N Latex Cystatin C. Procedure

Transcripción

1 N Latex Cystatin C Intended Use N Latex Cystatin C is an in vitro diagnostics kit containing reagents for the quantitative determination of cystatin C in human serum and heparinized plasma by means of particle-enhanced immunonephelometry using the BN* Systems. Cystatin C measurements are used in the diagnosis and treatment of renal diseases. Summary and Explanation Cystatin C is a cysteine proteinase inhibitor with a relative molecular weight of 13,250 and is formed by all nucleated cells investigated 1,2. Since it is formed at a constant rate and freely filtered by the healthy kidney, this protein is a good marker of renal function. Serum concentrations of cystatin C are almost totally dependent on the glomerular filtration rate 3,4. A reduction in the glomerular filtration rate (GFR) causes a rise in the concentration of cystatin C. Cystatin C has not been shown to be affected by factors such as muscle mass and nutrition, factors which have been demonstrated to affect creatinine values. In addition, a rise in creatinine does not become evident until the GFR has fallen by approximately 50 %. Principle of the Method Polystyrene particles coated with specific antibodies to human cystatin C are aggregated when mixed with samples containing human cystatin C. These aggregates scatter a beam of light passed through the sample. The intensity of the scattered light is proportional to the concentration of the relevant protein in the sample. The result is evaluated by comparison with a standard of known concentration. Reagents Materials provided N Latex Cystatin C Kit, Code No. OQNM N Cystatin C Reagent, three vials with 2 ml each N Cystatin C Supplementary Reagent A, three vials with 0.5 ml each N Cystatin C Supplementary Reagent B, one vial with 1.6 ml N Cystatin C Control, Level 1, three vials for 1 ml each N Cystatin C Control, Level 2, three vials for 1 ml each Composition and Standardization N Cystatin C Reagent consists of a suspension of polystyrene particles coated with approximately 0.03 g/l anti-human cystatin C from rabbits. N Cystatin C Supplementary Reagent A contains rabbit immunoglobulin (14 g/l) in buffered solution. N Cystatin C Supplementary Reagent B consists of an aqueous solution of polyethylene glycol sorbitan monolaureate (85 g/l) and polyethylene glycol ether (27 g/l). N Cystatin C Control, Level 1 and N Cystatin C Control, Level 2 are lyophilized polygeline with urine proteins of human origin. The concentration of cystatin C was standardized with reference to purified cystatin C. Once reconstituted, the controls contain the cystatin C concentration as indicated on the respective vial label. Preservative N Cystatin C Reagent: Gentamicin 6.25 mg/l, Amphotericin mg/l N Cystatin C Supplementary Reagent A and B: Sodium azide <1 g/l N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2 after reconstitution: Sodium azide <1 g/l Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes. If discarded into drain, flush with a large volume of water to prevent azide build-up. Sodium azide can form explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead. 3. Each individual blood donation intended for use in the manufacture of N Cystatin C Reagent and N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2 was tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2 by FDA required testing. Only donations with negative findings were used for manufacture. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human tissue or body fluids should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material 5. Preparation of the Reagents N Cystatin C Reagent: The reagent is ready to use and can be used without additional preparation. Shake carefully to mix before the first use. N Cystatin C Supplementary Reagent: Pipette 0.5 ml of N Cystatin C Supplementary Reagent B into a vial of N Cystatin C Supplementary Reagent A and mix gently. N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2: Reconstitute the lyophilized contents of one vial with 1.0 ml distilled water. Shake carefully to mix. The N Cystatin C Control, Level 1 or Level 2, is ready to use 30 minutes after reconstitution. Storage and Stability Shelf life at +2 to +8 C: See expiry date on the label; Stability once opened or reconstituted: Two weeks (N Cystatin C Reagent and mixture of the N Cystatin C Supplementary Reagents) and four weeks (reconstituted N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2), if stored at +2 to +8 C securely capped immediately after each use. Do not freeze. On-board Stability: A minimum of five days, at eight hours per day, or comparable period of time. Note: On-board stability may vary, depending on BN* System used and laboratory conditions. For further details, refer to respective BN* System Instruction Manual. On-board stability of the N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2 on the BN ProSpec System is stated in the Instruction Manual of the system. Materials required, but not provided BN* System N Protein Standard UY, Code No. OQLV Cleaner SCS, Code No. OQUB (for BN* II and BN ProSpec System) N Diluent, Code No. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (optional), Code No. OVLE Additional materials and supplies as described in your BN* System Instruction Manual. Specimens Suitable samples are human serum or heparinized plasma, either as fresh as possible (stored no more than seven days at +2 to +8 C) or stored frozen. Samples can be stored at below -20 C for up to three months if they are frozen within 24 hours after collection and if repeated freeze-thaw cycles are avoided. Serum samples must be completely coagulated and, after centrifugation, must not contain any particles or traces of fibrin. Lipemic samples or frozen samples that are turbid after thawing must be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) prior to testing. Procedure OQNM G13 C0540 (1849) Notes 1. Consult your BN* System Instruction Manual for details regarding operation of the instrument. 2. The lyophilized reagent must not be used until properly reconstituted (at least 30 minutes after the addition of distilled water). 3. Allow reagents and samples to equilibrate to room temperature (+15 to +25 C) before use on the BN* 100 System. With a BN* II and BN ProSpec System reagents and samples stored at +2 to +8 C can be placed directly on the analyzer. 