MEMORIA PRÁCTICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA. Laura Mariño Puertas

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1 MEMORIA DE PRÁCTICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Laura Mariño Puertas

2 ÍNDICE: Páginas 1. Laboratorio de reproducción asistida 2 2. Esterilidad 3 3. Seminograma 4 4. Inseminación artificial 7 5. Punción folicular 7 6. FIV 8 7. ICSI 9 8. Transferencia de embriones Criopreservación embrionaria Donación de óvulos 11 1

3 1. El labotarorio de reproducción asistida: En un laboratorio de reproducción asistida se observan tres partes separadas entre sí: -Parte administrativa. -Laboratorio de andrología. -Laboratorio de fecundación in Vitro (FIV) Parte administrativa: En la parte administrativa del laboratorio están todas las historias, informes, factura archivadas, así como un equipo informático con el programa adecuado para llevar un control exhaustivo de los ciclos de cada paciente. Aquí también se encuentran todos los libros relativos a la materia, que permiten conocer la teoría de todo lo que se pone en práctica y profundizar en aquellos temas de mayor interés, además del Manual de la OMS, fundamental para conocer los parámetros de la embriología y las técnicas más novedosas Laboratorio de andrología: Debe ser un lugar estéril, así que deberá usarse una ropa y calzado especial para evitar la contaminación del laboratorio, así como guantes y gorro. Se debe tener en cuenta que el material de este laboratorio no puede tampoco salir de aquí ni entrar en el otro laboratorio para no contaminar a los ovocitos ni a los embriones. Consta de: -Mesa de trabajo con microscopios ópticos. -Centrífuga. -Nevera. -Banco de esperma y embriones congelados. -Máquina de congelación. -Bombona de nitrógeno líquido. -Y todo el material necesario para el procesamiento del semen Laboratorio de FIV: El laboratorio de FIV ha de cumplir una serie de requisitos indispensables: -Debe estar comunicado con el quirófano. -El trabajo se desarrolla en condiciones de extrema asepsia para lo cual el acceso está restringido al personal profesional que en él trabaja equipado con indumentaria especialmente apropiada que protege y aisla al laboratorio del medio externo, además de gorro y mascarilla (los guantes solo se usarán cuando tratemos las muestras de la paciente directamente recogidas, el resto del material será procesado sin ellos, para no comprometer la viabilidad de los ovocitos y embriones). 2

4 Los medios técnicos que aquí podemos encontrar son los siguientes: -Cabinas de flujo laminar: se usan para manejar ovocitos y embriones humanos. En estas cabinas existe una corriente constante de aire filtrado que asegura que no lleguen a las placas ningún agente contaminante o patógeno. -Incubadores: ya que los embriones y ovocitos son muy sensibles a cambios de temperatura y ph, aquí se colocan bajo condiciones controladas de ph y temperatura. -Micromanipuladores adaptados a sus correspondientes microscopios invertidos, donde se lleva a cabo la microinyección espermática. -Placas calefactoras que permiten manipular y mantener a 37 C las placas con ovocitos y embriones fuera del incubador. - Filtrador que depura el aire de la habitación para mantenerla lo más aséptica posible. El material que se utiliza en un laboratorio de reproducción asistida es de un solo uso por paciente y se elimina una vez acabado el ciclo, en recipientes especiales para el tratamiento de residuos biológicos de tal manera que resulte imposible una contaminación entre pacientes. 2.Esterilidad: Normalmente se inicia el estudio de la fertilidad de la pareja si después de un año de relaciones sexuales no protegidas no son capaces de concebir, ya que lo normal es que una mujer fértil lo haga en el plazo de un año). Sin embargo hay una serie de causas diversas que lo pueden dificultar: a)extragenitales: edad, estrés, enfermedad.. b)genitales: azoospermia, amenorrea de más de seis meses El más importante de estos factores es la edad, que en la mujer condiciona la capacidad reproductora y se sabe que disminuye alarmantemente a partir de los 35 años, empeorando la calidad ovocitaria y la capacidad del útero para llevar un embarazo a buen término Causas de infertilidad femenina: -Edad. -Síndrome de ovarios poliquísticos. -Endometriosis. -Hidrosalpinx. -Leiomioma. -Malformaciones uterinas. -Desconocida en muchos casos Causas de infertilidad masculina: -Mala o baja concentración y/o calidad de los espermatozoides que puede ser debido a causas congénitas, traumáticas, inflamatorias, enfermedades de transmisión sexual o alteraciones mecánicas o funcionales que impidan la eyaculación. 3

