BIODOSIMETRÍA PARA SOBREEXPOSICIONES CON ALTAS DOSIS, UTILIZANDO CONDENSACIÓN PREMATURA DE CROMOSOMAS (PCC) QUIMICAMENTE INDUCIDA

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1 IX Latin American IRPA Regional Congress on Radiation Protection and Safety - IRPA 2013 Rio de Janeiro, RJ, Brazil, April 15-19, 2013 SOCIEDADE BRASILEIRA DE PROTEÇÃO RADIOLÓGICA - SBPR BIODOSIMETRÍA PARA SOBREEXPOSICIONES CON ALTAS DOSIS, UTILIZANDO CONDENSACIÓN PREMATURA DE CROMOSOMAS (PCC) QUIMICAMENTE INDUCIDA Radl, A. 1 ; Taja, M.R. 1 ; Sapienza, C.E. 1 ; Bubniak, R. 1 ; Deminge, M. 1 ; Di Giorgio, M. 1 1 Laboratorio de Dosimetria Biológica (LDB) Autoridad Regulatoria Nuclear (A.R.N) Av. del Libertador 8250, C1429BNP C.A.B.A, Buenos Aires, Argentina. aradl@arn.gob.ar RESUMEN Se ha observado que las víctimas de sobreexposiciones accidentales a altas dosis muestran mejores posibilidades de sobrevida si reciben un tratamiento médico temprano. El presente trabajo tiene como objetivo describir la metodología que se llevó a cabo en el Laboratorio de Dosimetría Biológica (LDB) de la Autoridad Regulatoria Nuclear de Argentina, para la implementación de la técnica de Condensación Prematura de Cromosomas (PCC) químicamente inducida, a fin de evaluar escenarios de sobreexposición a altas dosis de radiación, en donde la dosimetría biológica convencional mediante el análisis de dicéntricos y anillos presenta limitaciones. Con la finalidad de incorporar el método de PCC como técnica de rutina del LDB se establecieron las condiciones de cultivo, los criterios de análisis y el recuento de PCC-ring en las distintas etapas del ciclo celular. Para ello, se realizaron diferentes actividades en el marco de la Red Latinoamericana de Dosimetría Biológica (LBDNet): a) Intercomparación de Imágenes PCC-r (Año 2010), b) Intercomparación de PCC-r en láminas portaobjetos (Año 2010), c) Intercomparación de Imágenes PCC-r (Año 2012). Todas estas actividades aportaron conocimiento y las herramientas necesarias para confeccionar una Curva de Calibración dosis/respuesta en el rango de 0-20 Gy para esta metodología, que actualmente se encuentra en desarrollo. La armonización de la técnica, los criterios de recuento y una Curva de Calibración dosis/respuesta conjunta para esta técnica, permitirá a la Región la cooperación mutua en la respuesta biodosimétrica en casos de sobreexposiciones accidentales a altas dosis. 1. INTRODUCCIÓN El análisis de las aberraciones cromosómicas inestables (dicéntricos y anillos céntricos), en cultivos de linfocitos de sangre periférica se ha utilizado en la dosimetría biológica en casos de exposición accidental por más de tres décadas. Esta técnica se ha convertido en un procedimiento de rutina en el ámbito de protección radiológica, complementándose con las estimaciones dosimétricas realizadas por métodos físicos (Sreedevi Balakrishnan, et al. 2010) Se ha observado que las víctimas de sobreexposiciones accidentales a altas dosis muestran mejores posibilidades de sobrevida si reciben un tratamiento médico temprano. Es por ello que estas exposiciones requieren una rápida estimación dosimétrica a fin de proporcionar al médico los datos necesarios para la selección del tratamiento más adecuado. En estos casos, es técnicamente posible utilizar parámetros hematológicos tales como el recuento de linfocitos, granulocitos, neutrófilos y plaquetas para evaluar rápidamente a los pacientes. Sin embargo, se ha observado que en las víctimas severamente irradiadas en el accidente de Chernobyl, la hematología proveyó una estimación de dosis menos exacta que la dosimetría biológica (Baranov, et al. 1989). La dosimetría biológica se realiza generalmente analizando

