Prof. Marcelo Del Campo, DMV, MSC. PHD. Universidad de la Frontera Temuco Chile

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1 CAPÍTULO IV METODOLOGÍA Y TÉCNICAS PARA REALIZAR FERTILIZACIÓN IN VITRO EN BOVINOS Autor: Prof. Marcelo Del Campo, DMV, MSC. PHD. Universidad de la Frontera Temuco Chile

2 73 INTRODUCCION FECUNDACIÓN IN VITRO EN BOVINOS: METODOLOGÍA Y TÉCNICAS Marcelo R. Del Campo y Ximena Donoso Universidad de La Frontera Temuco, Chile Los resultados de la fecundación in vitro (IVF) en el bovino están influenciados por una serie de factores tales como; el laboratorio mismo, la experiencia de los técnicos, la preparación de los gametos, la preparación de los medios de cultivos etc. Tal vez una de las tareas más difíciles para aquel que recién comienza a trabajar en IVF es encontrar las bases de las recetas. Después que esto se aprende comienzan las modificaciones y cada grupo de trabajo hace las que más le acomodan, sin embargo las bases no cambian. Pero no hay duda que lo mejor es realizar un entrenamiento hands on en un laboratorio... y practicar, practicar y practicar. Con el objeto de guiar a aquellos estudiantes hemos escrito nuestras Notas de Laboratorio, que han sido aprendidas de otros laboratorios en los que hemos trabajado y entre los que podemos mencionar los laboratorios de los Drs. T. Greve y P. Hyttel en Dinamarca, Dr. A. Hanada en Japón, Dr. O. Ginther, Dr. N. First y Dr. J. Parrish en USA, Dr. R. Mapletoft en Canadá y Dr. C. Barros en Chile. Para ellos y para todos los profesores que nos han enseñado no solo técnicas sino una filosofía de trabajo vayan nuestros mas grandes agradecimientos. Estas notas están escritas en orden cronológico en la primera parte se comenta en forma general la metodología y la técnica de la IVF en bovinos, en la segunda parte se entrega la forma de realizarla y en la tercera parte las recetas de las soluciones y medios de cultivo y como se preparan los stocks. En el anexo se entrega el material e items de laboratorio necesarios, instrumentos y compuestos. Estas notas solo servirán de guía de laboratorio y no pretenden enseñar IVF como tal. Hay que tener presente que pasan de moda y a medida que pasa el tiempo se descubren otras más eficientes. Es recomendable entones escribir sus propios protocolos y mantenerlos actualizados. BREVE HISTORIA Han pasado más de 100 años que Hermann Fol, un Zoologista suizo, observó por primera vez un espermatozoides penetrando a un ovum de estrella de mar y la formación de la primera célula del futuro embrión (42). Las primeras investigaciones se hicieron en especies de invertebrados marinos. La razón de esto, es que la fecundación ocurre afuera de la hembra (en agua de mar), al contrario de los mamíferos. Desde 1950, las técnicas de IVF han sido desarrolladas y perfeccionadas de tal forma que el cultivo, la fecundación y

3 74 el desarrollo embrionario temprano se lleva a efecto in vitro. Esto ha permitido estudiar y entender en mejor forma las interacciones ovum-espermatozoide en los animales mamíferos (21, 23). La naturaleza de los mecanismos y la secuencia de los cambios que ocurren a nivel molecular en la fecundación, también han sido investigados, especialmente en algunas especies de laboratorio, pero relativamente poco se sabe en animales domésticos de granja. La primera cría nacida por IVF fue reportada en el conejo en 1959 (11) y en 1968 en la ratón de laboratorio (43). En 1977, se obtuvo la primera IVF en el bovino, con semen capacitado en el oviducto o en el útero de la vaca o útero de la coneja (28). Cuatro años más tarde se reportó la primera cría nacida a través de transferencia, de un embrión de 4 células en el oviducto de una vaca. En este caso, los ovocitos fueron madurados in vivo, y la fecundación se realizó in vitro con semen capacitado con una solución con alta concentración iónica (5). El primer ternero resultado de un ovocito madurado in vitro y fecundado in vitro nació en 1986 después que el embrión fue cultivado en el oviducto de una oveja por 5 días (9). Sin embargo, los primeros terneros nacidos de ovocitos madurados in vitro (IVM), fecundados in vitro (IVF) y cultivados (desarrollo temprano) in vitro (IVC) se reportó en 1987 (22). TECNICA Y METODOLOGIA DE LA FECUNDACION IN VITRO EN EL BOVINO Para llevar a cabo la IVF en el bovino se necesita realizar varios pasos los que comprenden: Recuperación de los complejos cumulus ovocitos (COC) de los ovarios, ya sea de especímenes colectados en el matadero o recuperados de hembras vivas. Maduración y fecundación de los COC's ya sea con semen fresco o congelado/descongelado y, por último, producción de cigotos los cuales son cultivados por un período corto de tiempo (7-9 días) para su desarrollo. Los embriones así producidos pueden ser transferidos inmediatamente a receptoras, congelados o destinados a otros propósito. Hay que distinguir que en la técnica de IVF desarrollada rutinariamente en los laboratorios de investigación se usan ovarios (para la recuperación de ovocitos) de hembras que han sido faenadas en el matadero, que no tienen prácticamente ningún valor genético. Por supuesto, en programas reproductivos, estos embriones producidos in vitro provienen de hembras de alto valor genético.. Cada etapa nombrada anteriormente, precisa de mecanismos de los cuales aún muchos de ellos no han sido completamente determinados. Por ejemplo, los mecanismos intrínsecos de la maduración de los ovocitos, la capacitación espermática y la reacción del acrosoma son alguno de estos eventos en los cuales se necesita mayor investigación para que la técnica de IVF pueda ser repetible y sin gran variación (en lo que se refiere a producción de embriones).

4 75 RECUPERACION DE LOS COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITOS (COCs) Existen diferentes técnicas de recuperación de COCs según se trate de material de matadero o de hembras vivas. De material de matadero: a. Aspiración del líquido folicular (folículos 2 < 6 mm) b. Desmenuzamiento del ovario (folículos < 2 mm) De hembras vivas: a. Aspiración con aguja y ultrasonografía b. Aspiración con aguja y endoscopía c. Laparatomía (usada solo en casos muy especiales) De material de matadero Los ovarios, colectados de hembras faenadas son transportados en termos que contienen suero salino (35 o ±2 C). La aspiración de los ovocitos, se realiza aproximadamente dentro de 4 a 6 h después de faenado los animales. A menudo la aspiración de los ovocitos se hace utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 18 g x 1 1/2 pulgadas. Todos los folículos que no presentan indicios de atresia folicular, entre 2 y 6 mm de diámetro, son aspirados (29, 32). También se puede utilizar una pequeña maquinita de aspiración. La recuperación es moderada y la "calidad" (capacidad de los ovocitos de completar la meiosis) es "buena" si se compara con la técnica de desmenuzamiento (con una hoja de afeitar, se corta la superficie del ovario) en la cual la recuperación es alta, pero la calidad de los ovocitos es baja. Esto se debe más que nada a que se recuperan ovocitos de folículos muy pequeños no antrales que no han alcanzado el tamaño adecuado para ser madurados in vitro (38). Tal vez en el futuro con nuevos medios de cultivo y con mayores conocimientos acerca de las necesidades de estos ovocitos estos podrán ser madurados en cultivos in vitro. De hembras vivas Las técnicas de recuperación in vivo se han desarrollado ultimamente y no obstante la "calidad" de los COCs recuperados de folículos de tamaño mediano y grande (>5 mm) es muy buena, el número que se recupera es bastante menor que con las técnicas mencionadas anteriormente. Foto 1: Ovarios de Vaca Foto 2: Recuperación de Ovocitos Foto 3: Búsqueda bajo lupa estereoscópica