4. On the BN* 100 System, samples should be run at approximately the same ambient temperature (maximum 3 C deviation) as the measurements used for recording the reference curve. Assay Protocol for the BN* Systems The assay protocol for serum and plasma is given in the BN* System Instruction Manual and the software of the instrument. All steps are performed automatically by the system. Establishment of the Reference Curve Reference curves are generated by multi-point calibration. Serial dilutions of the N Protein Standard UY are automatically prepared by the instrument using N Diluent. The standard dilutions must be used within four hours. The reference curve is valid for two weeks. It can be used beyond this period of time as long as controls with corresponding method-depending target values such as the N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2 are reproduced within their respective confidence interval. If a different lot of reagent is used, a new reference curve must be generated. The exact measuring range depends upon the concentration of the protein in each lot of N Protein Standard UY. For typical figures refer to the BN* System s Instruction Manual. Assay of Specimens Samples are automatically diluted 1:100 with N Diluent. The diluted samples must be measured within four hours. If the results obtained are outside the measuring range, the assay can be repeated using a higher or lower dilution of the sample. Refer to BN* System Instruction Manual for information on repeat measurements using other dilutions. Internal Quality Control Assay N Cystatin C Controls, Level 1 and Level 2 after each establishment of a reference curve, the first opening of a reagent vial as well as with each run of samples. The control is assayed and evaluated as for patient samples. The controls are assayed and evaluated as for patient samples. The assigned value is given on its vial label. For the BN ProSpec System, a lot-data CD (Code No. OVLP) can be used to enter the assigned value. The confidence interval is the assigned value ± 20 %. The assigned value is intended for use as an assayed accuracy control. If applied for precision control, the user should establish the target concentration and confidence limits during a preliminary phase. If the result of a control is outside the confidence interval, the determination must be repeated. If the repeated determination confirms the deviation, a new reference curve should be established. Do not release patient result until the cause of deviation has been identified and corrected. Results The results are evaluated automatically by the analyzer and are represented in mg/l or in a unit selected by the BN* System user. Limitations of the Procedure Interferences by rheumatoid factors are suppressed by the use of the N Cystatin C Supplementary Reagent. Turbidity and particles in the samples may interfere with the determination. Therefore, samples containing particles must be centrifuged prior to testing. Lipaemic samples which cannot be clarified by centrifugation (10 minutes at approximately 15,000 x g) must not be used. No interference was observed from immunosuppressive drugs (Cyclosporine, Tacrolimus, Sirolimus, Mycophenolate, or Azathioprine). Interference from monoclonal or polyclonal antibodies used in the treatment of transplant patients has not been evaluated. In order to assure correct results on the BN* 100 Systems, determinations with N Latex Cystatin C should be performed first in the day before running any other assay, using N Cuvette Segments incubated previously with washing solution for about 16 hours. Alternatively, a separate set of N Cuvette Segments may be used exclusively for N Latex Cystatin C measurements. A separate set of cuvettes must be used, if determinations of total protein in urine or CSF have been performed the day before. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. Due to matrix effects, interlaboratory survey samples and control samples may yield results that differ from those obtained with other methods. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method specific target values. Reference Interval The reference interval was determined from a population of ostensibly healthy subjects with no history of renal disease. A total of 413 samples obtained from 194 males and 219 females ranging in age from 1 to 78 years were tested. The reference interval was calculated nonparametrically and was determined to be mg/l. This represents the central 95 % of the population. Nevertheless, each facility should determine its own reference intervals since values may vary depending on the population studied. Specific Performance Characteristics Sensitivity The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends therefore on the concentration of the protein in the N Protein Standard UY. Analytical sensitivity was calculated as two standard deviations above the mean signal of 20 replicates of N Diluent and was determined to be mg/l. Specificity No cross-reactivity of the applied antibodies is know. Precision The N Latex Cystatin C assay was used to measure cystatin C concentrations in N Cystatin C Control, Level 1 and Level 2, three serum pools and three plasma pools ranging from 0.8 to 7.1 mg/l. Duplicate determinations from two runs over twenty days were collected using a BN* System. Cystatin C Reproducibility Data Summary Mean value Within run From run to run Total (mg/l) SD (% CV) SD (% CV) SD (% CV) N Cystatin C Control, Level 1 N Cystatin C Control, Level 2 Serum Pool Serum Pool Serum Pool Plasma Pool Plasma Pool Plasma Pool OQNM G13 C0540 (1849) CS 1

