetivo lisar las células rojas de la sangre en una preparación que contiene glóbulos blancos, esto era necesaria ya que solo los glóbulos blancos son los de interés en la investigación dado que los eritrocitos carecen de núcleo y en diferentes publicaciones marcan a las MMP como parte del sistema inmune por lo que fundamentaba más la decisión de usar glóbulos blancos. Cuando se realizó el conteo de células vivas y muertas se hizo con ayuda de azul de tripano este es un colorante que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen claramente de color azul, son consideradas no viables y las que siguen redondas y refringentes son viables. El estudio de las metaloproteinasas de la matriz extracelular en el ámbito clínico es de gran importancia dado que muchas de las patologías crónica-degenerativas como lo son la artritis reumatoide, aneurisma entre otras se dan por la degradación de la matriz extracelular que se da por las metaloproteinasas, por lo tanto su identificación en células de sangre periférica humana como control positivo es de gran ayuda para comenzar nuevas alternativas terapéuticas y con esto iniciar tratamientos más eficientes contra las patologías relacionadas y nombradas anteriormente. La obtención de los monocitos humanos de sangre periférica realizada con los buffer ACK y lavados de PBS se logró satisfactoriamente obteniendo la cantidad necesaria de células para cada una de las condiciones analizadas. 39

40 La interacción de monocitos y los mitógenos en los tiempos establecidos, se logró satisfactoriamente al no perder viabilidad de las células ni muerte celular, lo que conlleva a que se puede seguir usando las cantidades utilizadas sin obtener efectos adversos. La identificación de la MMP9 por ensayos de western blot otorga resultados poco concluyentes, ya que no se presenta la banda esperada en la membrana de nitrocelulosa después del tratamiento con anticuerpos y reveladores. Lo que no significa que no exista la presencia de la MMP9, solo que la técnica elegida para su identificación o las condiciones utilizadas no son las adecuadas para que se pueda identificar esta por ensayos de western blot. 40

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42 7. Conclusión Se lograron obtener células mononucleares de sangre periférica se estimularon con mitógenos inespecíficos, si embargo, bajo las condiciones utilizadas no se logró detectar la presencia de la MMP9 Por lo tanto es de vital importancia seguir intentando nuevas estrategias moleculares para la identificación ya sea como proteína o el gen de esta tales como inmunoprecipitación, western blot con modificaciones en las muestras analizadas o en el tipo y concentración del anticuerpo, RT-PCR, Southern Blot, entre otros. Para que con esto se obtengan controles positivos y seguir trabajando con esta en diferentes líneas de investigación. 42

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44 8. Referencias Bibliográficas 1.- Merchant, Horacio (2005), Biología celular y Molecular, Jiménez,L., PEARSON EDUCACIÓN, México, McDonnell S, Morgan M, Lynch C (1999). Role of matrix metalloproteinases in normal and disease processes. Biochem Soc Trans, 27: Shapiro SD (1998). Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Curr Opin Cell Biol; 10: Nagase H,Woessner Jr. JF (1999). Matrix metalloproteinases. J Biol Chem, 274: Weckroth M, Vaheri A, Lauharanta J, Sorsa T, Konttinen YT (1996). Matrix metalloproteinases, gelatinase and collagenase in chronic leg ulcers. J Invest Dermatol ; 106: Loftus IM, Thompson MM (2002). The role of matrix metalloproteinases in vascular disease. Vasc Med;117-33, Galis ZS, Sukhova GK Lark MW, Libby P (1994). Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest; 94: A. Kierszenbaum, Elsevier Mosby (2008), Histologia y biología celular: Introducción a la anatomía patológica, B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson (2002) Molecular biology of the Cell, Chapter 19 Cell Junctions, Cell Adhesion, and the Extracellular Matrix., NCBI. 44