INGENIERÍA GENÉTICA. Sinónimos: Manipulación genética Clonaje génico Tecnología del DNA recombinante

Transcripción

1 INGENIERÍA GENÉTICA Es una revolución metodológica que ha puesto a nuestra disposición gran número de técnicas procedentes de diversos campos de la ciencia con un objetivo común muy importante: el acceso directo al gen Sinónimos: Manipulación genética Clonaje génico Tecnología del DNA recombinante

2 Ingeniería genética: avances importantes 1953 Watson y Crick: estructura en doble hélice del DNA 1957 Kornberg: DNA polimerasa 1961 Marmur y Doty: renaturalización e hibridación del DNA 1962 Arber, Nathans y H.Smith: enzimas de restricción 1966 Niremberg, Ochoa, Khorana: código genético 1967 Gellert: DNA ligasa Boyer, Cohen y Berg: clonaje del DNA 1975 Southern: hibridación a partir de geles Sanger, Barrel, Maxam y Gilbert: secuenciación del DNA Palmiter y Brinster: ratones transgénicos 1985 Mullis: reacción en cadena de la polimerasa 1990 Varios: Hibridación in situ fluorescente (FISH) 1998 Varios: Paneles génicos 2001 Venter y Collins: proyecto genoma humano

3 DNA ANÁLISIS MOLECULAR GENOMA unidad de transcripción gdna transcripción TRANSCRIPTOMA mrna inmaduro RNA Procesamiento (montaje, splicing) mrna (exoma) traducción PROTEINAS PROTEOMA proteina

4 CLONACIÓN DE GENES Aislamiento Inserción en vector Incorporación al hospedante Amplificación Purificación del inserto CLON

5 AISLAMIENTO DE GENES 1) Métodos físicos Agitación Sonicación 2) Síntesis química Oligonucleótidos pequeños 3) Enzimas de restricción 4) Obtención de cdna

6 ENZIMAS Endonucleasas de restricción EcoR I Hind III Hpa I Ligasas Enzima restricción Acoplamiento Ligación covalente

7 VECTORES GÉNICOS Vector Capacidad (kb) Hospedante Plásmido 8-9 E.Coli Fago Inserción: 12 E.Coli Deleción-sustitución: 22 Cósmidos 45 E.Coli Fago P E.Coli PAC E.Coli BAC E.Coli YAC Levadura

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9 RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES Método clásico E E Amp R Tet R Amp R Tet R E Amp R Tet S Amp R Tet S Plásmido recombinante Tet Tet X X X Amp Colonias recombinantes Amp Amp

10 RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES Plásmidos portadores del gen lacz Plásmido no recombinante Amp R lacz+ Colonias no recombinantes (azul) Plásmido recombinante Amp R lacz- IPTG X-gal Colonias recombinantes (blanco) ampicilina

11 Todas las células de un organismo contienen el mismo genoma pero en tejidos distintos se transcriben genes diferentes RECORDAR gen A gen B DNA RNA TRANSCRIPCION RNA TRADUCCION NEURONA LINFOCITO

12 CONSTRUCCIÓN DE UNA LIBRERÍA gdna

13 Obtención de cdna

14 DNA genómico (gdna) LIBRERÍAS clonaje STS (sequence taged sites) Librería DNA genómico DNA complementario (cdna) mrna RT cdna clonaje EST (expresed sequence tags) Librería cdna

15 Clones de DNA genómico y cdna derivados de la misma región del DNA

16 CLONACIÓN IN VITRO: PCR 1) Desnaturalización 94ºC 1 min. 2) Hibridación iniciadores 58ºC 1 min. 3) Polimerización (Taq polimerasa) 72ºC 1 min.

17 CLONACIÓN IN VITRO: PCR apertura de cadenas hibridación de primers Síntesis DNA etc etc etc etc etc DNA etc etc etc PRIMER CICLO 2 DNA doble cadena SEGUNDO CICLO 4 DNA doble cadena TERCER CICLO 8 DNA doble cadena

18 PCR 1) Hay que conocer previamente la secuencia que se quiere amplificar 2) Elevada sensibilidad Teóricamente, es posible amplificar fragmentos de DNA a partir de una sola molécula de doble cadena. En cualquier caso, basta una cantidad de muestra muy pequeña (unas pocas células) 3) Elevada especificidad Si se eligen bien los primers, solo se amplifica el fragmento deseado 4) Poco costosa Se realiza en poco tiempo Utiliza reactivos no muy caros

19 APLICACIONES ESTRUCTURA GÉNICA TEJIDOS CÉLULAS INDUSTRIA FARMACÉUTICA Secuenciación de nucleótidos GEN CLONADO Obtención del producto génico Secuencia de aminoácidos ESTRUCTURA PROTÉICA SONDA MOLECULAR DIAGNÓSTICO Introducción en células adecuadas TERAPIA GÉNICA TRANSGÉNICOS KNOCK OUT

20 Hibridación in situ fluorescente (FISH)

21 GFP (green fluorescent protein) El gen que codifica la GFP puede unirse a un extremo del gen que codifica una proteína de interés y permite observar la distribución de éste por el organismo o rastrear el movimiento de una proteína de interés en organismos vivos

22 PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGIA 2007 Mario R. Capecchi Martin J. Evans Olivier Smithies "for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells"

23 Ratón knock-out sin algunas neuronas olfativas Pierde la sensación de peligro

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