2 Method comparison A total of 698 samples (cystatin C concentrations to 7.58 mg/l) were comparatively analyzed on a BN* II System (y) using the N Latex Cystatin C assay and compared to creatinine results (x). Summary of Method Comparison Regression Analysis Slope Intercept r S xy Cystatin C n (95 % Confi- (95 % Confi- interval dence interval) dence interval) (mg/l) Site A 0.52 ± ± (0.46, 0.58) (0.87, 1.35) Site B 0.70 ± ± (0.66, 0.74) (0.31, 0.47) Site C 0.79 ± ± (0.69, 0.89) (0.01, 0.59) Clinical Sensitivity and Specificity Five hundred subjects were recruited from patients undergoing an Iothalamate Clearance procedure for evaluation of GFR. Of these, 363 (73 %) were found to have an abnormal GFR based on the Iothalamate Clearance results. Samples were also assayed using a comparative creatinine assay. N Latex Cystatin C on a BN* II System and the creatinine assay demonstrated similar specificities (p = 0.170). The specificity of N Latex Cystatin C was 82 % compared to 88 % for creatinine. A significantly higher sensitivity was observed for N Latex Cystatin C than for creatinine (p <0.001). The sensitivity of N Latex Cystatin C was 94 % compared to only 81 % for creatinine. Clinical Sensitivity and Specificity Observed (%) 95 % Confidence Interval (%) Cystatin C Diagnostic Sensitivity 94 (91.96) Diagnostic Specificity 82 (76.89) Positive Predictive Value 93 (91.96) Negative Predictive Value 83 (77.89) Creatinine Diagnostic Sensitivity 81 (77.85) Diagnostic Specificity 88 (83.94) Positive Predictive Value 95 (92.97) Negative Predictive Value 64 (57.71) Note: The values cited for specific performance characteristics of the assay represent typical values and are not to be regarded as specifications for the N Latex Cystatin C Kit. Bibliography 1. Simonsen O, Grubb A, Thysell H. The blood serum concentration of cystatin C (gamma-trace) as a measure of the glomerular filtration rate. Scand J Clin Lab Invest 1985; 45: Randers E, Erlandsen EJ. Serum cystatin C as an endogenous marker of the renal function a review. Clin Chem Lab Med 1999; 37: Grubb A. Diagnostic value of analysis of cystatin C and protein HC in biological fluids. Clin Nephrol 1992; 38 Suppl 1: S Coll E, Botey A, Alvarez L, et al. Serum cystatin C as a new marker for noninvasive estimation of glomerular filtration rate and as a marker for early renal impairment. Am J Kidney Dis 2000; 36: U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) ; 1999; Section II; * BN is a trademark of in the USA. BN ProSpec is a registered trademark of in the USA, in Germany and other countries. N Latex Cystatin C Edition June 2004 Anwendungsbereich N Latex Cystatin C ist ein in-vitro-diagnostika Kit, mit Reagenzien zur quantitativen Bestimmung von Cystatin C in humanem Serum und Heparin-Plasma mittels partikelverstärkter Immun- Nephelometrie mit den BN* Systemen zur Beurteilung der Nierenfunktion. Diagnostische Bedeutung Cystatin C ist ein Cystein-Proteinase-Inhibitor mit einem relativen Molekulargewicht von , der von allen untersuchten kernhaltigen Zellen gebildet wird 1, 2. Die konstante Bildungsrate und die Tatsache, dass es von der gesunden Niere frei filtriert wird, machen dieses Protein zu einem guten Marker der Nierenfunktion. Die Serumkonzentration des Cystatin C hängt praktisch ausschließlich von der glomerulären Filtrationsleistung der Niere ab 3, 4. Eine Einschränkung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) führt zu einem Anstieg der Konzentration von Cystatin C. Diese zeigt erhebliche Vorteile gegenüber der Serum-Creatininkonzentration, die auch anderen Einflüssen unterliegt, z.b. Muskelmasse und Ernährung. Zudem macht sich ein Creatininanstieg erst bei einer Einschränkung der GFR um ca. 50 % bemerkbar. Prinzip der Methode Polystyrol-Partikel, die mit spezifischen Antikörpern gegen humanes Cystatin C beladen sind, bilden bei Mischung mit Cystatin C enthaltenden Proben Aggregate, an denen eingestrahltes Licht gestreut wird. Die Intensität des Streulichts ist abhängig von der Konzentration des jeweiligen Proteins in der Probe. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich mit einem Standard bekannter Konzentration. Reagenzien Inhalt der Handelspackung N Latex Cystatin C Kit, Bestell-Nr. OQNM N Cystatin C Reagenz, drei Flaschen mit je 2 ml N Cystatin C Zusatzreagenz A, drei Flaschen mit je 0,5 ml N Cystatin C Zusatzreagenz B, eine Flasche mit 1,6 ml N Cystatin C Kontrolle, Level 1, drei Flaschen für je 1 ml N Cystatin C Kontrolle, Level 2, drei Flaschen für je 1 ml Zusammensetzung und Standardisierung N Cystatin C Reagenz besteht aus einer Suspension von Polystyrol-Partikeln, die mit ca. 0,03 g/l Anti-Human-Cystatin C vom Kaninchen beladen sind. N Cystatin C Zusatzreagenz A enthält Immunglobulin vom Kaninchen (14 g/l) in gepufferter Lösung. N Cystatin C Zusatzreagenz B besteht aus einer wässrigen Lösung von Polyethylenglycolsorbitanmonolaureat (85 g/l) und Polyethylenglycolether (27 g/l). N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und N Cystatin C Kontrolle, Level 2 Lyophilisate aus Polygeline mit Urinproteinen humanen Ursprungs. Die Konzentration von Cystatin C wurde unter Bezugnahme auf gereinigtes Cystatin C kalibriert. Die Cystatin C Konzentration nach Rekonstitution der Kontrollen ist auf dem jeweiligen Flaschenetikett angegeben. Konservierungsmittel N Cystatin C Reagenz: N Cystatin C Zusatzreagenz A und B: N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2 nach Rekonstitution: Gentamicin 6,25 mg/l, Amphotericin 0,625 mg/l Natriumazid <1 g/l Natriumazid <1 g/l Warnung und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in-vitro-diagnostischen Anwendung. 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und Berührung mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Bei Entsorgung ins Abwasser mit viel Wasser nachspülen. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden. 3. Jede individuelle Spende, die zur Herstellung von N Cystatin C Reagenz und N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2 vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Gewebe oder Körperflüssigkeiten gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 5. Vorbereitung der Reagenzien N Cystatin C Reagenz: Das Reagenz ist gebrauchsfertig und kann ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt werden. Es ist vor dem ersten Gebrauch behutsam aufzuschütteln. N Cystatin C Zusatzreagenz: In eine Flasche N Cystatin C Zusatzreagenz A werden 0,5 ml N Cystatin C Zusatzreagenz B zugegeben und gemischt. N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2: Der lyophilisierte Inhalt einer Flasche ist in 1,0 ml destilliertem Wasser zu lösen. Die Lösung ist behutsam zu durchmischen. 30 Minuten nach Rekonstitution ist die N Cystatin C Kontrolle, Level 1 bzw. Level 2 gebrauchsfertig. