Clave CGPI: Informe correspondiente al período de enero a Diciembre de 2008

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1 ANEXO.- DESARROLLO TÉCNICO DE LA INVESTIGACIÓN INFORME FINAL: PROYECTO ESTUDIO DEL EFECTO SECUNDARIO DEL EXTRACTO CRUDO DE Sedum praealtum CON PROPIEDAD ESPERMICIDA EN LA ESPERMATOGÉNESIS Y EPITELIO VAGINAL DE RATONES CD1 Clave CGPI: Informe correspondiente al período de enero a Diciembre de 2008 RESUMEN El extracto crudo de Sedum praealtum presenta propiedad espermicida, debido posiblemente a la presencia de metabolitos como alcaloides, ya que plantas con dicha propiedad se caracterizan por presentar alcaloides que inhiben la síntesis de DNA y proteínas, además inhibe la fosforilación oxidativa de las mitocondrias y como consecuencia la movilidad de los espermatozoides; por lo cual el objetivo del trabajo fue conocer mediante el estudio histológico de ovarios, oviductos, cuernos uterinos, vaginas y testículos de ratones CD1, la duración del efecto del extracto de Sedum praealtum en el desarrollo embrionario, en los cambios cíclicos del epitelio vaginal durante las diferentes fases del ciclo estral, en los testículos (particularmente en el proceso de espermatogénesis) y en los riñones e hígado, sobre todo comparar el efecto del extracto administrado intraperitoneal y oralmente. Se trabajo con ratones CD1, cuyas hembras fueron cicladas mediante el análisis de los frotis vaginales, separándose aquellas encontradas en las fases de proestro, estro, metaestro y diestro, las cuales se utilizaron para estudiar el efecto en el epitelio vaginal, administrando intravaginalmente las dosis de 25 y 50 mg/kg y se sacrificaron 12 días después (aproximadamente 3 ciclos) de la administración del extracto; particularmente un segundo grupo de hembras encontradas en la fase de proestro y estro, recibieron intravaginalmente 0.03 ml del extracto (jugo) fresco (grupo experimental), en tanto que al grupo testigo se le administro por la mismo vía 0.03 ml de solución salina e inmediatamente después de la administración, se aparearon con el macho y al día siguiente se revisaron para comprobar la presencia del tapón vaginal que se considero como el primer día de gestación., las hembras se sacrificaron en el 1, 3, 4 y 6 día de gestación, para obtener los ovarios, oviductos y cuernos uterinos que se fijaron en formol al 10% durante 72 horas, se procesaron histológicamente con la técnica Hematoxilina- Eosina. Para estudiar el efecto del extracto en la espermatogénesis, se utilizaron machos adultos que recibieron cada 15 días durante un mes por vía intraperitoneal y oral el extracto de Sedum en las dosis de 25, 50 y 100 mg/kg, finalmente se sacrificaron un mes más tarde para obtener los testículos y epidídimos que se fijaron con formol al 10% durante 72 horas y posteriormente se procesaron histológicamente y se tiñeron con la técnica Hematoxilina-Eosina. Para el estudio del efecto del extracto de Sedum praealtum en los riñones e hígado, se obtuvieron dichos órganos tanto de las hembras tratadas para el estudio del efecto en el epitelio vaginal, como de los machos tratados oralmente,

2 los cuales se fijaron con formol al 10% durante 72 horas, se procesaron histológicamente y se tiñeron con la técnica Hematoxilina Eosina. Histológicamente se observó que el epitelio vaginal de las hembras tratadas con el extracto y sacrificadas 12 días después de la administración, presentó la recuperación de los cambios cíclicos característicos de cada fase del ciclo estral, sólo en las hembras tratadas con las dosis de 10 y 25 mg/kg. Anatómicamente se observo que las hembras tratadas con 0.03 ml del jugo de la planta y que fueron sacrificadas en el 6 día de gestación, presentaron una disminución del número de embriones con respecto al número de cuerpos lúteos. Histológicamente se comprobó que el extracto provocó un retraso de 24 horas en el desarrollo embrionario de las hembras de uno, tres y cuatro días de gestación; en tanto que en hembras de 6 días de gestación se localizaron los embriones implantados en la fase de pregastrulación. Los machos tratados oral e intraperitonealmente con el extracto en las dosis de 50 y 100 mg/kg y sacrificados 12 días después de la última administración, presentaron la recuperación del epitelio germinal que se manifestó por la presencia de todos los tipos celulares del proceso de espermatogénesis. En el caso de los riñones e hígado obtenidos tanto de hembras como de machos que recibieron diferentes tratamientos, se observó que no fue alterada su estructura histológica.. Según los resultados, se puede establecer que las alteraciones provocadas por el extracto en las dosis de 10, 25, 50 y 100 mg/kg, 0.03 ml, tanto en el desarrollo embrionario, como en los cambios cíclicos del epitelio vaginal y la espermatogénesis se reestablecen, así el desarrollo embrionario en el 6 día de gestación, el epitelio vaginal 12 días después del tratamiento, la espermatogénesis un mes después del último tratamiento y particularmente en el caso de hígado y riñones no son afectados. INTRODUCCIÓN Entre los métodos más utilizados para el control de la natalidad se encuentran los espermicidas de efecto local (nivel vagina) que contienen como principio activo al nonoxinol-9; el cual altera la integridad de la membrana de los espermatozoides, así como la de cualquier tipo celular, incluyendo las del epitelio vaginal (Farre y Carrera, 1993), causando como consecuencia la irritación y ulceración de la mucosa vaginal (Henry, 1980). Debido a dichos efectos, es necesario llevar a cabo estudios que permitan encontrar agentes naturales con propiedad anticonceptiva y con menos efectos secundarios. Sedum dendroideum presenta propiedades anticonceptivas, ya que se utiliza en el estado de Morelos, México, mediante lavados vaginales precoitales; en tanto que el liofilizado, provoca la inmovilización de los espermatozoides y como consecuencia disminuye el coeficiente de fecundidad.