2 dicéntricos y / o translocaciones en primera mitosis a partir de cultivos de linfocitos estimulados in vitro a proliferación mitótica con fitohemaglutinina durante un tiempo de cultivo de alrededor de 48 horas. Las limitaciones de estos ensayos a dosis mayores a 5 Gy son: a) linfopenia debida a la muerte celular, b) detención radioinducida del ciclo celular y c) saturación de la producción de dicéntricos. La consecuencia de estas limitaciones es un índice mitótico bajo, es decir un número de metafases insuficientes para tener un resultado estadísticamente significativo. Se denomina condensación prematura de cromosomas (PCC) a las técnicas que promueven la condensación cromatínica previamente a la primera mitosis. La técnica de PCC es un método biodosimétrico rápido y sencillo, que permite discriminar entre exposiciones parciales y a cuerpo entero. Convencionalmente, PCC es inducida por la fusión entre células en interfase (linfocitos de sangre periférica) y células mitóticas CHO (células de ovario de hamster chino), mediada por virus Sendai o polietilenglicol (PEG) (Johnson y Rao, 1970), permitiendo la difusión de factores promotores de la mitosis sobre la cromatina interfásica. Sin embargo el método de fusión celular es técnicamente dificultoso y laborioso y el rendimiento de PCC es frecuentemente muy bajo. Por lo tanto, han sido probados procedimientos alternativos más simples, rápidos y de mayor rendimiento, que permiten la inducción química de células PCC mediante el uso de inhibidores específicos de la protein-fosfatasa, como el ácido okadaico y la calyculina A. La mayor parte de estos métodos de inducción química requieren que las células se encuentren ciclando en el cultivo. Dentro de los métodos de inducción química, se destacan el método de PCC RICA (Rapid Interphase Chromosome Assay) y el método de PCC-ring. El LDB seleccionó para el uso biodosimétrico a altas dosis la técnica de PCC-r, debido a que es de fácil implementación, susceptible a automatización y de bajo costo. La estimación de la dosis se lleva a cabo a través del recuento de como mínimo 100 anillos PCC o 500 células PCC. Posteriormente se evalúan las frecuencias de anillos PCC, considerando la frecuencia como la relación entre la cantidad de anillos contados y la cantidad de células observadas. A partir de una curva de calibración se relaciona la frecuencia con la dosis a cuerpo entero. Recientemente Lamadrid et al. han demostrado el uso de esta técnica para la confección de una curva dosis-efecto hasta 25 Gy de radiación gamma y 10 Gy de neutrones. De acuerdo con las directrices del OIEA, cada laboratorio de dosimetría biológica debería contar con su propia curva de calibración. Sin embargo, esto resulta dificultoso para laboratorios con escaso número de personal por la demanda de tiempo de trabajo involucrada. Una forma de superar estas dificultades es realizar curvas de calibración conjuntas entre laboratorios que operan en Red. Para ello es necesario establecer protocolos armonizados y unificar los criterios de recuento para que todos los países de la Región puedan contar con una curva armonizada para ser utilizada en casos de sobreexposición accidental a altas dosis. 2. METODOLOGÍA 2.1. Puesta a punto de la técnica de PCC-r en el LDB de Argentina a fin contar con un protocolo reproducible que pueda ser utilizado por todos los laboratorios de la Red.

3 *Comparación de resultados utilizando como agente inductor de PCC, ácido okadaico y calyculina A en linfocitos de sangre periférica irradiados: En los cultivos de linfocitos en los cuales se incorporó Calyculina A, la morfología de las células PCC resultó ser la apropiada para la observación al microscopio óptico, facilitando el recuento de las mismas y permitiéndose distinguir los anillos PCCs de manera clara. Por el contrario la utilización del ácido okadaico resultó en una producción de células PCCs de menor calidad, los fragmentos PCCs se encontraban más condensados y más cortos, dificultando la lectura y así mismo el recuento de los anillos (Figura 1). Figura 1: Microfotografía izquierda: M PCC con 3 anillos (flechas rojas) después de la exposición a 10 Gy 60 Co con Calyculina A. Microfotografía derecha: G2 PCC con 2 anillos (flechas rojas) después de la exposición a 10 Gy 60 Co con Ácido Okadaico. El LDB de Argentina optó por el uso de la calyculina A como agente inductor de la condensación prematura de cromosomas teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los ensayos llevados a cabo. Asimismo el bajo costo del reactivo y el rendimiento del mismo comparado con el uso del ácido okadaico, permite a otros laboratorios de la Red reproducir la técnica de PCC-r con la finalidad de trabajar de manera coordinada y de forma cooperativa en caso de ocurrir un accidente con altas dosis de radiación Armonización del procedimiento para llevar a cabo la técnica de PCC químicamente inducida en cada uno de los laboratorios de la Región Latinoamericana, incluyendo los criterios de recuento de células PCC y el cálculo del índice PCC. Durante la Reunión de la LBDNet, efectuada en Lima-Perú, entre los días de Noviembre de 2009, se establecieron las condiciones estándar de cultivo a fin de armonizar los criterios con respecto a la técnica. Las mismas fueron las siguientes: a. Partir de una muestra de sangre entera (~500 µl) b. Realizar un cultivo de linfocitos de 48 h a 37 C (con CO 2 al 5%) utilizando los siguientes reactivos: Medio de Cultivo RPMI 1640 Gibco suplementado con 1-1,5% de L- glutamina (~4 ml) Suero Bovino Fetal Certificado Gibco (20% - 25%)