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Lagerung bei +2 bis +8 C: das Verfallsdatum ist auf dem Etikett angegeben; Stabilität nach Öffnen bzw. Rekonstitution: zwei Wochen (N Cystatin C Reagenz sowie die Mischung der N Cystatin C Zusatzreagenzien) und vier Wochen (rekonstituierte N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2), sofern unmittelbar nach Gebrauch wieder dicht verschlossen bei +2 bis +8 C gelagert. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren werden. Stabilität auf den BN* Systemen: minimal fünf Tage mit jeweils acht Stunden, oder ein vergleichbarer Zeitraum. Hinweis: Die on-board Stabilität hängt von dem verwendeten BN* System sowie den Laborbedingungen ab. Weiterführende Angaben sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme enthalten. Die on-board Stabilität der N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2 auf dem BN ProSpec System ist in der Bedienungsanleitung des Systems angegeben. Zusätzlich benötigte Materialien BN* System N Protein Standard UY, Bestell-Nr. OQLV Cleaner SCS, Bestell-Nr. OQUB (für BN* II und BN ProSpec System) N Diluens, Bestell-Nr. OUMT BN* II Evaporation Stoppers (wahlweise), Bestell-Nr. OVLE Verbrauchsmaterial und Ausrüstung wie in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Untersuchungsmaterial Zur Messung sollen möglichst frische (maximal sieben Tage bei +2 bis +8 C aufbewahrte) oder gefroren gelagerte humane Serumproben oder Heparin-Plasmaproben eingesetzt werden. Werden Proben innerhalb von 24 Stunden nach Entnahme tiefgefroren, so ist eine Lagerung unterhalb von -20 C bis zu drei Monaten möglich, wenn wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermieden wird. Serumproben müssen vollständig geronnen sein und dürfen nach Zentrifugation keine Partikel oder Spuren von Fibrin enthalten. Lipämische Proben oder eingefrorene Proben, die nach dem Auftauen trüb sind, müssen vor der Bestimmung durch Zentrifugation (10 Minuten bei ca x g) geklärt werden. Testdurchführung Hinweise 1. Einzelheiten zur Bedienung der BN* Systeme sind der entsprechenden Bedienungsanleitung zu entnehmen. 2. Die angegebene Rekonstitutionszeit (mindestens 30 Minuten nach Zugabe von destilliertem Wasser) lyophilisierter Reagenzien ist einzuhalten. 3. Reagenzien und Proben sollen vor der Messung am BN* 100 System Raumtemperatur (+15 bis +25 C) erreicht haben. Am BN* II und BN ProSpec System können bei +2 bis +8 C gelagerte Reagenzien und Proben direkt zur Bestimmung eingesetzt werden. 4. Am BN* 100 System soll die Messung von Proben bei der Umgebungstemperatur durchgeführt werden, die auch bei der Aufnahme der Referenzkurve herrschte (maximal 3 C Abweichung). Assay-Protokoll an den BN* Systemen Das Assay-Protokoll für Serum und Plasma ist in der Bedienungsanleitung für das BN* System sowie in der Software des jeweiligen Gerätes enthalten. Alle Schritte werden automatisch vom System durchgeführt. Erstellung der Referenzkurve Referenzkurven werden über Mehrpunktkalibrierung erzeugt. Für die Erstellung werden automatisch Verdünnungsreihen des N Protein Standards UY mit N Diluens hergestellt. Die Standard- Verdünnungen müssen innerhalb von vier Stunden verwendet werden. Die Referenzkurve ist zwei Wochen lang gültig. Sie kann über diesen Zeitraum hinaus verwendet werden, solange Kontrollen mit verfahrensabhängigen Sollwerten wie z. B. die N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2 innerhalb des Vertrauensbereiches wiedergefunden werden. Bei Verwendung einer anderen Reagenzcharge muss eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Der exakte Messbereich hängt von der Proteinkonzentration jeder N Protein Standard UY Charge ab. Typische Messbereiche sind in der jeweiligen BN* System Bedienungsanleitung angegeben. Messung der Patientenproben Proben werden automatisch 1:100 mit N Diluens verdünnt. Sie müssen innerhalb von vier Stunden gemessen werden. Bei Messwerten, die außerhalb des Messbereichs liegen, kann die Messung aus einer höheren oder niedrigeren Probenverdünnung wiederholt werden. Wiederholungsmessungen aus weiteren Probenverdünnungen sind in den Bedienungsanleitungen der BN* Systeme beschrieben. Interne Qualitätskontrolle Die N Cystatin C Kontrolle, Level 1 und Level 2 sollte nach jeder Erstellung einer Referenzkurve, bei erstmaliger Verwendung einer Reagenzabfüllung sowie bei jeder Serie von Proben eingesetzt werden. Die Kontrollen werden im Ansatz und bei der Auswertung wie Patientenproben behandelt. Der Sollwert ist auf dem entsprechenden Flaschenetikett angegeben. Am BN ProSpec System kann er per Chargenangaben-CD (Bestell-Nr. OVLP) eingelesen werden. Als Vertrauensbereich gilt der Sollwert ± 20 %. Der angegebene Sollwert dient zur Qualitätskontrolle innerhalb eines Labors zur Bewertung der Präzision und analytischen Abweichung. Bei der Verwendung als Präzisionskontrolle sollten in einer Vorperiode Kontrollwert und Kontrollgrenzen vom Anwender ermittelt werden. Wenn das Ergebnis der Kontrollmessungen außerhalb des Vertrauensbereichs liegt, ist die Kontrollbestimmung zu wiederholen. Wird die Abweichung durch die Wiederholungsmessung bestätigt, sollte eine neue Referenzkurve aufgenommen werden. Patientenergebnisse dürfen erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Ursache der Abweichung identifiziert und behoben wurde. Ergebnisse Die Auswertung erfolgt automatisch in mg/l oder in einer vom Benutzer am BN* System auszuwählenden abgeleiteten Masseneinheit. OQNM G13 C0540 (1849) CS 2