5 76 Con o sin tratamientos de superestimulación a. Impúberes b. Púberes -. No preñadas -. Preñadas Los COCs pueden ser recuperados de hembras impúberes o púberes (6, 19) en cualquier estadio del ciclo estral, con o sin tratamientos hormonales (superestimulación, 40). En este sentido es importante señalar que la posibilidad de recuperar embriones de hembras impúberes y de vacas preñadas sin producir un efecto adverso en la preñez, abre un nuevo campo tanto para la investigación como para la industria de la transferencia de embriones. Pocos años atrás nadie hubiera imaginado obtener crías de vacas gestantes, sin embargo, la recuperación de ovocitos in vivo y la producción de embriones in vitro de vacas gestantes superestimuladas, al menos en el primer tercio de la preñez, ya ha sido indicada (33). Es conocido el hecho que las terneritas a partir de las 2 semanas de edad ya presentan ondas foliculares. Por lo tanto, a esta edad teoricamente, ya podrían dar origen a una cría si esos ovocitos fueran recuperados, madurados (in vitro o in vivo), inseminados y cultivados in vitro hasta blastocistos y posteriormente transferidos a una hembra receptora (41). CLASIFICACION Y EVALUACION DE LOS COC La mayoría de los laboratorios siguen la clasificación de Liebfried y First (30). Estos autores, hacen una descripción de los COC y los categorizan de acuerdo a la morfología de las células del cumulus oophorus y a las características del ovoplasma (Tabla 1).

6 77 TABLA 1. ESQUEMA DE CLASIFICACION PARA EVALUAR LAS ESTRUCTURAS DE LOS OVOCITOS DE BOVINOS Estructura Descripción de la categoría Puntaje Envoltura Completo, cumulus oophorus presente; 1 más de tres capas; compacto a Parcial, cumulus presente; ya sea rodeando completamente al ovocito o <3 capas; compacto 2 Expandido, cumulus presente; el componente celular muestra expansión b ; cumulus celular aparece amontonado y en diferentes lugares 3 Desnudo, sin cumulus; ovocito rodeado solo por la zona pelúcida 4 Ovoplasma Granulación homogénea que le da al ovocito una apariencia polvorienta; el ovoplasma llena el espacio rodeado por la zona pelúcida 1 Granulación en racimos o con distribución heterogénea en el ovoplasma, puede estar localizada en el centro del ovocito dejando clara la periferia o puede estar condensada formando un solo montón de apariencia obscura en el ovoplasma; el ovoplasma llena la zona pelúcida 2 Ovoplasma contraído lejos de la zona pelúcida llenándola irregularmente; ovoplasma degenerado, vacuolizado, fragmentado, o en pedazos zona pelúcida vacía. 3 Adaptado de Liebfried L, First NL (30). a Compacto indica un cumulus oophorus fuertemente adherido a la zona pelúcida y donde las células que la rodean están asociadas firmemente. b Expandido indica un cumulus oophorus donde las células han perdido la asociación entre ellas y están juntas a través de una matriz "gelatinosa". Foto 4: COC de calidad 1-1

7 78 De acuerdo a nuestra experiencia es bastante difícil seguir una regla fija en lo que se refiere a la clasificación morfológica bajo un microscopio estereoscópico, ya que por un lado, hay una gran variabilidad estre los COCs y, por otro, la cantidad de COCs que un técnico debe manipular hace casi imposible categorizarlos adecuadamente. Se ha indicado que un cumulus expandido es una buena indicación de que el ovocito ha alcanzado su maduración. Esto es posible observarlo bajo el microscopio estereoscópico. Sin embargo, también se ha reportado que algunos COCs recuperados de vacas superestimuladas hormonalmente que presentaban las células del cumulus expandida no habían completado la meiosis (13, 25, 26) y COCs que presentaban las células del cumulus compactas después de cultivados in vitro por 24 h, habían resumido la meiosis (observación personal). Estos dos ejemplos indican claramente que una clasificación de los COCs basada solamente en la parte morfológica es insuficiente. Para los COCs de equinos y camélidos Sud Americanos, la clasificación del ovoplasma que se aplica a los ovocitos bovinos, no debería ser usada puesto que el ovoplasma de los ovocitos en estas especies es bastante oscuro, presentándose en forma homogénea o heterogénea granular. Un ovocito equino "bueno" (para IVF) muestra un ovoplasma condensado homogéneo, condensado o heterogéneo el cual es muy difícil de evaluar debido al cumulus oophorus que lo rodea (14, 15). En cuanto a los COCs de llamas (Lama glama) y alpacas (Lama pacos) el ovoplasma es también oscuro y muchas veces presenta vacuolas de apariencia obscura de diferentes tamaños, cuya función es desconocida (16). MADURACION IN VITRO (IVM) La maduración del ovocito in vitro que incluye la maduración nuclear y citoplasmática fue reportada en 1965 en diferentes especies (9, 20). Como es sabido, la meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los folículos hasta que estos son expuestos a gonadotrofinas que permiten la continuación de la meiosis. La meiosis in vivo es detenida por sustancias foliculares que aún no están bien definidas. Sin embargo, los COC que son removidos desde los folículos, comienzan la meiosis espontáneamente (Tabla 2). En el proceso de maduración in vivo de los ovocitos, intervienen la hormona folículo estimulante (FSH) que interviene en el crecimiento folicular, la hormona luteinizante (LH) que induce la maduración final y la ovulación del ovocito seleccionado (12, 38, 44). Varios autores han indicado que para que el proceso de maduración se lleve a cabo debe existir un balance hormonal en el folículo (particularmente de los esteroides (25). En un sistema in vitro, este balance natural es imitado agregando las hormonas folículo estimulante (FSH), LH y estradiol 17ß al medio de maduración (TCM-199). En algunos laboratorios la adición directa de estas hormonas ha sido substituida agregando suero de vacas en estro (ECS). Este suero es suficiente para producir maduración (nuclear y citoplasmática), expansión de las células del cumulus y futuro desarrollo del cigoto. Generalmente, los COC son madurados en placas petri, en gotas (10 COC/ 50 ul de

8 79 medio) de medio de maduración cubiertas con 10 ml de aceite mineral. Estas placas son colocadas en una estufa de cultivo en una atmósfera que contiene 5% CO2, 39 o C y 95% humedad, por 24 h. TABLA 2. TIEMPO DE MADURACION IN VITRO E IN VIVO DE COC BOVINOS In vitro* In vivo (h) ** Estructura (h) No estimulada Estimulada Vesícula germinativa (GV) Ruptura membrana de la GV Condensación de la cromatina Metafase I Anafase I Telofase I Metafase II * Adaptado de Sirard, M.A et al.(39). Cero hora indica el momento en que los COC son colocados al medio de maduración ** Adaptado First NL, Parrish JJ. (21). Indica horas después del pico de LH Foto5: Metafase II x1000. Lab. Biotecnología, Fac. Veterinaria, Uruguay(1994) Foto6: Telofase II x1000 Lab. Biotecnología, Fac. Veterinaria, Uruguay(1994)