4 Fitohemaglutinina M Gibco (3%) Colcemida Gibco, añadida a las 24 h de iniciado el cultivo (40 ng/ml) c. A las 46,5 h de iniciado el cultivo, colocar una solución 50 nm de Calyculina A. Para el cálculo del índice PCC (a partir de 500 células) se consensuó la aplicación de la siguiente formula (1) (Kanda et al., 1999) (Figura 1): Índice PCC = Nº de células PCC (fases G1+S+G2+M+A) x 100 (1) (Nº de células PCC + Nº de núcleos celulares estimulados) Figura 1: Microfotografía de campo de análisis para el cálculo del índice PCC Referencias: Recuadros verdes: células PCC en distintas fases del ciclo celular. Círculos amarillos: Núcleos estimulados, se aceptan. Círculos Rojos: Núcleos no estimulados, no se aceptan Realización de una intercomparación de imágenes para la técnica de PCC-r en el marco de la LBDNet, a fin de unificar los criterios de recuento (Año 2010). El LDB de Argentina y Cuba, proporcionaron la galería de imágenes para llevar a cabo dicha intercomparación. Este ejercicio permitió establecer los criterios unificados para el recuento de células PCC. Dichos criterios se detallan en las Tablas 1 y 2:

5 Tabla 1. Criterios para reconocer las distintas fases del ciclo celular Fase Estructura del cromosoma No de No de Separación entre cromátidas elementos cromátidas G No hay G Juntas Ligeramente separadas Totalmente separadas (No se distingue centrómero) G2 Alrededor de 92 2 Juntas Ligeramente separadas Totalmente separadas (No se distingue centrómero) M 46 2 Unidas por el centrómero A Alrededor de 92 2 Totalmente separadas formando ángulo a partir del centrómero > <, < > Tabla 2. Criterios para el recuento de los anillos en función de la fase del ciclo celular Fase Criterio Ejemplo Se observa Se cuenta G1 Un anillo formado se observa como 1 1 un solo anillo G2 Dos anillos piezas Un anillo grande (Moebius) 1 1 Un anillo pequeño 1 1 G2 92 piezas Dos anillos 2 1 Un anillo grande (Moebius) 1 1 Un anillo pequeño 1 1 M Un solo anillo con centrómero 1 1 A Un solo anillo sin centrómero 1 1 Un anillo en forma de 8 ( unido por 1 1 el centrómero ) Dos anillos idénticos sin centrómeros 2 1 Se siguen los mismos criterios que en G2 (92 piezas) 2.4. Realización de una intercomparación de PCC-r en láminas e imágenes durante el período , para el análisis de la frecuencia de anillos en linfocitos humanos expuestos a dos puntos de dosis (radiación gamma), en el marco de la LBDNet.

6 El ejercicio consistió en: Puntos que se evaluaron: Resultados: Irradiación de dos muestras de sangre venosa periférica en dos puntos de dosis (DI y DII - 60 Co) en el Centro de Protección e Higiene de las Radiaciones- Cuba (CPHR). Procesamiento de las muestras en el laboratorio del CPHR. Envío de las láminas al LDB de Argentina para su distribución a la Red. Reconocimiento de las células PCC en cada fase del ciclo celular. Reconocimiento de las aberraciones cromosómicas (anillos) con luz en su interior y posibles anillos sin luz en su interior con un diámetro superior al ancho de la cromátida. Cálculo de la frecuencia PCC a partir del análisis de 100 anillos ó 500 células (valor que se alcance primero) Cálculo del índice PCC (según el criterio de Kanda et al., 1999) para la DI y DII, a partir de 500 células analizadas. Los resultados fueron evaluados teniendo en cuenta el siguiente criterio de aceptación: DI (dosis física)= 4,5 Gy ± un error del 20%. DII (dosis física)= 9 Gy ± un error del 20%. El estadístico de desempeño aplicado en el análisis de los resultados del LDB de Argentina se describe por la siguiente formula (2): x X D% 100 X A continuación se resumen los resultados de las intercomparaciones mencionadas anteriormente: Ejercicio de intercomparación realizado sobre láminas: DI (estimada por el LDB)= 4,57 Gy D % = 1,53% DII (estimada por el LDB)= 9,96 Gy D % = 10,66% Ejercicio de intercomparación realizado sobre imágenes: DI (estimada por el LDB)= 3,37 Gy D % = 25,11% DII (estimada por el LDB)= 8,53 Gy D % = 5,22% Los resultados del LDB de Argentina fueron satisfactorios tanto para la intercomparación de láminas como para la de imágenes, excepto para la DI (imágenes) donde se observa una (2)