3 Plantas con propiedad espermicida se caracterizan por su contenido de Ialcaloides como emetina, cloroquina, quinacrina y quinina que inhiben la fosforilación en las mitocondrias, así como la síntesis de DNA y proteínas (Trifunac y Bernstein, 1982). Estudios fitoquímicos del extracto crudo de Sedum praealtum, han demostrado la presencia de metabolitos como alcaloides, terpenos, taninos y flavonoides. Debido a dicha propiedad, es necesario llevar a cabo estudios que permitan conocer el efecto del extracto en procesos que se caracterizan por la síntesis de proteínas y DNA, como es el caso de la espermatogénesis, así como en los cambios cíclicos del epitelio vaginal durante las diferentes fases del ciclo estral y en el desarrollo embrionario. Estudios fitoquímicos del extracto crudo de Sedum praealtum, han demostrado la presencia de metabolitos como azúcares, terpenos, taninos flavonoides y alcaloides; por lo que es de gran interés conocer los efectos secundarios del extracto crudo de Sedum praealtum en procesos que se caracterizan por presentar síntesis de proteínas y ADN, como es el caso de la espermatogénesis; los cambios cíclicos del epitelio vaginal en las diferentes fases del ciclo estral; en las primeras fases del desarrollo embrionario de ratón como la implantación y pregastrulación. Por lo tanto el objetivo fue establecer mediante el análisis histológico de testículos, del epitelio vaginal, de los sitios de implantación (útero), de las vaginas de ratones CD1, además de riñones e hígado, el efecto secundarios del extracto crudo de Sedum praealtum en los procesos de espermatogénesis, ovogénesis, desarrollo embrionario y los cambios cíclicos del epitelio vaginal en las diferentes fases del ciclo estral (proestro, estro, metaestro y diestro) y en riñones e hígado. MÉTODOS Y MATERIALES MATERIAL BIOLÓGICO Sedum praealtum (Fig.1), conocida como siempreviva, pertenece a la familia Crassulaceae, fue colectada en el estado de Hidalgo y el extracto crudo obtenido por el método de percolación y proporcionado por el Laboratorio de Fitoquímica del Departamento de Farmacia de la E.N.C.B. Se trabajó con ratones de la cepa CD1, adultos de 25 a 30 g de peso que fueron alimentados con pellets de purina y agua las 24 horas, mantenidos en un ciclo de 12 horas de luz por 12 de oscuridad en jaulas con aserrín; los cuales fueron proporcionados por el bioterio de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Meta 1 Se llevó a cabo la recopilación bibliográfica, referente a los diferentes temas de investigación.