9 80 INSEMINACION IN VITRO Y CAPACITACION ESPERMATICA IN VITRO (IVF) Una vez madurados los COC, éstos son lavados (TALP-HEPES) y colocados en gotas (10 COC / 50 µl de medio de fecundación). A este medio, conocido como FERT- TALP modificado, se le agrega heparina para la capacitación espermática, penicilaminahypotaurina-epinefrina (PHE) y una concentración de espermatozoides conocida de acuerdo al reproductor que se esta utilizando. Los COC se mantienen en co-cultivo con los espermatozoides por 6 a 18 h. La técnica más usada actualmente para producir la capacitación espermática de espermatozoides de toro, es la incubación de éstos con bajas concentraciones de heparina (entre 2-5 ug/ml; 35, 36). Para lo cual, el semen es lavado previamente para eliminar el líquido seminal o diluyente y obtener un pellet solamente con espermatozoides en su gran mayoría viables. Hay diferentes técnicas de lavado de semen. Quizás una de las más populares y simples es la separación de los espermatozoides con el método de "swim-up" y su lavado posterior por centrifugación. Esta técnica permite que los espermatozoides más móviles naden hacia arriba. Otras técnicas usadas rutinariamente en los laboratorios de IVF son la separación y lavado de semen a través de una gradiente de densidad discontinua de PERCOLL (solución de 2 ml 90% y 2 ml 45%), o de una columna de lana de vidrio o simplemente el lavado por centrifugación repetida. La concentración de espermatozoides más frecuente utilizada fluctúa entre 1-2x10 6 espermatozoides/ml, dependiendo por cierto de la calidad fecundante de los espermatozoides del toro. Existen variaciones en cuanto a la capacitación espermática in vitro, entre los toros y en el mismo toro en diferentes eyaculados. Por lo tanto, previo a usar un toro, se hace necesario examinar su capacidad fecundante in vitro. Un diseño experimental de trabajo útil es el que se indica a continuación (Tabla 3). En este ejemplo se utilizan 2 toros, con 2 concentraciones de espermatozoides y 3 concentraciones de heparina. (50 ovocitos por grupo es suficiente, 2 a 3 replicas). Foto 7: Pellet de semen Foto 8: Espermatozoide en el citoplasma del ovocito

10 81 TABLA 3 Concentración de Toro A Toro B Heparina 1x10 6 2x x10 6 2x10 6 2ug/ml 5ug/mL 10ug/mL DESARROLLO IN VITRO (IVC) Una vez concluido el co-cultivado (ovocitos-espermatozoides), los ovocitos son lavados (TALP-HEPES) y posteriormente cambiados al medio de desarrollo que consiste en un medio químicamente definido o un medio de cultivo celular, ya sea usando células de la granulosa, o células epiteliales del oviducto. Así en esta forma se pasa el bloqueo celular que ocurre en los cigotos bovinos entre las 8 a 16 células. En el caso de co-cultivo, los cigotos son co-cultivados en TCM 199 adicionado con 10% de suero fetal más células del oviducto (15-20 cigotos / 100 µl de medio). Las placas son mantenidas por 7 a 9 días en una estufa de cultivo con 5% CO 2, 39 o C y 95% humedad, para la producción de blastocistos (17, Tabla 4). TABLA 4 DIA* ESTADO DE DESARROLLO Célula, Pronucleo y Segundo Corpusculo Polar - Cigoto Células Células Células - Morula Células - Morula Compacta 7 > de 64 Células Blastocisto Temprano - Trofoblasto y Macizo Celular Interno 8 Blastocisto Expandido 9 Blastocisto Eclosionado * Día 0 = Inseminación No existe una clasificación para evaluar embriones producidos in vitro, como la existente para embriones in vivo. Sin embargo, la experiencia indica que estos blastocistos son probablemente más sensibles.

11 82 FOTOS DE DIFERENTES ESTADOS DE DESARROLLO DE EMBRIONES BOVINOS OBTENIDOS POR FIV Lab, Biotecnología. Fac, Veterinaria. Uruguay ( ), FOTOI: Embrión de dos células. FOTO II: Diferentes estadios de desarrollo. FOTO III: Mórulas compactas - FIV. FOTO IV: Diferentes estadios de blastocistos - FIV.

12 83 FOTO V: Blastocistos expandidos y eclosionando. FOTO VI: Blastocisto eclosionado.

13 84 Primeros terneros nacidos en el Cono Sur, Lab. De Biotecnología. Uruguay USOS PRACTICOS DE LA IVF Hasta ahora el uso mayor que ha tenido la IVF es en investigación, no solo para estudiar los mecanismos básicos que ocurren en la reproducción animal, sino para tener una fuente de producción de embriones que pueden ser utilizados en otro tipo de investigación tales como criopreservación, o en ingeniería genética para la inyección de genes, clonaje, sexaje, etc (2, 3, 10). Algo interesante que se ha sido indicado, es el hecho, que aquellos embriones producidos por IVM/IVF/IVC que alcanzan un desarrollo más rápido al día 7-8, son machos y aquellos que presentan un estado de desarrollo menor son hembras (1, 8). Sin embargo, en estudios in vivo la relación macho hembra es practicamente 50:50. El estudio de este fenómeno es de gran interés científico. También la IVF tiene una gran aplicación en la obtención de embriones de razas criollas, de animales en extinción, de especies de zoológico (18, 31). Muchas de las técnicas aplicadas en especies de laboratorio sirven de modelo para la aplicación en la especie humana. Seguramente usando IVM/IVF se podrá correlacionar la capacidad de fecundación de un eyaculado in vitro con la capacidad que tiene in vivo, antes de ser usado en programas reproductivos con un alto costo (37).