3 Einschränkungen der Testdurchführung Störungen durch Rheumafaktoren werden durch die Verwendung des N Cystatin C Zusatzreagenzes unterdrückt. Trübungen und Partikel in den Proben können die Bestimmung stören. Deshalb müssen Proben, die Partikel enthalten, vor der Bestimmung zentrifugiert werden. Lipämische oder partikelhaltige Proben, die durch Zentrifugation (10 Minuten bei ca x g) nicht zu klären sind, sind von der Bestimmung auszuschließen. Eine Störung durch immunsuppresive Medikamente (Ciclosporin, Tacrolimus, Sirolimus, Mycophenolat oder Azathioprin) konnte nicht festgestellt werden. Eine mögliche Störung durch die bei der Behandlung von Transplantationspatienten eingesetzten monoklonalen oder polyklonalen Antikörper wurde nicht untersucht. Um die Ergebnissicherheit am BN* 100 System zu gewährleisten, müssen die Cystatin C-Bestimmungen am Morgen vor der Routine abgearbeitet werden, nachdem die N Reaktionsküvetten etwa 16 Stunden mit Waschlösung befüllt gestanden haben. Alternativ kann ein ausschließlich für die Cystatin C-Bestimmung reservierter Satz von N Reaktionsküvetten verwendet werden. Sollte am Vortag Gesamtprotein im Urin oder Liquor gemessen worden sein, so ist auf jeden Fall ein separater Satz von Küvetten einzusetzen. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Aufgrund von Matrixeffekten können für Kontroll- und Ringversuchsproben unterschiedliche Ergebnisse in Abhängigkeit von der verwendeten Bestimmungsmethode resultieren. Es kann daher notwendig sein, die Bewertung dieser Ergebnisse an methoden-spezifischen Zielwerten vorzunehmen. Referenzbereich Die Ermittlung des Referenzbereichs wurde anhand eines Kollektives von 413 offensichtlich gesunden Personen, die keinerlei Nierenerkrankungen aufwiesen, durchgeführt, wobei das Kollektiv 194 männliche und 219 weibliche Personen im Alter von 1 bis 78 Jahren umfaßte. Der Referenzbereich wurde nicht-parametrisch berechnet und beträgt 0,53-0,95 mg/l. Er repräsentiert den zentralen 95 % Bereich der untersuchten Population. Darüber hinaus sollte jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche ermitteln, da diese vielen Einflussgrößen unterliegen, die für jedes untersuchte Kollektiv verschieden sein können. Leistungsmerkmale der Bestimmung Empfindlichkeit Die Empfindlichkeit der Bestimmung wird durch die untere Grenze der Referenzkurve festgelegt und hängt damit von der Konzentration des Proteins im N Protein Standard UY ab. Die analytische Sensitivität, berechnet aus dem Mittelwert einer 20fach Bestimmung von N Diluens plus dem Zweifachen der Standardabweichung, betrug 0,005 mg/l. Spezifität Es sind keine Kreuzreaktionen der verwendeten Antikörper bekannt. Präzision Mit dem N Latex Cystatin C Assay wurden Doppelbestimmungen der N Cystatin C Kontrolle Level 1 und Level 2 sowie von je drei Serum- und Plasmapools im Bereich von 0,8 bis 7,1 mg/l Cystatin C am BN* System in jeweils zwei Läufen an 20 Tagen ermittelt. Cystatin C Präzisionsdaten Mittelwert In der Serie Von Lauf zu Lauf Gesamt (mg/l) SD (% VK) SD (% VK) SD (% VK) N Cystatin C Kontrolle, 0,9 2,5 2,0 2,8 Level 1 N Cystatin C Kontrolle, 1,8 2,3 2,2 2,9 Level 2 Serum Pool 1 0,8 2,5 1,5 2,4 Serum Pool 2 2,3 2,6 3,5 4,3 Serum Pool 3 7,1 1,7 2,4 2,9 Plasma Pool 1 0,8 3,1 1,9 3,1 Plasma Pool 2 2,6 1,5 2,9 3,4 Plasma Pool 3 6,5 2,5 1,8 2,7 Methodenvergleich In 698 Proben (Konzentration von Cystatin C bis 7,58 mg/l) wurde die Cystatin C-Konzentration an einem BN* II System (y) und vergleichend dazu Creatinin (x) bestimmt. Regressionsanalyse der Methodenvergleichsergebnisse Steigung Achsenabschnitt r S xy Cystatin C n (95 % Konfi- (95 % Konfi- Bereich denzinterval) denzinterval) (mg/l) Prüfstelle A 0,52 ± 0,03 1,11 ± 0,12 0,891 0,89 0,57-7, Prüfstelle B 0,70 ± 0,02 0,39 ± 0,04 0,833 0,41 0,46-4, Prüfstelle C 0,79 ± 0,05 0,30 ± 0,15 0,843 0,86 0,54-6,34 99 Klinische Sensitivität und Spezifität 500 Patienten, deren GFR mittels einer Iothalamat-Clearance-Prozedur bestimmt worden war, wurden in diese Studie einbezogen. Von ihnen hatten 363 (73 %) eine unnormale GFR gemäß der Iothalamat-Clearance. Proben dieser Patienten wurden mit N Latex Cystatin C an einem BN* II System und vergleichend auf Creatinin untersucht. N Latex Cystatin C und die Creatinin-Bestimmung wiesen eine vergleichbare diagnostische Spezifität auf (82 % vs. 88 %, p = 0,170). Die diagnostische Sensitivität von N Latex Cystatin C war signifikant höher als die der Creatinin-Bestimmung (94 % vs. 81 %, p<0,001). Klinische Sensitivität und Spezifität Resultat (%) 95 % Konfidenzintervall (%) Cystatin C Diagnostische Sensitivität 94 (91,96) Diagnostische Spezifität 82 (76,89) Positiver prädiktiver Wert 93 (91,96) Negativer prädiktiver Wert 83 (77,89) Creatinin Diagnostische Sensitivität 81 (77,85) Diagnostische Spezifität 88 (83,94) Positiver prädiktiver Wert 95 (92,97) Negativer prädiktiver Wert 64 (57,71) Anmerkung: Die angegebenen Werte für die Leistungsmerkmale der Bestimmung stellen typische Ergebnisse dar und sind nicht als Spezifikation für den N Latex Cystatin C Kit anzusehen. Literatur siehe englische Packungsbeilage. * BN ist eine Marke der in den USA. BN ProSpec ist eine eingetragene Marke der in den USA, in Deutschland und anderen Ländern. N Latex Cystatine C Domaine d utilisation N Latex Cystatine C est un coffret de diagnostic in vitro dont les réactifs permettent le dosage quantitatif de la cystatine C dans le sérum et le plasma hépariné humain, par immunonéphélémétrie sensibilisée avec des particules sur les systèmes BN*, pour l exploration de la fonction rénale. Intérêt diagnostique La cystatine C est un inhibiteur de la cystéine-protéinase, d un poids moléculaire relatif de , synthétisée par toutes les cellules nuclées investigées 1,2. Sa synthèse à un taux constant et le fait qu elle soit librement filtrée par le rein sain, font de cette protéine un bon marqueur de la fonction rénale. La concentration sérique de la cystatine C dépend pratiquement exclusivement de la capacité de filtration glomérulaire du rein 3,4. Une réduction du taux de filtration glomérulaire (TFG) entraîne une augmentation de la concentration de cystatine C. Cette mesure présente plus d intérêt que celle de la concentration de créatinine qui est soumise à d autres facteurs d influence, comme la masse musculaire ou l alimentation. De plus, l augmentation de la créatinine n est décelable qu à partir d une réduction du TFG d environ 50%. Principe de la méthode Les particules de polystyrène recouvertes d anticorps anti-cystatine C humaine s agglutinent lorsqu elles sont mélangées à un échantillon contenant de la cystatine C. L intensité de la lumière dispersée par le système est proportionnelle à la concentration de cystatine C de l échantillon. L exploitation se fait par rapport à un standard de concentration connue. Réactifs Conditionnement Coffret N Latex Cystatine C, code OQNM N Cystatine C Réactif, trois flacons de 2 ml chacun N Cystatine C Réactif complémentaire A, trois flacons de 0,5 ml chacun N Cystatine C Réactif complémentaire B, un flacon de 1,6 ml N Cystatine C Contrôle, niveau 1, trois flacons pour 1 ml chacun N Cystatine C Contrôle, niveau 2, trois flacons pour 1 ml chacun Composition et standardisation Le N Cystatine C Réactif est