4 . Meta 2 Para llevar a cabo el estudio del efecto secundario del extracto crudo de Sedum praealtum en el proceso de espermatogénesis (Meta 2), se formaron el lote testigo que recibió oralmente 0.05 ml de solución salina, integrado por grupos de 5 machos cada uno correspondientes a cada una de las dosis del extracto trabajadas; en tanto que los lotes experimentales formados por grupos de 5 ratones que recibieron oralmente las soluciones del extracto crudo y floral en concentraciones de 50 y 100 mg/kg de peso, las cuales fueron administradas cada 15 días durante un mes y se sacrificaron un mes después de la última administración. Fig. 1. Sedum praealtum La fotografía está incluida en el informe que se entregó a SEPI Transcurrido el tiempo después de la administración, los ratones tanto del lote testigo, como experimental se sacrificaron para obtener de cada uno el aparato reproductor que serán procesados histológicamente. Inmediatamente después de sacrificarlos se procedió a fijarlos en formol al 10%, durante 72 horas, transcurrido el tiempo de la fijación se lavaron con agua de la llave durante 12 horas para eliminar el fijador. La deshidratación se llevó a cabo efectuando cambios de 60 minutos en alcoholes (Merck) de concentración gradual (35 o, 50 o, 70 o, 85 o, 96 o I, II y III, Absoluto I, II y III). Al final de la deshidratación, se transparentaron con tolueno y se incluyeron en parafina efectuando cambios de 24 horas en parafinas (Merck) de diferente punto de fusión (52º-54 ºC, 54º- 56 ºC y 56º- 58 ºC ) y finalmente se incluyeron en parafina de 56º- 58 ºC. Una vez incluidos los testículos, se procedió a efectuar cortes de 6 micras de grosor en un micrótomo, los cuales se montaron en portaobjetos usando el líquido de Ruyter y una platina calentable para extenderlos. Las preparaciones obtenidas se procesaron con la técnica Hematoxilina Eosina y se montaron con resina sintética, se analizaron histológicamente para la obtención de resultados. Meta 3 Para detectar histológicamente el efecto secundario del extracto en el epitelio vaginal, Las hembras que se utilizaron, se seleccionaron mediante el análisis de los frotis vaginales que se contrastaron con lugol (Merck), para establecer las fases del ciclo estral (proestro, estro, metaestro y diestro), considerando las características de los tipos celulares. Con las hembras seleccionadas se formaron los grupos testigo y experimental. En el caso del grupo testigo recibió intravaginalmente 0.03 ml de solución salina y las hembras del grupo experimental recibieron soluciones del extracto en concentraciones de 10, 25 y 50

5 mg/kg sacrificaron 12 días después del tratamiento. Minutos antes de sacrificarlas, se les tomó el segundo frotis vaginal que se fijo con alcohol de 96 ; lo que permitió establecer el efecto del extracto en cada una de las fases administradas. Inmediatamente después se sacrificaron para obtener los ovarios y vagina que se fijaron en formol al 10%. Posteriormente se procesaron con la técnica histológica que se inició con la eliminación del fijador al lavarlos con agua corriente durante 24 horas, para continuar con los siguientes pasos de la deshidratación: alcohol de 35, 50, 70 o, 85 o, 96 o I, II y III, Absoluto I, II y III. Al final de la deshidratación, se transparentaron con tolueno y se incluyeron en parafina efectuando cambios de 24 horas en parafinas (Merck) de diferente punto de fusión (52º-54 ºC, 54º- 56 ºC y 56º- 58 ºC ) y finalmente se incluyeron en parafina 56º- 58 ºC. Una vez incluidos los testículos, se procedió a efectuar cortes de 6 micras de grosor en un micrótomo, los cuales se montaron en portaobjetos usando el líquido de Ruyter y una platina calentable para extenderlos. Las preparaciones obtenidas, se tiñeron con la técnica Hematoxilina Eosina y se analizaron microscópicamente para obtener los resultados del efecto de las diferentes dosis del extracto en el epitelio vaginal. Meta 4 Para establecer el efecto del extracto fresco (jugo), se trabajo con hembras encontradas en las fases de proestro y estro, las cuales recibieron intravaginalmente 0.03 ml del jugo de las hojas de la planta e inmediatamente después se aparearon con el macho, al día siguiente se constato la presencia del tapón vaginal y se marcaron como el primer día de gestación. Las hembras preñadas se sacrificaron en el 1, 3, 4 y 6 día de gestación, para obtener los ovarios, oviductos y cuernos uterinos que se fijaron en formol al 10 % durante 72 horas. Transcurrido el tiempo de la fijación, se procedió a lavarlos con agua de la llave para eliminar el fijado y poder continuar con la deshidratación con alcoholes de concentración creciente (35, 50, 70 o, 85 o, 96 o I, II y III, Absoluto I, II y III, Absoluto I, II y III), para proseguir con la transparentación con tolueno y continuar con los cambios de parafina de diferente punto de fusión (52º-54 ºC, 54º- 56 ºC y 56º- 58 ºC ) y finalmente se incluyeron en parafina 56º- 58 ºC. Las piezas incluidas se cortaron en un micrótomo a 6 micras de grosor y se extendieron con el líquido de Ruyter y se montaron en portaobjetos, para teñirlas con la técnica Hematoxilina-Eosina y se montaron con resina sintética. Meta 5 Se analizaron las preparaciones histológicas de los testículos de los machos tratados con el extracto y sacrificados un mes después, así como las de los

