Electroforesis de DNA
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- Domingo Domínguez Duarte
- hace 7 años
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Transcripción
1 Electroforesis de DNA
2 DNA Topoisomerasas Izquierda Derecha
3 Enzimas de restricción Clasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg 2+ Secuencias palindrómicas Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones. Sma I / Xma I Secuencias metiladas: A*: N 6 -metiladenina C*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp I Reconocen la secuencia CC*GG Hpa II: no digiere DNA metilado Msp I: Digiere met o no-metilado *90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G
4 Clonamiento de DNA
5 Desfosforilación de vectores (para evitar asociación intramolecular)
6 68 kda DNA Ligasa Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)
7 Ligación de extremos cohesivos
8 Generación de cdna
9 Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa) Screening: Rastreo, Escrutinio
10 Fago Lambda como vector de clonamiento
11 Clonamiento de DNA en plasmidos
12 DNA plasmidal PBR322
13 Clonamiento de DNA en plasmidos
14 Clonamiento de DNA en plasmidos
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18 Denaturación y Renaturación del DNA Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
19 Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, Southern y Northern blot
20 Southern blot
21 Eliminación de fragmentos de Okazaki
22 Eliminación de fragmentos de Okazaki (Reacción de Nick translation) + Mg 2+ DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de 109 kda. 5 3 Polimerasa 5 3 exonucleasa 3 5 exonucleasa Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR
23 SINTESIS de DNA in vitro Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR) - Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado) - Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias) - DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol) - Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción) - dntps - Tampón (Mg 2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg ESPECIFICIDAD VELOCIDAD SENSIBILIDAD CONTROLES!
24 SINTESIS DE DNA in vitro PCR INICIACION cuando y donde ELONGACION - Iniciacion, elongacion, terminacion - in vitro - multiples veces un fragmento de DNA - par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica - DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus) -ciclos de denaturacion, apareamiento, extension TERMINACION -Extension final y guardar a 4ºC
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27 Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kda PCR
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30 PCR de MICROSATELITES GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA 5 CACCTGATATCTGGTA Partidor 2 TGTGTGTGTGTGTGTG MICROSATELITE CGACACTACCAGATG lll GCTGTGATGGTCTAC Partidor 1 5 CACCTGATATCTGGTA 3 llllllllllllllll 3 GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc
31 pb HMS7 Análisis de microsatélites de caballos HTG4 120 Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio. pb HMS HMS3
32 R-Loops
33 R-Loops Microscopía Electrónica, Tinción Negativa Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssdna o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cdna
34 Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET) Tinción negativa
35 Denaturación y Renaturación del DNA Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
36 Denaturación del DNA e Hipercromicidad
37 Secuenciación de DNA (Sanger,1977) Enzima/ Propiedades Frag. Klenow (DNA pol I) Sequenasa Procesividad nt nt Velocidad de Polimerización 45 nt/seg 300 nt/seg Taq DNA pol >7600 nt nt/seg Klenow: MW 76 kda, carece de actividad 5 3 exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970). Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3 5 exonucleasa)
38 Secuenciación de DNA (Sanger,1977)
39 Secuenciación Automatizada de DNA
40 DNA Fingerprinting AFLP AFLP Amplified Fragment polymorphism RFLP Restriction Fragment Length polymorphism RAPD Random Amplified polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting SSCP Single Strand Confirmational polymorphism Microsatellite
41 Análisis de Microarreglos de DNA
42 Microarreglos de DNA
43 Microarreglos de DNA Síntesis in situ y análisis in silico
44 Microarreglos de DNA
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46 Expresión Génica Temporal por microarreglos de DNA
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