composé d une suspension de particules de polystyrène recouvertes d env. 0,03 g/l d anticorps de lapin anti-cystatine C humaine. Le N Cystatine C Réactif complémentaire A contient des immunoglobulines de lapin (14 g/l) en solution tampon. Le N Cystatine C Réactif complémentaire B est composé d une solution aqueuse de monolauréate de polyéthylène glycol sorbitane (85 g/l) et d éther de polyéthylène glycol (27 g/l). Le N Cystatine C Contrôle, niveau 1, et le N Cystatine C Contrôle, niveau 2, sont des lyophilisats obtenus à partir de polygélines additionnées de protéines urinaires d origine humaine. La concentration en cystatine C est étalonnée par rapport à de la cystatine C purifiée. La concentration des contrôles en cystatine C après leur reconstitution est indiquée sur l étiquette des flacons respectifs. Agents de conservation : N Cystatine C Réactif : gentamycine 6,25 mg/l amphotéricine 0,625 mg/l N Cystatine C Réactifs complémentaires A et B : azide de sodium <1 g/l N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 après reconstitution : azide de sodium <1 g/l Mises en garde et précautions d emploi 1. Réservé à un usage de diagnostic in vitro. 2. Les réactifs in vitro contenant de l azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. En cas d élimination dans l évier, rincer abondamment, car l azide de sodium peut devenir explosif au contact des métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. 3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du N Cystatine C Réactif et des N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 sont testés vis-à-vis de l anticorps AgHBs, de l anticorps anti-vhc, de l anticorps anti-vih1 et de l anticorps anti-vih2. Seuls les dons trouvés négatifs sont utilisés. Indépendamment de cela, toute préparation obtenue à partir de tissu ou de liquide humain doit être manipulée avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure un risque d infection 5. Préparation des réactifs N Cystatine C Réactif : le réactif est prêt à l emploi et peut être utilisé sans aucun prétraitement. L agiter avec précaution avant le premier emploi. N Cystatine C Réactif complémentaire : distribuer 0,5 ml de N Réactif complémentaire B dans un flacon de N Réactif complémentaire A, et mélanger. N Cystatine C Contrôles, niveau 1 et niveau 2 : reconstituer le contenu lyophilisé de chaque flacon avec 1,0 ml d eau distillée. Homogénéiser la solution avec précaution. Les N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 sont prêts à l emploi 30 minutes après leur reconstitution. Stabilité et conditions de conservation Conservation à +2/+8 C : la date de péremption est indiquée sur l étiquette. Stabilité après ouverture ou reconstitution : deux semaines (pour le N Cystatine C Réactif et le mélange des N Réactifs complémentaires), et quatre semaines (pour les N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 reconstitués), à condition de bien refermer les flacons après emploi et de les replacer immédiatement à +2/+8 C. Ne pas congeler les réactifs. Stabilité sur les systèmes BN* : au moins cinq journées de huit heures chacune, ou temps total équivalent. Remarque : la stabilité on-board dépend du système BN* utilisé ainsi que des conditions d utilisation du laboratoire. Pour plus de détails, se reporter au manuel d utilisation du système BN* utilisé. La stabilité «on-board» des N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 sur le système BN ProSpec est indiquée dans le manuel d utilisation du système. Matériel et autres réactifs nécessaires Système BN* N Standard Protéines UY, code OQLV Cleaner SCS, code OQUB (pour systèmes BN* II et BN ProSpec ) N Diluant, code OUMT Bouchons anti-évaporation pour BN* II (utilisation optionnelle), code OVLE Consommable et équipement selon les instructions du manuel d utilisation du système BN* utilisé. Échantillons à tester Utiliser des échantillons sériques ou plasmatiques héparinés humains, de préférence frais (conservés sept jours maximum à +2/+8 C), sinon congelés. Pour cela, utiliser des échantillons qui ont été congelés à au moins -20 C dans les 24 heures qui suivent leur prélèvement ; les utiliser dans un délai maximum de trois mois ; ne pas les recongeler après décongélation. Les échantillons sériques doivent être totalement coagulés et ne plus contenir aucune particule ni trace de fibrine après centrifugation. Les échantillons lipémiques ou devenus troubles après décongélation doivent être clarifiés par centrifugation (10 minutes à env x g) avant leur emploi dans le test. Ausgabe Juni 2004 OQNM G13 C0540 (1849) CS 3

4 Réalisation du test Remarques 1. Pour tout détail concernant l utilisation des systèmes BN*, se reporter au manuel d utilisation du système correspondant. 2. Respecter les temps de reconstitution indiqués pour les réactifs lyophilisés (au moins 30 minutes après l addition d eau distillée). 3. Porter réactifs et échantillons à la température ambiante (+15/+25 C) avant de les tester sur le système BN* 100. S ils sont testés sur un système BN* II ou BN ProSpec, ils peuvent être directement testés à +2/+8 C. 4. Sur le système BN* 100, la mesure des échantillons doit se faire à peu près à la même température (déviation maximale de ±3 C) que celle de la courbe d étalonnage. Protocole de dosage sur les systèmes BN* Le protocole de dosage pour sérum et plasma est indiqué dans les manuels d utilisation des systèmes BN*, ainsi que dans le logiciel de chaque appareil. Toutes les étapes sont effectuées automatiquement par le système. Établissement de la courbe d étalonnage La courbe d étalonnage est établie par un calibrage en plusieurs points, à partir d une série de dilutions du N Standard Protéines UY préparées avec le N Diluant. Les dilutions du standard doivent être utilisées dans les quatre heures. Une fois établie, la courbe d étalonnage est valable deux semaines, et peut être réutilisée pendant cette période aussi longtemps que des contrôles adaptés à la technique, par ex. les N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2, sont retrouvés à l intérieur de leur domaine de confiance respectif. Établir une nouvelle courbe d étalonnage à chaque changement de lot de réactif. Le domaine de mesure exact dépend de la concentration en protéine du lot de N Standard Protéines UY utilisé. Des domaines de mesure