14 85 Los embriones producidos a través de IVM/IVF/IVC son de gran valor para estudiar la transmisión de enfermedades a través de los gametos (4). Esto se debe al costo menor que representa producir embriones con esta tecnología que usando la superovulación ya la recuperación desde hembras donantes Animales con problemas clínicos de infertilidad, tienen la posibilidad de entrar en un programa de IVF. Por ejemplo, en vacas con problemas crónicos del útero u oviductos, sus ovocitos pueden ser colectados usando ultrasonografía y una aguja a través de la vagina. Estos animales pueden ser colectados repetidamente durante sus ciclos estrales sin ningún tratamiento o utilizando algún tratamiento de superestimulación. Laparascopía es otra alternativa sobre todo en mamíferos pequeños donde la ultrasonografía es un problema. Los ovocitos colectados de estos animales pueden ser inseminados con semen proveniente de diferentes toros en un corto período de tiempo y los embriones producidos pueden ser transferidos inmediatamente o congelados para ser usados en futuras transferencias. Tal vez en este momento el costo de la técnica la hace poco práctica, pero en el futuro posiblemente será usada rutinariamente como es hoy día la transferencia de embriones producidos in vivo. Otra forma de fecundación es la fecundación en el oviducto de ovocitos madurados in vitro (GIFT) o madurados in vivo (27,34). Esta técnica es usada en humanos y también se ha realizado con éxito en la yegua, donde la IVF no ha sido tan bien desarrollada aún (14). En este caso se puede usar la misma donante como receptora de sus propios ovocitos u otra hembra como receptora. La alternativa de recuperar ovocitos de terneritas impúberes o de vacas preñadas, como ya ha sido comentado anteriormente, abre un nuevo campo en la reproducción animal (6). Tal vez hoy día esta biotecnología se ve como algo utópico de llevarla a cabo en programas reproductivos a nivel de finca, especialmente en los países Latino Americanos, sin embargo la alternativa de realizarla en casos especiales de infertilidad o en hembras de alto valor existe, de hecho ya existen centros comerciales ofreciendo esta tecnología al ganadero (24). Uno de estos programas es en la producción de mellizos con embriones producidos a bajo costo de ovocitos recuperados del matadero. Estos programas han sido usados en Irlanda. La recuperación de ovocitos de razas bovinas criollas, también se ha intentado en Italia y Japón. En un futuro cercano la IVF complementará las otras biotecnologías tales como la transferencia de embriones, la congelación, el sexage etc. La potencialidad que presenta es biotecnología es realmente incalculable.

15 86 ORGANIZACION MANIPULACION DE LOS OVARIOS Y COLECCION DE LOS COC A. En el matadero, junte los ovarios en un termo con suero salino a 37º C. En el laboratorio, retire los ovarios del termo y lávelos con agua corriente a 37º C una vez y luego enjuáguelos 3 veces con suero salino a 37º C. B. Mantenga los ovarios durante todo el tiempo con suero salino tibio. C. Aspire los COC desde los folículos ováricos y coloque el fluido folicular en un tubo de centrifuga de 50 ml, manteniéndolo durante todo el tiempo a 37º C. D. Deje decantar por 10 min y luego aspire el sobrenadante y examine bajo el estereoscopio en una placa Petri (Falcon 1029) ojalá cuadriculada. LAVADO Y SELECCION DE LOS COC A. Prepare 3 placas Petri (Falcon 1008) con TALP-HEPES solución de trabajo y manténgales a temperatura de laboratorio o sobre una platina temperada. Cuide de que no se evapore el medio. B. Junte todos los COC en una placa con TALP-HEPES y selecciónelos de acuerdo a la clasificación indicada en el texto. C. Lave los COC 3 veces en TALP-HEPES PREPARACION DE LAS GOTAS DE MADURACION (IVM) A. Haga gotas de 50 µl de medio de maduración (TCM-199 Earle s salts+ suero fetal + piruvato + FSH, LH, Estradiol 17B) en una placa Petri (60 x 10 Falcon 1007). B. Cubra con 10 ml de aceite mineral, previamente equilibrado (para tal efecto mantenga el aceite en el incubador diariamente con la tapa suelta). C. Coloque las placas de maduración en el incubador al menos por 2 horas antes de colocar los COC para que se equilibre (temperatura y atmósfera de gases). D. Coloque los COC previamente lavados (TALP-HEPES solución de trabajo) y seleccionados (ovoplasma y cumulus) en número de 10 por gota y vuelva la placa al incubador tan pronto le sea posible. E. Cultive los COC por horas en estas condiciones. No abra la puerta del incubador si no es estrictamente necesario. F. Después de este tiempo junte todos los COC en una placa con TALP-HEPES y desnúdelos de su granulosa, ya sea pasándolos varias veces por una pipeta Pasteur previamente preparada

16 87 (lumen angosto) o colocándolos en un tubo eppindorff de 1mL y agitándolos en el Vortex por 3 minutos. G. Recupere los ovocitos y lávelos 3 veces con TALP-HEPES antes de colocarlos en las gotas de fecundación, para eliminar residuos de glucosa que afectan el efecto de la heparina. ALTERNATIVA A. Lave los COC y selecciónelos. B. Coloque 60 a 200 COC en una placa Petri de 35 mm conteniendo 2.5 ml de Medio de maduración. C. Cubra el medio con aceite mineral y cultívelos por horas También puede usar una placa Nunclon (176740) o similar en este caso puede obviar el aceite. PREPARACION DE GOTAS DE FECUNDACION (IVF) A. Haga gotas de 44 ul de medio de fecundación (FERT TALP) en una placa Petri (60 x 10 Falcon 1007). B. Cubra con 10 ml de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto mantenga el aceite en el incubador durante todo el tiempo con la tapa suelta). C. Coloque las placas en el incubador al menos por 2 horas antes de colocar los COC para que se equilibre (temperatura y atmósfera gases). D. Coloque los ovocitos previamente lavados y desnudos sin su cumulus (TALP-HEPES solución de trabajo) y en número de 10 por gota y vuelva la placa al incubador tan pronto le sea posible. E. Coloque dentro de la gota 2 µl de (Penicilamina/ Hipotaurina/ Epinefrina, PHE), 2 µl de Heparina (en la concentración adecuada, generalmente 2 a 5 ug/ml) y finalmente 2 µl de la solución con los espermatozoides previamente preparados (en la concentración adecuada, generalmente 1x10 6 espermatozoides/ml). F. Co-cultive los ovocitos/espermatozoides por 8 a 18 horas en estas condiciones. No abra la puerta del incubador si no es estrictamente necesario. H. Recupere los ovocitos y colóquelos en TALP-HEPES luego elimine los espermatozoides adheridos a la zona pelucida, ya sea pasándolos varias veces por una pipeta Pasteur previamente preparada (lumen angosto) o colocándolos en un tubo eppindorff de 1mL con un mínimo de TALP-HEPES y agitándolos en el Vortex por 1-3 segundos. I. Lave los cigotos 3 veces con TALP-HEPES antes de colocarlos en las gotas de cultivo.

17 88 ALTERNATIVA A. Después de lavado los ovocitos transfiéralos con un mínimo de TALP-HEPES (20 µl o menos) a un pocillo (Nunclon ) previamente preparado con 425 µl de medio de fecundación (FERT-TALP). B. Agregue 20 µl de PHE y 20 µl de la suspensión espermática a cada pocillo y mezcle suavemente con la pipeta. C. Incube por 8 a 18 hr. Aproximadamente a 39º C, 5% CO 2 en una atmósfera con alta humedad. PREPARACION DE GOTAS DE DESARROLLO (IVC) A. Haga gotas de 100 µl en una placa Petri (60 x 10 Falcon 1007) usando Medio de Desarrollo Condicionado y TCM-199 Earle s salts con 10% suero fetal en una proporción de 1:1. B. Mantenga el TCM en el incubador al menos 2 horas antes de preparar el cultivo para que se equilibre (temperatura y mezcla de gas). C. Cubra con 10 ml de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto mantenga el aceite en el incubador diariamente con la tapa suelta). D. Agregue 0,8 a 1 µl de la suspención BOEC por gota. Transfiera los cigotos (15-20 por gota). Vuelva la placa rápidamente al incubador. No abra la puerta del incubador si no es estrictamente necesario. D. Determine el desarrollo embrionario cuando le sea necesario y agregue cada 48 h el medio TCM:Medio condicionado previamente preparado y guardado en incubador durante el tiempo que dure el cultivo. ALTERNATIVA PREPARACION DE LAS GOTAS DE DESARROLLO USANDO MEDIO SOFT A. Haga gotas de 100 ul de medio de SOFT en una placa Petri (60 x 10 Falcon 1007). B. Cubra con 10 ml de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto mantenga el aceite en el incubador durante todo el tiempo con la tapa suelta). C. Coloque las placas en el incubador al menos por 2 horas antes los cigotos para que se equilibre (temperatura y mezcla de gas). Cultive bajo una atmósfera de 5% O 2, 5% CO 2, 90% N 2 y humedad. Si usa una atmósfera solo con 5% CO 2 añada 50 um de Cisteína (Bmercaptenoletilenamina, Sigma) y renueve el medio cada 3 días. D. Agregue a las 48 h 10% de suero fetal.

