INTERACCIONES PROTEÍNA - LIGANDO. Proteína = P Ligando = A

Transcripción

1 INTERACCIONES PROTEÍNA - LIGANDO Muchas funciones biológicas involucran la interacción de pequeñas moléculas (metabolitos, reguladores, señales) que llamamos ligandos, con superficies específicas de macromoléculas como las proteínas que participan en distintos procesos celulares. Esta interacción implica la formación de enlaces nocovalentes entre la pequeña molécula o ión (ligando) con una región específica de la macromolécula (proteína) que llamamos sitio de unión. La unión de un ligando a una proteína puede ser tan fuerte que parezca irreversible, pero si no se forman enlaces covalentes, lo podemos considerar un proceso en equilibrio. Proteína = P Ligando = A P + A K = [PA]/ [P][A] PA K = constante de equilibrio de asociación K`= constante de equilibrio de disociación = 1/K [PA]= concentración del complejo proteína-ligando [P]= concentración de proteína (no acomplejada) [A]= concentración de ligando libre P + A PA De esta interacción nos interesa estudiar: - estequiometría, número de sitios de unión que tiene la proteína para este ligando A Proteína = P Ligando = A P + A PA - afinidad, con qué fuerza se une A a P, comparar con la fuerza de unión de otro ligando B a la misma proteína -cinética de la interacción - cambios estructurales que ocurren en la proteína luego de la unión de A, que pueden o no llevar a cambios en la funcionalidad de la proteína - información estructural sobre el sitio de unión de A a P, fuerzas que intervienen en la unión K = [PA]/ [P][A] K = constante de equilibrio de asociación K`= constante de equilibrio de disociación = 1/K [PA]= concentración del complejo proteína-ligando [P]= concentración de proteína (no acomplejada) [A]= concentración de ligando libre

2 Sólo un sitio de unión Parámetro experimental r: r = moles de ligando unido por mol de proteína r = [A]unido/ [P]total [A]unido = [PA] [P]total = [P] + [PA] r = [PA]/ [P] + [PA] K = [PA]/ [P][A] r = K [A]/ 1+K [A] un sitio de unión, n=1 con afinidad K (M -1 ) 15.6 Múltiples sitios de unión Múltiples sitios de unión r = moles de ligando unido por mol de proteína r = [A]unido/ [P]total [A]unido = [PA] + 2[PA 2 ] + 3[PA 3 ] +... [A]unido = i[pa] i [P]total = [PA i ] K i = [PA i ]/ [P][A] i Si los sitios de unión son idénticos e independientes: K 1 = K 2 = K 3 =... = K r = n K [A]/ 1 + K [A] n sitios de unión todos con = afinidad K (M -1 )

3 Para evaluar los parámetros n y K, se linealiza hipérbola: la Doble recíproco: 1 / r = 1 / n + 1 / n K [A] Scatchard: r / [A] = n K - r K 15.9 b a n sitios de unión todos con = afinidad K (M -1 ) Doble recíproco Scatchard J. BIOL. CHEM. 265, , 1990 The Human a2-macroglobulin Receptor Contains High Affinity Calcium Binding Sites Important for Receptor Conformation and Ligand Recognition

4 Múltiples sitios de unión no equivalentes gráfico de Scatchard no da lineal gráfico de Hill: log (r / n - r) = log K + log [A] si la curva tiene pendiente >1 para alguna [A] cooperatividad positiva si la curva tiene pendiente <1 para alguna [A] cooperatividad negativa las proteínas que presenta cooperatividad de unión son multiméricas, varias subunidades

5 Métodos experimentales para obtener datos de unión de ligandos a proteínas 1) Medir la fracción de ligando unido, r El complejo proteína-ligando se separa del ligando libre: diálisis en equilibrio (es la técnica más exacta pero muchas veces demora en alcanzarse el equilibrio y se requiere cantidades apreciables de muestra) filtración por membrana, centrifugación o ultrafiltración cromatografía de gel filtración sedimentación Métodos experimentales para obtener datos de unión de ligandos a proteínas 2) Medir la fracción de sitios de unión ocupados, O O = r / n = fracción de saturación se debe seguir un cambio ( X) ya sea en al proteína o en el ligando luego de la unión X / X total = O se grafica X en función de [A] si se conoce n (número total de sitios) se puede calcular r y de ahí el tratamiento es igual que para diálisis en equilibrio

6 15.5 Métodos experimentales para obtener datos de unión de ligandos a proteínas 2) Medir la fracción de sitios de unión ocupados, O se debe seguir un cambio ( X) ya sea en al proteína o en el ligando luego de la unión X / X total = O fluorescencia resonancia Raman absorción UV-vis infrarrojo dicroismo circular sedimentación NMR EPR electroforesis capilar difracción RX susceptibilidad a hidrólisis (por proteasas) susceptibilidad a oxidación (por peroxidasas) Biochemistry 1988, 27, Spectroscopic and Thermodynamic Studies on the Binding of Gadolinium( 111) to Human Serum Transferrin FIGURE 2: (A) EPR titration of 3.6 X lo4 M apotransferrin in 0.05 M Hepes, ph 7.4, with Gd(II1). The ratio of Gd to transferrin is given by the number at the beginning of each spectrum. Arrows mark g = 4.1. Microwave frequency, GHz; microwave power, 10 mw; modulation frequency, 100 khz; modulation amplitude, 10 G; sweep time, 200 s; time constant, 0.5 s; sample temperature, 77 K. (B) Plot of the amplitude of the g = 4.1 signal (1650 G) vs the Gd:transferrin ratio. Biochemistry 1988, 27,

7 Los complejos metálicos como ligandos en la interacción con proteínas Los complejos metálicos como ligandos en la interacción con proteínas Por qué es importante estudiar esta interacción? puede ser la base del mecanismo de acción farmacológica del complejo puede mejorar su biodistribución puede resultar un complejo inactivo puede resultar un complejo más activo puede modificar la funcionalidad de la proteína el conocimiento de esta interacción puede ayudar al diseño de complejos metálicos (ligandos) más eficientes Las proteínas más utilizadas para ensayar esta interacción son las proteínas séricas: albúmina (humana o bovina) transferrina (o apotransferrina) IgG Las proteínas séricas (y en particular la seroalbúmina, la más concentrada) son el principal blanco si el metalofármaco es administrado i/v, e influye en su biodisponibilidad HSA 3D Studies on the interactions between human serum albumin and imidazolium [trans-tetrachlorobis(imidazol)ruthenate(iii)] J. Inorg. Biochem. 73 (1999)

8 J Inorg Biochem 73 (1999) 123- J Inorg Biochem 73 (1999) 123-

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