types sont indiqués dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Mesure des échantillons de patients Les échantillons sont dilués automatiquement au 1/100 avec le N Diluant. Ils doivent être mesurés dans les quatre heures qui suivent. Si on obtient des valeurs qui sortent du domaine de mesure, retester l échantillon à partir d une dilution plus élevée ou plus basse. Le protocole de retest à une autre dilution est indiqué dans les manuels d utilisation des systèmes BN*. Contrôle de qualité interne Introduire les N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2 à chaque établissement de courbe d étalonnage, à chaque changement de flacon de réactif, ainsi qu à chaque nouvelle série d échantillons. Traiter les contrôles comme des échantillons de patients, aussi bien dans le test que pour l exploitation des résultats. Les valeurs théoriques sont indiquées sur l étiquette des flacons. Sur le système BN ProSpec, elles peuvent être lues par l intermédiaire du CD de données spécifiques à chaque lot (code OVLP). Les domaines de confiance correspondent à la valeur théorique ±20 %. Les valeurs théoriques indiquées permettent à chaque laboratoire d effectuer un contrôle de qualité en évaluant la précision et la déviation analytique. Pour une utilisation des contrôles dans le cadre d un contrôle de précision, déterminer au préalable les valeurs de contrôle et les valeurs-limites propres au laboratoire. Si les valeurs obtenues pour les contrôles sortent des domaines de confiance correspondants, les contrôles doivent être retestés. Si la déviation est confirmée lors du deuxième test, établir une nouvelle courbe d étalonnage. Les résultats des patients ne peuvent être rendus qu après avoir identifié et solutionné la cause de la déviation. Résultats L exploitation est automatique et les résultats sont exprimés en mg/l ou dans l unité de masse choisie par l utilisateur parmi celles proposées par le système BN*. Limites du test Les interférences dues aux facteurs rhumatoïdes sont réduites par l utilisation du N Cystatine C Réactif complémentaire. Les échantillons troubles ou contenant des particules peuvent perturber le test. Aussi les échantillons contenant des particules doivent-ils être centrifugés avant le test. Les échantillons lipémiques ou contenant des particules qui ne peuvent être clarifiés par centrifugation (10 minutes à env x g) doivent être éliminés du test. Aucune interférence due à la présence de médicaments immunosuppresseurs (cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, mycophénolate et azathioprine) n a pu être observée. Aucune étude n a été effectuée sur l interférence éventuelle d anticorps polyclonaux ou monoclonaux utilisés pour le traitement des patients transplantés. Afin de garantir la fiabilité des résultats sur le système BN* 100, les dosages de cystatine C doivent être effectués le matin avant les tests de routine, lorsque les cuves réactionnelles du système BN* sont restées 16 heures avec le liquide de rinçage. Comme alternative, on peut également utiliser une série de cuves réactionnelles exclusivement réservées au dosage de la cystatine C. Si des dosages de protéines totales ont été effectués la veille sur des échantillons urinaires ou de LCR, il est alors impératif d utiliser une série spécifique de cuves. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en liaison avec l historique médical du patient, son tableau clinique, et les résultats des autres analyses. Du fait d effets matriciels, les résultats obtenus dans le cadre de contrôles nationaux peuvent diverger selon la méthode de dosage utilisée. Il peut dans ces cas-là être nécessaire d évaluer les résultats selon des valeurs-cibles spécifiques à chaque méthode. Domaine de référence Le domaine de référence a été déterminé à partir d un collectif de 413 sujets cliniquement sains, ne présentant aucune affection rénale. Ce collectif était composé de 194 sujets de sexe masculin et de 219 sujets de sexe féminin, âgés de 1 à 78 ans. Le domaine de référence a été calculé nonparamétriquement, et trouvé entre 0,53 et 0,95 mg/l. Il représente le domaine central de 95% de la population étudiée. Indépendamment de ces données, chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine de référence dans la mesure où celui-ci peut varier en fonction du collectif étudié. Caractéristiques du test Sensibilité La sensibilité du test est déterminée par la limite inférieure de la courbe d étalonnage, et dépend donc de la concentration en cystatine C du N Standard Protéines UY. La sensibilité analytique, calculée à partir de la valeur moyenne de 20 dosages du N Diluant à laquelle on ajoute le double de la déviation standard, a été trouvée à 0,005 mg/l. Spécificité Aucune réaction croisée avec les anticorps utilisés n a été observée. Précision Le dosage en double des N Cystatine C Contrôles niveau 1 et niveau 2, et de trois pools de sérums et trois pools de plasmas avec des concentrations allant de 0,8 à 7,1 mg/l de cystatine C a été effectué avec le coffret N Latex Cystatine C sur le système BN*, selon deux séries testées sur 20 jours. Données de précision de la cystatine C Valeur moyenne Répétabilité Reproductibilité Total (mg/l) DS (% CV) DS (% CV) DS (% CV) N Cystatine C Contrôle, 0,9 2,5 2,0 2,8 niveau 1 N Cystatine C Contrôle, 1,8 2,3 2,2 2,9 niveau 2 Pool de sérums 1 0,8 2,5 1,5 2,4 Pool de sérums 2 2,3 2,6 3,5 4,3 Pool de sérums 3 7,1 1,7 2,4 2,9 Pool de plasmas 1 0,8 3,1 1,9 3,1 Pool de plasmas 2 2,6 1,5 2,9 3,4 Pool de plasmas 3 6,5 2,5 1,8 2,7 Comparaison avec une autre méthode La concentration de cystatine C de 698 échantillons (concentration de cystatine C allant jusqu à 7,58 mg/l) a été dosée sur le système BN* II (y), en comparaison avec le dosage de créatinine (x). Analyse de régression des résultats de l étude comparative Pente Intersection de l axe r S xy Domaine de n (intervalle de (intervalle de cystatine C confiance 95%) confiance 95%) (mg/l) Centre d étude A 0,52 ± 0,03 1,11 ± 0,12 0,891 0,89 0,57-7, Centre d étude B 0,70 ± 0,02 0,39 ± 0,04 0,833 0,41 0,46-4, Centre d étude C 0,79 ± 0,05 0,30 ± 0,15 0,843 0,86 0,54-6,34 99 Sensibilité clinique et spécificité Une étude a porté sur 500 patients dont le TFG a été déterminé par un protocole de clairance au lothalamate. Sur ces 500 patients, 363 (73 %) avait