18 89 PREPARACION DE SOLUCIONES STOCKS Y MEDIOS DE CULTIVO DE TRABAJO COLECCION Y LAVADO DE LOS COC MEDIO STOCK TYRODE LACTATO MODIFICADO - TALP-HEPES COMPUESTO Final mm 500 ml 1000 ml NaCl mg mg KCl 3,2 120 mg 240 mg NaHCO3 2,0 84 mg 168 mg NaH2PO4xH2O 0,4 28 mg 56 mg HEPES 10, mg 2400 mg Gentamicina 25,0 µg/ml 500 µl 1000 µl Rojo fenol (1%) 500 µl 1000 µl Agregue estos dos compuestos al final, agitando suavemente la solución CaCl2x2H2O 2,0 150 mg 300 mg MgCl2x6H20 0,5 50 mg 100 mg Determine: ph y ajuste a 7,4 osmolaridad y ajuste a mosm. Filtre: con filtros de 0,22 um Guarde: a 4º C, en botellas estériles por 1 a 2 semanas. TALP-HEPES SOLUCION DE TRABAJO El día de su uso suplemente con: /ml TALP HEPES (stock) ml 200 ml BSA Fracción V 3 mg 1000 µl 2000 µl DL-Lactato de Sodio (60% Na) 1,87 µl 187 µl 373 µl Gentamicina (stock) 1,0 µl 100 µl 200 µl Determine: ph y ajuste a 7,3-7,4. Filtre: con filtros 0,22 um Guarde : a o C, en botellas estériles y siempre prepárelo fresco el día de su uso MADURACION DE LOS COC (IVM) MEDIO DE MADURACION TCM-199 Earle s salts Disuelva en 1 Lt de DD-agua y agregue 2.2 gr de Bicarbonato de Sodio.

19 90 Filtre con filtros 0.22 um y guarde en botellas de vidrio. MADURACION DE LOS COC SOLUCION DE TRABAJO El día de su uso suplemente con: /ml 2, 0 ml 4,0 ml TCM 199 Earle s salts (stock) ,8 ml 3,6 ml Suero Fetal Bovino (stock) µl 400 µl Piruvato de Sodio (stock) 22 mg 20 µl 40 µl FSH (stock) 0,5 ug 2 µl 4 µl LH (stock) 5 ug 2 µl 4 µl Gentamicina (stock) 50 mg 2 µl 2 µl Filtrar con un filtro de 0,22 um Agregar Estradiol 17B (stock) 1 mg 2 µl 4 µl Prepare: las gotas y cubra con aceite mineral. Guarde: inmediatamente en el incubador. INSEMINACION DE LOS OVOCITOS (FECUNDACION, IVF) MEDIO STOCK TYRODE LACTATO MODIFICADO - FERT-TALP COMPUESTO Final Mm FERT TALP ml 100 ml NaCl mg 666 mg KCl 3,2 11,75 mg 23,5 mg NaHCO3 25,0 105,2 mg 210,4 mg NaH2PO4xH2O 0,4 2,76 mg 5,52 mg Gentamicina (stock)25,0 ug/ml 50 µl 100 µl Rojo fenol (stock) 1% 50 µl 100 µl Agregue estos dos componentes al final, agitando suavemente la solución CaCl2x2H2O 2,0 15 mg 30 mg MgCl2x6H20 0,5 5 mg 10 mg Determine: ph y ajuste a 7,4 osmolaridad y ajuste a mosm Filtre: con filtros de 0,22 mu Guarde: a 4º C, en botellas estériles, por 1 a 2 semanas.

20 91 FERT-TALP SOLUCION DE TRABAJO El día de su uso suplemente con: Cantidad/mL FERT-TALP (stock) ,5 ml 5 ml BSA Fracción V 6 mg/ml 15 mg 30 mg Piruvato de sodio (stock) 10 µl/ml 25 µl 50 µl Gentamicina (stock) 1,0 µl/ml 2, µl 5 µl Filtre: con filtros de 0,22 um Prepare. las gotas y cubra con aceite mineral. Guarde: inmediatamente en el incubador. PREPARACION DE LOS ESPERMATOZOIDES Se pueden usar diferentes fuentes de semen para la IVF (fresco, congelado epididimal). Sin embargo, comúnmente se usa semen congelado. Debido a la variación entre los toros y los eyaculados del mismo toro debe tenerse cuidado al preparar los espermatozoa para IVF. Existen variados procedimientos para la preparación del semen, sin embargo el mas común es el método de SWIM-UP o la GRADIENTE DE PERCOLL. SWIM-UP A. Prepare 4 tubos de 1.8 ml de capacidad con 1 ml de SPERM-TALP. Colóquelo dentro del incubador (5% CO2, 39 o C, alta humedad atmosférica) con la tapa suelta por 1 hr. B. Descongele 2-4 pajuelas (35 o C 30 seg.) y júntelas en un tubo. Observe una muestra (aprox. 10 µl). C. Deposite cuidadosamente en el fondo de cada tubo con SPERM-TALP 250 µl de semen (1 pajuela). D. Mantenga los tubos a 39º C por 1 hora, para permitir a los espermatozoides nadar hacia arriba (swim up). E. Retire cuidadosamente 800 µl aproximadamente del sobrenadante de cada tubo y júntelos en un tubo de 15 ml. Descarte los 200 µl del fondo del tubo F. Centrifugue a 1000 rpm/10 min G. Descarte el sobrenadante y deje aproximadamente 400 µl del fondo H. Re-suspenda el pellet si es necesario agregando 4 ml SPERM-TALP y centrifugelos nuevamente. Deje 200 µl del fondo. I. Determine la motilidad y la concentración y ajuste la concentración a 25X10 6 para obtener una concentración final por ml de 1x10 6 epermatozoides/ml. J. Agregue de esta suspensión 2 µ L a las gotas de fecundación previamente preparadas.