5 3.Seminograma: Es la prueba básica en el estudio del hombre infértil. Es aconsejable realizar de dos a tres con intervalos de 2-3 meses entre ellos para observar las grandes diferencias y variaciones fisiológicas que se producen. Los pacientes deben: -Respetar un periodo de abstinencia sexual de 3-5 días. -Obtener la muestra por masturbación directamente en el envase de plástico estéril entregado por la clínica. En ningún caso usar preservativos normales ya que éstos contienes lubricantes y espermicidas. Escribir en el envase el nombre del paciente y sus datos, así como la fecha y hora de recogidas de la muestra y lugar (casa o clínica) y una ficha con esta información también, además de dirección, teléfono de contacto, días de abstinencia sexual, medicamentos tomados (en su caso) a lo largo de la semana. -Llevar la muestra lo antes posible al laboratorio en el caso de muestra recogida en casa, marcada y cerrada correctamente, envuelta en papel de plata y dentro de una bolsa. El seminograma consta de tres partes: Examen macroscópico de la muestra; volumen, ph, color, olor y viscosidad. Examen microscópico de la muestra; concentración, viabilidad, movilidad y morfología de los espermatozoides. Estudio de capacitación; REM. Los valores de normalidad de la muestra: Concentración espermática; 20 millones de espermatozoides por ml, cuando la cantidad de espermatozoides es menor se denomina Oligozoospermia. La ausencia total de espermatozoides se denomina Azoospermia. Movilidad espermática; la movilidad progresiva y rápida y progresiva y lenta debe ser del 50 %. Cuando es porcentaje es inferior se denomina Astenozoospermia. Viabilidad espermática; se denomina Necrozoospermia cuando existen más de 25% de espermatozoides muertos. Morfología espermática; debe haber al menos 15% de formas normales. Los espermatozoides están formados por la cabeza, la pieza intermedia, y la cola. Cuando la cantidad de formas normales es menor se denomina Teratozoospermia. Cuando todos los parámetros son normales se denomina Normozoospermia. En algunos casos se puede solicitar un estudio hormonal, inmunológico o/y bacteriológico. 4

6 3.1.-Criterios de normalidad de la OMS para el semen: ANORMAL ANORMAL Volumen 1,5-2 ml < 1,5 ph 7,2-8,2 < 7,2 ó > 8,2 Concentración 20* *10 6 Movilidad 50% (a+b) <50% <25% tipo a Morfología 15% o más de formas anormales <15% ó 14% de formas anormales Licuefacción: una muestra de semen normal se licua en aproximadamente minutos a temperatura ambiente. Aspecto: el semen humano es normalmente un líquido homogéneo opaco de opalescente de color blanco-amarillento Examen microscópico del semen: Existen diferentes cámaras diseñadas específicamente para el recuento de células, la más utilizada para espermatozoides es la cámara Makler, que nos permite estudiar tanto la concentración como la movilidad. En función de la movilidad hay cuatro tipos de espermatozoides: a)móviles progresivos rápidos. b)móviles progresivos lentos. c)móviles no progresivos (vibran). d)inmóviles. La morfología espermática es importante para completar la evaluación de la muestra de semen, se estudia en muestras teñidas con tinción de hemacolor: -Se prepara una extensión de semen y se deja secar al aire. -Pasamos la muestra seca durante 5 segundos por cada uno de los siguientes reactivos: eosina(colorante básico que tiñe el núcleo) y hematoxilina (colorante ácido que tiñe el citoplasma). -Lavamos con agua destilada y se deja secar a temperatura ambiente. El estudio de la extensión se hará con un microscopio de campo claro con un objetivo de 100X con aceite de inmersión. 5

7 3.3-REM (nº espermatozoides móviles recuperados): REM = N * %R * V Donde: -N es el nº de espermatozoides/ml contados en la cámara Makler. -%R %espermatozoides a+b recuperados. -V es el volumen de medio con espermatozoides móviles Protocolo seminograma: La capacitación espermática es la parte del tratamiento de reproducción asistida que se encarga de separar los espermatozoides de mejor calidad del resto y la eliminación del líquido seminal. Existen dos métodos: -Swing- up. -Gradiente de densidad. SWING UP Se basa en la capacidad de los espermatozoides para desplazarse hacia arriba desde el fondo del tubo. De esta forma las células y espermatozoides inmóviles permanecen en el fondo mientras que los espermatozoides de mayor movilidad alcanzan el medio de cultivo sitiada en la parte superior. Se distribuye la muestra de semen en varios tubos estériles y se les agrega muy lentamente el medio de cultivo, de manera tal que no se mezcle con el semen que se encuentra en el fondo del tubo. Se deja en estufa durante 1 hora. De esta manera los espermatozoides que son móviles nadaran hacia arriba, hacia la fase de medio de cultivo, quedando los inmóviles abajo del tubo junto con el plasma seminal. Luego se toma con una pipeta de vidrio estéril la fase de medio donde se encuentran los espermatozoides móviles y se centrifuga para lavarlos en un tubo aparte. De esta manera obtenemos una suspensión de espermatozoides móviles. 6