6 ovarios y vaginas de las hembras tratadas y sacrifica 12 días después; además se analizaron los cortes de oviducto y cuernos uterinos. Dicho análisis permitió elaborar el escrito de diferentes tesis correspondientes a las metas propuestas, así como la elaboración de los resúmenes de los trabajos presentados en reuniones científicas y el informe final del proyecto. RESULTADOS Meta 1. Se recopiló la bibliografía necesaria para la elaboración de los informes de PIFI, registro de tesis, Servicios Sociales, Tesis, resúmenes para la presentación de trabajos en reuniones Científicas. Meta 2 El análisis microscópico de los cortes histológicos de testículos de los machos tanto del grupo testigo, como del grupo experimental que fue tratado oralmente con el extracto en concentraciones de 25 y 50 mg/kg de peso y sacrificados un mes después, presentaron resultados muy significativos en la estructura histológica del testículo y en el proceso de espermatogénesis. En los cortes histológicos del grupo testigo, se observaron las estructuras características como son los túbulos seminíferos que presentan un epitelio germinal grueso, debido a la presencia de todos los tipos celulares característicos del proceso de espermatogénesis (espermatogonias, espermatocitos de 1 y 2 orden, espermátides y espermatozoides en la luz de los túbulos (Fig. 2). En el caso de los testículos del grupo experimental, se observó que los machos tratados con el extracto en concentraciones de 25 y 50 mg/kg de peso, presentaron una recuperación del epitelio germinal, observándose que se pueden localizar nuevamente todos los tipos celulares, característicos del proceso de espermatogénesis (Fig. 3). Fig. 2. Corte histológico de testículo de ratones testigo, donde se observan los túbulos seminíferos llenos de células del proceso de espermatogénesis. Técnica H-E. 100X. Las fotografías están incluidas en el informe que se entregó a SEPI

7 Fig.3. Corte histológico de testículo tratado con el extracto y sacrificado un mes después, se observan los túbulos seminíferos con todos los tipos celulares. Tec.H-E. 100X Meta 3 En el análisis de las preparaciones correspondientes a los cortes histológicos de ovarios y vaginas de las hembras tratadas con el extracto en las dosis de 10 y 25 mg/kg de peso y que fueron sacrificadas 12 días después de la administración, se observó que las vaginas presentaron los cambios cíclicos característico de cada una de las fases del ciclo estral (proestro, estro, metaestro y diestro); lo que indica que el efecto inhibitorio del extracto desaparece en un tiempo que corresponde a tres ciclos consecutivos. En el caso de los ovarios, riñones e hígado se observó que no se presenta ninguna alteración en estos órganos, ya que se observan en el hígado los lobulillos hepáticos (Fig. 4) y en los riñones los clásicos corpúsculos renales en la corteza (Fig. 5) Fig..4. Corte histológico de hígado de hembra sacrificada 12 días después de la administración del extracto. Tec. H-E. 100X. Fig. 5. Corte histológico de riñón de hembra sacrificada 12 días después de la administración del extracto. Tec. H-E.. 100X Las fotografías están incluida en el informe que se entregó a SEPI Meta 4. Los embriones de las hembras que después del tratamiento intravaginal con el jugo de la planta se aparearon con el macho, presentaron un bloqueo en el desarrollo embrionario, observándose que el efecto se acentúa más en las fases de fertilización y segmentación. En las hembras sacrificadas en el primer día de gestación se observaron a nivel del oviducto ovocitos bloqueados en metafase II, lo que indica que no se llevó la fertilización, ya que en el grupo testigo se observó la presencia de cigotos En el caso de las hembras sacrificadas en el tercer día de gestación, se observaron a nivel del oviducto cigotos, lo que nos indica que se presento un retraso de 24 horas, ya que en las hembras del grupo testigo se caracterizaron por la presencia de embriones en la etapa de 8 blastómeros. En las hembras de 6 días de gestación, se observó que tanto en las hembras del grupo testigo como experimental, se presentaron embriones implantados en la fase de pregastrulación; lo que indica que los embriones que sobreviven se recuperan de retraso y continúan su desarrollo normalmente.

8 IMPACTO Considerando los resultados obtenidos tanto en el testículo, epitelio vaginal y desarrollo embrionario, se puede establecer que el extracto crudo de Sedum praealtum representa una alternativa para el control de la natalidad, mediante la inhibición de la espermatogénesis, ya que se observó que no desencadena efectos secundarios e incluso la inhibición desaparece y se presenta una recuperación de los eventos correspondientes. El efecto espermicida del extracto de Sedum praealtum presenta una duración de 24 horas, La inhibición de la epermatogénesis desencadenada por el extracto en los machos, representa un método para el control de la natalidad, por lo que es de suma importancia establecer la total recuperación de los machos (lo cual se plantea en la propuesta del proyecto 2009)