21 92 MEDIO STOCK TYRODE LACTATO MODIFICADO - SPERM-TALP COMPUESTO Final mm /100 ml /500 ml NaCl mg 2920 mg KCl 3,1 23 mg 115 mg NaHCO3 25,0 210 mg 1050 mg/ NaH2PO4xH2O 0,3 4,0 mg 20 mg HEPES 10,0 238 mg 1190 mg Gentamicina 25,0 ug/ml 100 µl 500 µl DL-Lactato de Na (60%)21,6 µl 368 µl 1840 µl Rojo fenol (1%) 1 µl/ml 100 µl 500 µl Agregue estos dos componentes al final, agitando suavemente la solución CaCl2x2H2O 2,0 31 mg 155 mg MgCl2x6H20 0,4 8 mg 40 mg Determine: ph y ajuste a 7,4 osmolaridad y ajuste a mosm Filtre: con filtros 0.22 um Guarde: a 4º C, en botellas estériles, por no más de 2 semanas. SPERM-TALP SOLUCION DE TRABAJO El día de su uso prepare: Cantidad/mL SPERM-TALP (stock) ml BSA Fracción V 6 mg/ml 300 mg Piruvato de sodio (stock) 10 µl/ml 500 µl Gentamicina (stock) 1,0 µl/ml 50 µl Filtre: con filtros de 0,22 um GRADIENTE DE PERCOLL - SOLUCIONES STOCKS CADA SOLUCION (1-4) SE PREPARA EN BOTELLAS ESTERILES SEPARADAS Compuesto MW Stock (M) 50 ml 100 ml 1) KCl 74,56 1,0 3,730 gr 7,460 gr Compuesto MW Stock (M) 50 ml 100 ml 2) NaH 2 PO 4 xh 2 O 137,99 0,1 0,690 gr 1,380 gr Compuesto MW Stock (M) 50 ml 100 ml 3) CaCl 2 x2h ,0 7,351 gr 14,702 gr Compuesto MW Stock (M) 50 ml 100 ml 4) MgCl 2 x6h 2 O 203,31 0, gr 2,033 gr

22 93 Disuelva: bien. Filtre: Mantenga: el compuesto en la cantidad de DD-agua deseada (50 o 100 ml) y mezcle con filtros 0,22um o esterilice en autoclave. las soluciones refrigeradas indefinidamente y bien tapadas, para evitar evaporación. SPERM-TALP MODIFICADO (CONCENTRADO 10 VECES, STOCK 10X) Compuesto Stock (M) 50 ml 100 ml NaCl 0,8 2,337 gr 4,675 gr KCl 1, µl 3090 µl NaH 2 PO 4 xh 2 O 0, µl 2920 µl HEPES 10,0 1,190 gr 2,380 gr Disuelva: los compuestos csp DD-agua y mezcle bien (ejemplo, 50 o 100 ml, csp=cantidad suficiente para). Determine: ph y ajuste a 7,3 Filtre: Mantenga: con filtros de 0,22 um en refrigeración bien tapada indefinidamente, para evitar evaporación. Re ajuste ph si es necesario. PERCOLL SOLUCION STOCK 90%. No use albúmina. A. Coloque en un frasco estéril 45 ml de Percoll y agregue 5 ml de SPERM-TALP 10X. No intente filtrarla B Mantenga la solución refrigerada y bien tapada. Saque la cantidad necesaria el día de su uso y vuélvala a guardar inmediatamente. PERCOLL SOLUCION DE TRABAJO El día de su uso suplemente con: SOLUCION DE PERCOLL 90% Prepare al mismo tiempo las soluciones de 90% Percoll y SPERM-TALP 1X. A. Coloque en un tubo estéril la cantidad de SOLUCION DE PERCOLL 90% (stock) deseada (ejemplo 5, 10, 20, 50mL) y entonces agregue los compuestos (stocks) de acuerdo a lo que desee preparar.

23 94 5 ml 10 ml 20 ml 50 ml Compuesto (1-tubo) (2-tubos) (4-tubos) (5-tubos) CaCl 2 9,85 ul 19,7 ul 39,4 ul 98,5 ul MgCl 2 19,70 ul 39,4 ul 78,8 ul 197,0 ul Acido láctico 18,40 ul 36,8 ul 73,6 ul 184,0 ul NaHC0 3 10,45 mg 20,9 mg 41,8 ul 104,5 mg No intente filtrarla SOLUCION 1X DE SPERM TALP A. Coloque en un tubo estéril la cantidad de DD-agua deseada (4,5 20 ml, etc). B. Agregue la Solución SPERM-TALP 10X (stock). C. Agregue las soluciones stocks que se indican en la cantidad de DD-agua que desee preparar (ejemplo: 5 a 50 ml). Compuesto 5 ml 10 ml 20 ml 50 ml DD H2O 4,5 ml 9,0 ml 18,0 ml 98,5 ml Sol. 10X 0,5 ml 1,0 ml 2,0 ml 5,0 ml CaCl 2 9,85 ul 19,7 ul 39,4 ul 98,5 ul MgCl 2 19,70 ul 39,4 ul 78,8 ul 197,0 ul Acido láctico 18,40 ul 36,8 ul 73,6 ul 184,0 ul NaHC0 3 10,45 mg 20,9 mg 41,8 ul 104,5 mg Mezcle bien PERCOLL 45% A. Prepare una solución 1:1 de la solución de PERCOLL de 90% y de SPERM TALP 1X modificada. Agregando, por ejemplo, para la preparación de un tubo, 2 ml de PERCOLL 90% y 2 ml de la solución de SPERM-TALP 1X. Mezcle bien y mantenga tapada COLUMNA DE PERCOLL Una buena practica es agregar aproximadamente 3 ul de colorante de alimentos a las soluciones de Percoll. Esto permite visualizar las columnas después de ser preparadas. A. Coloque 2 ml de PERCOLL 90% en el fondo de un tubo cónico de centrifuga (Falcon 2095). Agregue cuidadosamente 2 ml de PERCOLL 45% sobre la superficie del PERCOLL 90%. Asegúrese que las soluciones estén a temperatura ambiente antes de colocar el semen. B. Descongele 2-3 pajuelas de semen y mézclelas y colóquelas sobre la superficie de la columna de PERCOLL previamente preparada

24 95 C. Centrifugue la muestra a 700 x g (aprox rpm) entre 15 a 30 minutos. E. Descarte el sobrenadante inmediatamente después que la centrifuga se haya detenido (las dos capas superiores) dejando solamente el pellet formado por los espermatozoides. Sea extremadamente cuidadoso cuando remueva las soluciones de PERCOLL. Note que el pellet formado no debe estar firmemente formado. E. Diluya el pellet si es necesario agregando SPERM-TALP 1X y determine la motilidad y la concentración. Ajuste a 25 x 10 6 en el caso de usar una concentración final de 1x10 6 espermatozoides/ml). F. Agregue de esta suspensión 2 ul a las gotas de fecundación previamente preparadas. MEDIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS PARA EL CULTIVO DE CIGOTOS MEDIO FLUIDO OVIDUCTAL SINTETICO STOCK (SOF; Tervit y col., 1972) SOLUCION STOCKS STOCK A COMPUESTO Final mm /1000 ml NaCl 107, mg KCl 7, mg KH2PO4 1, mg CaCl 2 x 2 H 2 O 1, mg MgCl 2 x 6H 2 O 0, mg STOCK B NaHCO3 25, mg Rojo fenol (0,5%) 100 ul Filtre: Con filtros 0,22 um Guarde: a 4º C, en botellas estériles por no más de 30 días