7 ligera subestimación de la dosis. Los resultados más favorables fueron los obtenidos en la intercomparación realizada sobre láminas. Esto indica que el análisis de los anillos bajo microcopio óptico es más preciso que el análisis de los mismos en imágenes digitales, ya que, las mayores discrepancias se encuentran al momento del recuento de los anillos sin luz, los cuales al microscopio óptico resultan más fáciles de distinguir Organización por parte del LDB de Argentina durante el año 2012 de un ejercicio interlaboratorio para la construcción de una curva de calibración in vitro para la técnica de PCC, a fin de fortalecer la capacidad de respuesta en situaciones accidentales que involucran altas dosis de radiación y requieran la activación de mecanismos de asistencia mutua. Para este fin se realizaron las irradiaciones de muestras de sangre in vitro en el Centro Regional de Referencia para Dosimetría de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA), con una fuente de 60 Co (tasa de dosis: 0,5 Gy/min), en aire, en condiciones de equilibrio electrónico. Las dosis administradas a las muestras fueron: 0 Gy, 5 Gy, 7 Gy, 10 Gy, 15 Gy y 20 Gy. Se llevaron a cabo los cultivos celulares de dichas muestras y se distribuyeron entre los países de la Región en la Reunión Regional Sobre Actualización de Protocolos de Laboratorio, Ejercicios de Intercomparación y Normativa (LBDNet) Santiago de Chile, 4 al 8 de junio de Los resultados del análisis de las muestras serán procesados en Marzo de Esto permitirá contar con una curva de calibración para la técnica de PCC-r que podrá ser utilizada por todos los Laboratorios de la Red en caso de situaciones accidentales con altas dosis de radiación. 3. CONCLUSIONES Las actividades llevadas a cabo durante el período permitieron: Generar los criterios de análisis y recuento de anillos en las distintas etapas del ciclo celular, así como también los criterios de aceptación y rechazo de cada una de las células analizadas para todos los laboratorios de la Región. La posibilidad de analizar imágenes PCC-r, lo cual generó una nueva herramienta que proporcionará una rápida y eficiente estimación dosimétrica, evitando el transporte y manipulación de muestras biológicas. Iniciar las actividades para la construcción de una curva de calibración in vitro para la técnica de PCC-r, para situaciones accidentales que involucren altas dosis de radiación y requieran la activación de mecanismos de asistencia mutua. Los resultados obtenidos y el desarrollo de una curva de calibración in vitro permitirán la incorporación del ensayo de PCC-r como técnica de rutina en el LDB de Argentina. Así mismo, a través de la técnica de PCC-r se pueden realizar diversos estudios ampliando los conocimientos respecto a: Heterogeneidad de la dosis. Comparación de la frecuencia de dicéntricos respecto a los PCC -r El impacto de la tasa de dosis y otras calidades de radiaciones.

8 Por sus características de fácil implementación, susceptibilidad de automatización, y simplicidad en cuanto al equipamiento requerido (dado que se utiliza el mismo que para el ensayo de citogenética convencional), indican que la técnica de PCC-r, muestra una relación costo-beneficio favorable para ser aplicada como herramienta biodosimétrica en las redes de cooperación mutua. AGRADECIMIENTOS El Laboratorio de Dosimetría Biológica de la Argentina agradece a los miembros de la Red Latinoamericana de Dosimetría Biológica (LBDNet) en el marco del proyecto OIEA- RLA/9/074, por su activa participación y cooperación. Además, hace extensivo este agradecimiento al Centro Regional de Referencia para Dosimetría de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) por su colaboración con las irradiaciones realizadas. REFERENCIAS 1. Sreedevi Balakrishnan, Kapil Shirsath, Nagesh Bhat, Kshiti Anjaria Biodosimetry for high dose accidental exposures by drug induced premature chromosome condensation (PCC) assay, Mutat. Res. 699: Johnson, R.T; Rao, P.N Mammalian Cell Fusion: Induction of Premature Chromosome Condensation in Interphase Nuclei, Nature. 226, Lamadrid AI, García O, Delbos M, Voisin P, ROY L PCC-ring Induction in Human Lymphocytes Exposed to Gamma and Neutron Irradiation, J. Radiat. Res., 48, Kanda, R., Hayata, I., Lloyd, D.C Technical Report. Easy biodosimetry for high-dose radiation exposures using drug-induced, prematurely condensed chromosomes, Int. J. Radiat. Biol.; 75(4):