8 GRADIENTE DE DENSIDAD Consiste en separar los espermatozoides móviles de la muestra inicial haciéndolos pasar por una columna preparada con microbolitas en un tubo estéril, esta columna tiene dos fases: una más densa que la otra. Se coloca una muestra de semen sobre la columna y se centrifuga. De esta manera los espermatozoides móviles nadan hacia abajo por efecto de la centrífuga a través de las microbolitas hacia el fondo del tubo quedando los espermatozoides inmóviles arriba. Luego se separa la fracción de espermatozoides móviles, se los lava con medio de cultivo y se obtiene la suspensión. Este tipo de procedimiento se aplica cuando la muestra inicial de semen está muy contaminada con otro tipo de células (por ejemplo las células redondas) y es necesario separar rápidamente los espermatozoides móviles del plasma seminal. También se aplica como segunda alternativa cuando por algún motivo no se recupera una concentración adecuada de espermatozoides móviles por swing- up. 4.INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: La inseminación artificial se define como el depósito instrumental de espermatozoides en el tracto reproductivo de la mujer con la finalidad de conseguir la gestación. Distinguimos dos clases: la inseminación artificial conyugal (I.A.C.), realizada con semen del marido, y la inseminación artificial realizada con semen de un donante (I.A.D.).La técnica de inseminación artificial más utilizada es la intrauterina y para aumentar su eficacia es necesario asociarla a la inducción de ovulación (indicada cuando existe una disfunción de la ovulación) y a las técnicas de capacitación espermática (para mejorar e incrementar el potencial de fertilidad de los espermatozoides). Los requisitos indispensables para poder utilizar esta técnica son la constatación de permeabilidad de las trompas de Falopio y que tras la capacitación espermática se puedan recuperar un mínimo de 3 a 5 millones de espermatozoides móviles. 5. PUNCIÓN FOLICULAR: La punción folicular es la aspiración de los folículos que se realiza mediante ecografía transvaginal puncionando los ovarios sin tocar el útero y sometiendo a la paciente a una anestesia general o sedación. El líquido folicular se recoge en tubos que contienen un medio tamponado previamente calentado a 37 C. 7

9 6.FIV: Esta técnica consiste en la fecundación de los óvulos obtenidos por punción folicular (fuera del organismo materno), la división celular de los cigotos en el laboratorio y la posterior introducción de los embriones obtenidos en el aparato genital de la mujer. A las 48 horas de la punción, en el laboratorio de fecundación in vitro se seleccionan los embriones obtenidos de mejor calidad biológica, normalmente dos, y se introducen en una cánula para depositarlos en el útero. Siempre se recomienda tratamiento de fase lútea, que consiste en administrar a la paciente progesterona por vía oral o vaginal. Los resultados obtenidos con esta técnica son de entre un 30% y 50% de tasa de gestación por ciclo. La FIV (fecundación in vitro) consiste en la fertilización del ovocito (al que se le ha eliminado el complejo cúmulo-corona) con una muestra de espermatozoides mejorados por una de las técnicas de capacitación espermática. Primero añadimos los espermatozoides a la placa para que se repartan uniformemente y después los ovocitos que previamente han sido extraídos unas 4-6 horas antes por punción folicular. Dejamos la placa en el incubador y esperamos que haya fecundación. 8