25 96 MEDIO FLUIDO OVIDUCTAL SINTETICO-modificado (m-sof; Takahashi y First, 1992) SOLUCION DE TRABAJO COMPUESTO Final mm /1000 ml NaCl 107, mg KCl 7, mg KH2PO4 1, mg NaHCO3 25, mg DL-Lactato de Sodio (syrup 60%) 3, ul Piruvato de Sodio 0,30 33 mg Glutamina 1,0 146 mg AA esenciales (BME) 20 ml AA no esenciales (MEM) 10 ml BSA fatty acids free (3 mg/ml) 300 mg Agregue estos dos componentes al final, agitando suavemente la solución CaCl 2 x 2 H 2 O 1, mg MgCl 2 x 6H 2 O 0, mg Agregue: DD-agua csp Determine: Osmolaridad y ajuste a mosm (sin BSA). Al final añada BSA. ph y ajuste a 7,2-7,3 Filtre: Con filtros 0,22 um Guarde: a 4º C, en botellas estériles por no más de 7 días PREPARACION DE LAS CELULAS EPITELIALES DEL OVIDUCTO DEL BOVINO (BOEC) LAVADO DE LOS BOEC TCM-199 Earle s salts Agregue 1% suero fetal Filtre con filtros 0.22 um y guarde en botellas de vidrio en incubador para su equilibrio (al menos por 2 horas). CULTIVO DE LOS BOEC TCM-199 Earle s salts Agregue 10 % suero fetal Mezcle 1:1 con Medio Condicionado Filtre con filtros 0.22 um y guarde y mantenga en botellas de vidrio en incubador para su equilibrio.

26 97 A. Separe los oviductos del resto del tracto reproductivo y colóquelos en bolsitas plásticas sobre hielo y manténgalos en termos para el transporte al laboratorio. B. Disecte los oviductos y retire la grasa y tejido sobrante. C. Corte transversalmente ambos extremos y con un cubreobjeto presione la superficie exterior del oviducto hacia el extremo del infundibulum. D. Coloque la masa de lombrises ( worms =BOEC) en un tubo de centrifuga de 15 ml. E. Lave las BOEC en 10 ml de TCM-199 más 1% suero fetal (también se puede usar TALP- HEPES solución de trabajo) por 5 veces dejando decantar 5 min cada vez y descartando el sobrenadante. F. Finalmente deje 200 ul de pellet (BOEC) y transfiéralos a una placa de cultivo (Falcon 25 cm2) conteniendo 10 ml de medio de cultivo (TCM-10% suero fetal) previamente preparado. G. Cultive por 24 o 48 hr a 39º C, 5% CO 2 en aire y alta humedad. H. Pasado este período de tiempo coloque el resto del medio y los racimos de BOEC en un tubo de centrifuga de 15 ml y deje decantar por 5 min. I. Retire el sobrenadante (futuro medio condicionado) y centrifugelo a 3000 rpm por 10 min. Para remover el debri celular. J. Al mismo tiempo resuspenda en TCM-10% suero fetal el pellet de BOEC y dejelo decantar por 5 min. Repita esta operación una vez más descartando el sobrenadante y dejando el pellet de BOEC en el fondo del tubo. K. De este pellet (resuspendido en 1 ml de TCM-10% suero fetal) agregue 1 ul a cada gota de fecundación. Nota las gotas de fecundación se preparan usando 50% de medio condicionado y 50% medio TCM-10 suero fetal (1:1) previamente filtrado (0,22 um). Foto VIII: Pro núcleo x FIV Foto IX: 1er. Cuerpo Polar x FIV Foto VII: Blastocisto transferible - FIV

27 98 Foto X: Embrión Eclosionando- FIV STOCKS Antibióticos para todos los medios: Sulfato de Gentamicina 50mg/ ml disolver en suero salino. Alicuote y guarde -70 o C. Puede volver a congelar y descongelar varias veces. Penicilina/estreptomicina Concentración final en el medio: 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina Para la recuperación y lavado de los ovarios: Suero salino Disuelva 9 gr de NaCl en 1 Lt de DD-agua Filtre y guarde en botellas esteríles Solución de trabajo Agregue 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina

28 99 Para el lavado de los COC: TALP-HEPES (ver más arriba) Fosfato Buffer Salino PBS solución stock Disuelva en 700 ml de DD-agua todas las sales menos el ClCa y ClMg Disuelva en 200 ml de DD-agua las sales de Ca y Mg Agregue lentamente la solución que contiene las sales de Ca y Mg a los 700 ml que contienen el resto de las sales Agite suavemente. Enrase a 1000 ml. Solución de trabajo Agregue 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina Albúmina bovina (BSA fracción V) 1 mg/ml Filtre y use en el día Para el Medio de Maduración Medio TCM TCM 199 Earle's salts Agregue 2,2 gr/lt de Bicarbonato de sodio. Prepárelo con DD-agua. Guarde refrigerado en frascos de 100 ml o 500 ml de acuerdo a la necesidad de uso. Foltropin (Vetrepharm) Diluya todo el frasco en 20 ml de TCM-199. Alicuote. Guarde a -70 o C. Descarte el sobrante después de usar. Solución de trabajo Agregue 20 ul en 10 ml de medio de maduración. Estradiol 17 B 1 mg/ml disolver en etanol. Guarde a -70 o C. Esta solución puede re-usarse varias veces. Piruvato de sodio 22 mg/10 ml disolver en suero salino. Alicuote y guarde a -70 o C. No vuelva a congelar el sobrante. Para el Medio de Inseminación Capacitación espermática Heparina ( Unidades) 181 unidades USP/mg (anhídrica) 0,25 mg/ml Pese 5 mg y dilúyalos en 20 ml de suero salino. Solución A: 10 ug/ml Tome 2 ml de la sol. A y agregue 2 ml de suero salino. Sol. B: 5 ug/ml Tome 2 ml de la sol. B y agregue 2 ml de suero salino. Sol C: 2,5 ug/ml Para preparar una sol. de 2 ug/ml de heparina diluya la solución A 5 veces (1 ml sol. A mas 4 ml suero salino). Alicuotela y guarde a -70 o C.

29 100 Penicilamina/Hipotaurina/Epinefrina PHE Penicilamina 2mM, Pesar 3 mg y disolver en 10 ml solución salina (NaCl 0,9%) Alicuotar y congelar a 70º C. Prepare 50 ml Hipotaurina 1 mm, Pesar 1,09 mg y disolver en 10 ml de solución salina (NaCl 0,9%) Alicuotar y congelar a 70º C. Prepare 100 ml Epinefrina (Adrenalina) 250 mm, Pesar 50 mg de Metabisulfato de Sodio y disolver en 50 ml de DD-agua Agregar 127 ul de DL-lactato de Sodio (60%) Acidificar a ph 4,0 con ácido clorhidríco A 40 ml de esta solución agregue 1.83 mg epinefrina. Debido a la cantidad pequeña de epinefrina mejor preparar mayor cantidad (a 200 ml de solución agregar 9,15 mg de epinefrina) SOLUCION STOCK 1 ml 4 ml 10 ml Solución de Penicilamina 250 ul 1000 ul 2500 ul Solución de Hipotaurina 250 ul 1000 ul 2500 ul Solución de Epinefrina 100 ul 400 ul 1000 ul Solución salina (NaCl 0,9%) 400 ul 1600 ul 4000uL Agregue las soluciones en la cantidad que requiera (ejemplo, para 1,4 o 10 ml) Trabajar con poca luz ya que la epinefrina es sensible a la luz Alicuotar en cantidades de 50 ul o de acuerdo a la necesidad y congelar a 70º C Guardar por más de 2 semanas Individualmente las soluciones de Penicilamina y la Hipotaurina, como se indicó, se pueden guardar como stocks y volver a re-usar cuando se prepare nuevamente PHE. Para el Montaje Mezcla de cera y vaselina Relación 1:3. Para mezclar use calor. Guarde a temperatura ambiente. Cambie esta relación de acuerdo a la temperatura del laboratorio, hasta encontrar la relación que mas le acomode. Guárdela en jeringas de 5 ml Para la Fijación Acido acético:etanol Relación 1:3. Prepare al momento de usar. Para la Tinción Tinción de orceina 1% peso/volumen

