Técnicas de biología molecular utilizadas en el diagnóstico de enfermedades hereditarias

Transcripción

1 Explicación de TP Nº 1 Técnicas de biología molecular utilizadas en el diagnóstico de enfermedades hereditarias Química Biológica Patológica Dra. Mariana L. Ferramola Dra. Gabriela Lacoste 2015

2 Conceptos básicos en genética: Gen Alelo Haplotipo Genotipo Fenotipo Mutación Polimorfismo Natural, común o salvaje. Alelos variantes o mutantes.

3 Conceptos básicos en genética: Cromosómicos. Desórdenes genéticos Monogénicos o mendelianos. Multifactoriales. Homocigotas Desórdenes monogénicos: Heterocigotas Heterocigotas compuestos

4 Variación genética: mutación y polimorfismo.

5 Mutaciones: Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del ADN Genómicas Mutaciones Cromosómicas Génicas No todas las mutaciones tienen consecuencias clínicas

6 Tipos de mutaciones génicas: Deleciones e inserciones Pequeñas (pueden producir corrimiento del marco de lectura). Grandes (afectan la estructura génica). Deleciones e inserciones grandes:

7 Tipos de mutaciones génicas: Deleciones e inserciones pequeñas:

8 Tipos de mutaciones génicas: Sustituciones de nucleótidos (puntuales) Mutaciones de cambio de sentido (missense) Mutaciones sin sentido (nonsense) Mutaciones del procesamiento de ARN Mutaciones de cambio de sentido (missense) y sin sentido (nonsense):

9 Polimorfismos: Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la población general. Aplicaciones: Forenses Filiación Medicina Tipos de polimorfismos: SNPs, Inserción-Deleción (STR, VNTR), RFLP

10 Tipos de polimorfismos: de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Se deben a cambios en la secuencia del ADN que modifican los patrones de corte de las endonucleasas de restricción. Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia de una enfermedad/alelo mutado en individuos.

11 Métodos de análisis de los ácidos nucleicos.

12 Conceptos básicos en biología molecular: Endonucleasasde restricción Electroforesis Sonda Hibridación Ligación Polimerasas Cebadores Transferasas

13 Endonucleasas de restricción: Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena (dsdna) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de DNA definidos.

14 Endonucleasas de restricción: Cuando se somete un fragmento de ADN a restricción con una endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que dependen del patrón de cortede la enzima.

15 Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel: Geles de poliacrilamida Alta resolución. Separan fragmentos de DNA <500pb. Geles de agarosa Baja resolución. Separan fragmentos de DNA de entre 300 a 10000pb.

16 Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:

17 Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:

18 Sondas de ácidos nucleicos: Molécula de ADN o ARN marcada, usada para identificar secuencias complementarias mediante hibridación. Marcación de sondas Radiactiva No radiactiva Interna Externa

19 Marcación de sondas de ácidos nucleicos: Marcación interna: ADN polimerasas Automatizada Desplazamiento de mella (*dntp). Random primer extension (*dntp o *cebador). Sondas de oligonucleótidos (*dntp).

20 Marcación por desplazamiento de mella: Nick translation.

21 Marcación por elongación de cebadores aleatorios: random priming.

22 Marcación de sondas de ácidos nucleicos: Marcación Externa: Polinucleótido quinasa Transferasa terminal Marcación con 32 P en extremo 5,utiliza γ[ 32 P]-ATP. Marcación no radiactiva. Marcación con 32 P en extremo 3, utiliza α[ 32 P]-ATP. Marcación no radiactiva.

23 Marcación externa: Polinucleótido quinasa

24 Marcación externa: Transferasa terminal.

25 Marcación de sondas de ácidos nucleicos:

26 Formas de marcación de sondas de ácidos nucleicos: Radiactiva y no radiactiva

27 Hibridación de ácidos nucleicos: Las hebras complementarias de ácidos nucleicos pueden separarse (desnaturalización) y dadas las condiciones adecuadas pueden re asociarse (hibridación).

28 Hibridación de ácidos nucleicos: Factores que afectan la velocidad y especificidad de hibridación: Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Presencia de agentes desnaturalizantes. ph

29 Hibridación con sondas de ácidos nucleicos: Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar secuencias complementarias cuya concentración sea incluso de 1 sola moléculapor célula. Hibridación: Rigurosa (bajo condiciones astringentes). Poco rigurosa (bajo condiciones no astringentes). Longitud de una sonda: Desde 5 hasta miles de nucleótidos

30 Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

31 Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

32 Métodos de análisis de ácidos nucleicos que utilizan sondas. Transferencia Southern Análisis de DNA. Transferencia Northern Análisis de RNA. Dot Blot Revelado mediante sondas ASO.