10 7.ICSI: Consiste en la introducción de un solo espermatozoide dentro del óvulo. Con esta técnica se pueden beneficiar todos los casos de infertilidad masculina que en otro tiempo necesitaban un mínimo de espermatozoides para poder lograr la fecundación. Incluso los avances más recientes han permitido la microinyección con espermatozoides recuperados directamente del testículo en varones azoospérmicos, sin espermatozoides en el eyaculado. Las pipetas de microinyección son el eje fundamental sobre el que se asienta la técnica de ICSI de forma que la calidad de las pipetas, sea determinante en el éxito de la fecundación y, sobre todo, en las tasas de degeneración ovocitaria. Son dos, con forma y función diferentes: - Pipeta de sujeción o holding que nos permite fijar el ovocito, de modo que podamos penetrar con la pipeta de inyección por el otro polo. - Pipeta de inyección o de ICSI, es mucho más estrecha y con un afilado aguijón que nos permite entrar en el espermatozoide fácilmente y con menor riesgo de degeneración. Antes de colocar las pipetas en el micromanipulador hay que asegurarse de que los sistemas de inyección tienen aceite suficiente y están bien purgados. En primer lugar se colocan las dos pipetas enfrentadas a la misma altura y se comprueba que hay suficiente espacio por debajo para poder colocar la placa de ICSI. Cogeremos de la placa con espermatozoides aquellos que nos parezcan mejor (usaremos el criterio de forma prefecta y buena movilidad) y tantos como ovocitos tengamos. Los paramos con un golpe en la cola con la pipeta de inyección y los succionamos. Los dejamos en medio para ICSI en un extremo cuyo borde marcamos con la pipeta. Tomamos uno a uno los espermatozoides para hacer fecundación, siempre cogiéndolos por la cola para que lo primero que entre en el ovocito sea la cabeza (o eso procuraremos porque hay veces que se dan la vuelta dentro de la pipeta). El ovocito lo sujetamos son la pipeta holding con el cuerpo polar orientado en posición 6 ó 7 del reloj y con la otra pipeta inyectamos el espermatozoide a las 3 del reloj, siempre vertiendo el medio de la otra pipeta fuera del ovocito (para inyectarle la menor cantidad de medio posible). Rompemos el citoplasma del ovocito (se nota porque al 9

11 absorber entra el citoplasma en la pipeta de golpe) y entonces lo introducimos de nuevo en la célula junto con el espermatozoide. Sacamos con muchísimo cuidado y siguiendo la trayectoria con la cual entramos. Lavamos los ovocitos microinyectados y trasladamos a una placa de cultivo. Pasadas unas 17 horas podemos valorar si ha habido fecundación y si esta está siguiendo su curso normal. 8. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES: No se suelen transferir más de 3 embriones a la vez por el riesgo de embarazo múltiple, pero así aumentamos la probabilidad de embarazo. La técnica empleada es la transferencia intrauterina de embriones por vía vaginal, generalmente en los días D+2 o D+3 o blastocistos. Los embriones son introducimos en la cavidad intrauterina mediante un catéter a través del canal cervical. Se acopla la jeringuilla al catéter que se va a emplear y se siguen los siguientes pasos: -Antes de acoplar la jeringuilla al catéter se purga. -Se acopla la jeringuilla al catéter. -Se aspira una pequeña cantidad de aire. -Se aspira una pequeña cantidad de medio de cultivo, luego un poco de aire, posteriormente los embriones con la menor cantidad de medio posible, un poco de aire y un poco de medio. -Se introduce el catéter en el endocérvix y se expulsan suavemente los embriones a la cavidad uterina. -Por último, comprobamos que no se han quedado los embriones en el catéter. 10

12 9.CRIOPRESERVACIÓN EMBRIONARIA: Los embriones que no se van a utilizar pueden congelarse. Esto permitirá a la paciente que si no queda embarazada en este ciclo pueda intentarlo al menos una vez más. La tasa de supervivencia postdescongelación es bastante variable y depende de la calidad embrionaria inicial, pero la media oscila alrededor del 75% y la de gestación por ciclo entre el 20% y 25%. 10.DONACIÓN DE ÓVULOS: Se trata de una técnica de fertilización in vitro en la que una donante anónima aporta los óvulos que se van a fertilizar y los embriones resultantes son transferidos a la receptora. Se podrán beneficiar de esta técnica pacientes con fallo ovárico primario, fallo ovárico prematuro, menopausia, anomalías genéticas, fallos repetidos de FIV, mujeres mayores de 40 años con ciclo menstrual normal y mujeres con imposibilidad de recuperar ovocitos por punción transvaginal o por laparoscopia. Las donaciones de óvulos suelen proceder de mujeres menores de 35 años, que realizan la donación de forma altruista. La receptora precisa recibir tratamiento para desarrollar una mucosa endometrial capaz de implantar los embriones transferidos. Tras días de preparación la paciente ya puede estar en situación de ser receptora y continuar con el tratamiento hasta dos o tres meses. Los resultados que se obtienen con esta técnica son aproximadamente del 50%-60% de embarazo por transferencia, lo que significa que es la técnica de reproducción asistida más eficaz. 11

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