30 101 Disuelva la orceina (1 gr) en 40 ml de ácido acético Hiérvala inmediatamente y revuélvala constantemente Enfríela y agregue 55 ml de DD H2O Guarde a 4 o C Para la Conservación Acido acético:glicerol : DDH2O 20 ml : 20 ml : 60 ml Para eliminar las Células de Cumulus Hialuronidasa 1 mg/ml disuelva en TALP-HEPES. Prepare al momento de usar. Suero salino (0,9%) 9 gr. de NaCl en 1000 ml de DD H2O. Guarde a temperatura ambiente o refrigerada MONTAJE, FIJACION Y TINCION DE OVOCITOS MONTAJE Y FIJACION A. Prepare los portaobjetos apropiadamente limpiándolos e identificándolos. Coloque la mezcla de cera/parafina (anexo) en los extremos de los cubreobjetos. B. Retire los COC de las gotas, colóquelos en un medio de cultivo limpio y posteriormente tómelos con muy poco medio y deposítelos sobre el portaobjeto. Retire el exceso de medio (hasta que los ovocitos formen una "sombra"). Las células del cumulus que rodean al ovocito deben ser removidas antes de fijarlos. C. Coloque el portaobjeto rápidamente sobre los ovocitos y presione suavemente hasta que el medio haga contacto con el cubreobjeto. Cuidadosamente continúe presionando cada extremo del cubreobjeto hasta obtener una buena presión sobre los ovocitos teniendo cuidado de no reventarlos. D. Ponga rápidamente una pequeña gota de goma de pegar anexo) en dos extremos. Téngase presente que muchas gomas de pegar se destruyen con la mezcla ácido acético:alcohol (anexo) o puede encogerse destruyendo los ovocitos. E. Coloque los portaobjetos en la mezcla de ácido acético:alcohol al menos por 24 horas. TINCION A. Retire el portaobjeto del fijador. Séquelo moderadamente con papel absorbente cuidando de no presionar el cubreobjeto. B. Coloque 3 a 4 gotas de una solución de orceina y ácido acético en uno de los bordes del cubreobjeto. Haga esta operación bajo el estereoscopio, para impedir la pérdida de ovocitos que no han quedado bien aprisionados. Si es necesario use papel absorbente en el borde que sea necesario, para reorganizar a los ovocitos.

31 102 C. Observe las muestras usando un microscopio de fase contrastada. Use un aumento bajo (4x) y ubique la posición de los ovocitos. Esto impedirá la lectura del mismo ovocito. Observe con aumento de 20 x o 40 x. D. Si es necesario aclare la tinción agregando una solución de ácido acético:glicerina:alcohol (anexo). Usando esta mezcla se puede guardar la preparación por varios días. Solo de sellar los bordes del cubre con cutex transparente de uñas. ANEXO LABORATORIO Y EQUIPO DE LABORATORIO MATERIAL DE LABORATORIO Empresa Código Falcon Centrifuge tubes 50 ml 2070 in bags of 25, case of 500 Canlab Falcon PP centrifuge tubes 50 rack of 25 tubes Canlab C Falcon Centrifuge tubes 15 ml 2095 in bags Canlab T Falcon Centrifuge tubes 15 ml 2099 rack of 25 case of 500 Canlab T R Falcon Plain Petri dishes PS 100x15 mm 1029 case of 500 Fisher Falcon Plain Petri dishes PS 60x15 mm 1007 case of 500 Canlab Falcon Plain Petri dishes PS 35x15 mm 1008 case of 500 Canlab Falcon Sterile tissue culture flask screw cap 25cm2 Canlab 9381-K35 Disposable tubes individually wrapped 100x17 Fisher H PP* tubes with cap 5mL Sardest PP tubes with cap 13mL Sardest Falcon Sterile disposable serological pipettes 10mL large tip op. Canlab P W Unopettes 20uL Fisher BD 5878 Microcentrifuge tubes 1.5 ml screw cap Sardest Assorted color caps Sardest Capped tubes 3.5 ml PS (55x12mm) Sardest Disc Filter holder 13mm Ø Swinnex Millipore SX Sterile filters Swinnex.22µ Millipore GSTF Swinnex disc filter holder 25mm Ø Millipore SX Sterile filters Swinnex.22µ 25mm Ø Millipore GSTF Swinnex disc filter holder 47mm Ø Millipore SX Sterile filters Swinnex.22µ 47mm Ø Millipore GSTF Eppendorf digital pipette 2-10µ Fisher A Eppendorf digital pipette µ Fisher B Eppendorf digital pipette µ Fisher C Pipetters stand for Eppendorf Fisher Digital microdispenser 10 ul Thomas Scient G20 Capillaries for 10 ul Thomas Scient N70 Label tape assortment Thomas Scient L70 Medium vacuum type desiccator Thomas Scient E20 Indicating Drierite absorbent Fisher A Polyethylene Staining jar Fisher

32 103 Printed sample sterile bags Canlab B1206 Absorbent paper 50x100cm (roll) Canlab P Dual peel sterilization tubing 7.5x10 cm (roll 30.5m) Canlab W90004 Stir bar kit Canlab L Yellow tips 8x12 rack Sardest Blue tips 10x10 rack Sardest Yellow tips bag of 500 tips Sardest Blue tips bag of 250 tips Sardest Vortex Canlab Magnetic stirer Nuova II hot plate Canlab H Seringe filter holter autoclavable sartorious Fisher Glassine weighing papers 1000sheets (1 pkg Canlab B2040 Syringes: 1 ml, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml,50 ml Hemocytometer thermometer Thermos Porta y cubre objetos Tijeras, Pinzas Insemination guns Pipettes Straws Plastic tips Liquid nitrogen tank *PP= Polypropylene translucent to opaque, ** PS= Polystyrene, ***PE= Polyethylene EQUIPOS Microscopio trinocular Sistema microfotográfico Microscopio invertido Micromanipulador Refrigerador con freezer separado (al menos 70º C) Incubadora Kit de firita Remplazo firita Regulador doble para CO 2 Interruptor automático Cámara de flujo laminar Indicador de presión Luz UV Esterilizador Centrifuga Universal Rotor Tubos de centrifuga Balanza Analítica Peachimetro (ph) Osmometro