33 Se utiliza para analizar fragmentos de ADN generados por digestión con enzimas de restricción. Transferencia Southern:

34 Transferencia Southern:

35 Transferencia Southern: Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso. Principales usos: Detección de secuencias relacionadas ( ej. familias de genes). Detección de deleciones e inserciones grandes causantes de enfermedades (ej. Distrofia muscular de Duchenne). Identificación de individuos mediante VNTR. Detección de RFLP.

36 Tipos de polimorfismos: de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Se deben a cambios en la secuencia del ADN que modifican los patrones de corte de las endonucleasas de restricción. Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia de una enfermedad/alelo mutado en individuos. RFLP: detección mediante Southern Blotting 1. Extracción de ADN 2. Digestión con la Enzima de Restricción apropiada 3. Separación de los fragmentos por electroforesis y transferencia a membrana (Southern Blotting) 4. Hibridación con la sonda especifica y revelado. 5. Análisis de los resultados

37 RFLP: detección mediante Southern Blotting Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene relación con la mutación que produce el trastorno. De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el trastorno. Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia. Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar ligados (separados por una distancia no mayor a 10 6 pb)

38 RFLP: PCR-RFLP 1. Extracción de ADN 2. Amplificación con un par de primers específicos a la región en estudio (PCR) 3. Digestión con la Enzima de Restricción apropiada 4. Separación de los fragmentos por electroforesis, teñido con Gel Red 5. Análisis de los resultados

39 RFLP: PCR-RFLP Más simple y económico que el RFLP tradicional. Se requiere mayor información de la zona donde ocurre la mutación. Generalmente es la mutación que genera el trastorno la que da lugar al polimorfismo.

40 Transferencia Northern: Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica permite estudiar la expresión génica celular. Actualmente esta técnica ha caído en desuso, debido a la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa(pcr).

41 Transferencia Northern: Se utiliza para analizar fragmentos de RNA obtenidos a partir de extracción.

42 Transferencia Northern:

43 Comparación entre transferencias Northern y Southern:

44 Dot Blot: Se utiliza para detección de mutaciones puntuales, principalmente aquellas que no modifican el patrón de restricción de una secuencia de nucleótidos. Revelado: Sondas ASO Condiciones de hibridación de elevada astringencia.

45 El análisis de mutaciones puntuales utilizando la hibridación de sondas ASO se basa en el principio de que la presencia de UN SOLO ERROR DE APAREAMIENTO entre un nucleótido de la sonda y el ADN blanco es suficiente para desestabilizar el híbrido. Una de las primeras técnicas utilizadas para el análisis de mutaciones puntuales CONOCIDAS sobre fragmentos amplificados de ADN.

46 PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas) 1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.

47 PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas) 2. Dot Blot: desnaturalización y transferencia de los productos amplificados a una membrana. El producto de PCR se desnaturaliza (NaOH 2N y 95 C). Se añade a los pocillos donde el vacío impulsa el pasaje de la solución a través de la membrana (nylon o nitrocelulosa). La membrana se seca entre filtros durante una hora a 80 C en estufa (o por cross linker).

48 PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas) 3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas y complementarias para la secuencia de interés. Pre-hibridación: solución de SDS y ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Bloquea la membrana para evitar reacciones inespecíficas (2h a 37 C). Hibridación: sonda normal y mutada (8h a 37 C).

49 PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas) 4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada. 5. Interpretación e informe. Interpretación e informe: Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación. Individuo 2:-/- : No presenta la mutación. Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación. Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación. Individuo 5:-/- : No presenta la mutación. Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación. Individuo 7:-/- : No presenta la mutación. Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.

50 Anemia Falciforme PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

51 PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

52 PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de Sondas) 1. Amplificación por PCR del fragmento de interés. 2. Desnaturalización del producto de PCR doble cadena. 3.Hibridación de las sondas marcadas (sondas alelo específicas marcadas con biotina y sonda común marcada con fluoresceína)

53 4.Ligamiento 5.Captura y revelado PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de Sondas)

54 PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de Sondas) WT M Ac acoplado a la enzima+ sustrato Sonda capturada Estreptavidina tapizando los wells

55 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática. Se lleva a cabo una reacción de amplificación del ADN en presencia de los cuatro dntps y concentraciones mucho menores de los cuatro análogos ddntps, que dan lugar a la terminación de la síntesis cuando son incorporados. Resolución de bandas en geles de poliacrilamida

56 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.

57 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.

58 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación automática.

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