un TFG anormal selon la clairance au lothalamate. Sur ces échantillons de patients on a dosé d une part la cystatine C avec le test N Latex Cystatine C sur le système BN* II, et d autre part la créatinine. Le test N Latex Cystatine C et le dosage de la créatinine ont montré une spécificité diagnostique équivalente (82 % contre 88 %, p = 0,170). La sensibilité diagnostique du test N Latex Cystatine C était par contre significativement plus élevée que celle du dosage de la créatinine (94 % contre 81 %, p<0,001). Sensibilité clinique et spécificité Résultat (%) Intervalle de confiance 95% (%) Cystatine C Sensibilité diagnostique 94 (91,96) Spécificité diagnostique 82 (76,89) Valeur prédictive positive 93 (91,96) Valeur prédictive négative 83 (77,89) Créatinine Sensibilité diagnostique 81 (77,85) Spécificité diagnostique 88 (83,94) Valeur prédictive positive 95 (92,97) Valeur prédictive négative 64 (57,71) Remarque : les valeurs indiquées comme caractéristiques du test représentent des résultats types, et ne doivent pas être considérées comme des spécifications du test N Latex Cystatine C. Littérature Voir mode d'emploi anglais. * BN est une marque de aux Etats-Unis. BN ProSpec est une marque déposée de aux USA, en Allemagne et dans d autres pays. N Latex Cistatina C Edition Juin 2004 Uso Previsto N Latex Cistatina C è un kit diagnostico in vitro per la determinazione quantitativa della Cistatina C nel siero e nel plasma eparinato umani mediante immunonefelometria amplificata al làtice utilizzando i Sistemi BN*. I dosaggi di Cistatina C vengono utilizzati per la diagnosi ed il trattamento delle patologie renali. Riassunto e Spiegazione La Cistatina C è un inibitore della cisteina-proteinasi, con un peso molecolare relativo pari a , ed è prodotta da tutte le cellule nucleate 1,2 sottoposte a studio. Poiché viene prodotta in quantità costante e filtrata liberamente dal rene sano, questa proteina è un buon marcatore della funzionalità renale. Le concentrazioni seriche di Cistatina C dipendono quasi totalmente dalla velocità di filtrazione glomerulare 3,4. Una diminuzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) determina un aumento della concentrazione di Cistatina C. La Cistatina C non ha mostrato influenza da fattori quali la massa muscolare e la nutrizione, valori che si sono dimostrati capaci di influenzare i valori della Creatinina. Inoltre, un incremento di Creatinina non diventa evidente finché la GFR non sia diminuita di circa il 50 %. Principio del metodo Le particelle di polistirene, ricoperte con anticorpi specifici anti-cistatina C umana, vengono agglutinate quando sono miscelate con campioni contenenti Cistatina C umana. Tali aggregati causano scattering della luce passante attraverso il campione. L intensità della luce deviata è proporzionale alla concentrazione della corrispondente proteina nel campione. Il risultato viene valutato per confronto con uno standard a concentrazione nota. Reagenti Materiali forniti Kit N Latex Cistatina C, Codice OQNM N Reagente Cistatina C, tre flaconi da 2 ml ciascuno N Cistatina C Reagente supplementare A, tre flaconi da 0,5 ml ciascuno N Cistatina C Reagente supplementare B, un flacone da 1,6 ml N Controllo Cistatina C, Livello 1, tre flaconi da 1 ml ciascuno N Controllo Cistatina C, Livello 2, tre flaconi da 1 ml ciascuno Composizione e Standardizzazione N Reagente Cistatina C: è costituito da una sospensione di particelle di polistirene ricoperte con circa 0,03 g/l di anticorpi anti-cistatina C umana da coniglio N Cistatina C Reagente supplementare A: contiene immunoglobuline da coniglio (14 g/l) in soluzione tampone. N Cistatina C Reagente supplementare B: è costituito da una soluzione acquosa di polietilenglicole sorbitan monolaureato (85 g/l) e di polietilenglicole etere (27 g/l). N Controllo Cistatina C, LIvello 1 e N Controllo Cistatina C, Livello 2: sono liofilizzati di poligelina con proteine urinarie di origine umana. La concentrazione di Cistatina C è stata standardizzata in riferimento a Cistatina C purificata. Dopo ricostituzione, i controlli contengono Cistatina C nella concentrazione indicata sull etichetta del rispettivo flacone. Conservanti: N Reagente Cistatina C: gentamicina 6,25 mg/l anfotericina 0,625 mg/l N Cistatina C Reagenti supplementari A e B: sodio azide < 1 g/l N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2 dopo ricostituzione: sodio azide < 1 g/l OQNM G13 C0540 (1849) CS 4

5 Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in vitro. 2. I reagenti contenenti sodio azide devono essere manipolati con le dovute cautele: Non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose! Se eliminati attraverso le condutture idrauliche, far scorrere abbondante acqua per prevenire la formazione di azidi. La sodio azide, a contatto con metalli pesanti come rame o piombo, può formare azidi esplosive. 3. Ogni donazione di sangue, utilizzata per la produzione del N Reagente Cistatina C e del N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2, è stata esaminata per HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 e anti-hiv2. Solo i campioni risultati negativi vengono utilizzati per la produzione. Tuttavia, poiché non è possibile escludere con assoluta certezza l assenza di agenti patogeni, tutti i materiali ottenuti da tessuti umani o da fluidi organici devono essere trattati con le dovute precauzioni rispettando le norme di sicurezza raccomandate per i materiali a rischio biologico 5. Preparazione dei reagenti N Reagente Cistatina C: Il reagente è pronto all uso e può essere utilizzato senza ulteriori preparazioni. Agitare bene per miscelare prima del primo utilizzo. N Cistatina C Reagente supplementare: Pipettare 0,5 ml di N Cistatina C Reagente supplementare B in un flacone di N Cistatina C Reagente supplementare A e mescolare delicatamente. N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2: Ricostituire il contenuto liofilizzato di ogni flacone con 1,0 ml di acqua distillata. Agitare bene per miscelare. N Controllo Cistatina C, Livello 1 o Livello 2, è pronto all uso 30 minuti dopo ricostituzione. Conservazione e validità Stabilità da +2 a +8 C: Vedere la data di scadenza sulle etichette; Stabilità dopo apertura o ricostituzione: Due settimane (N Reagente Cistatina C e miscela degli N Cistatina C Reagenti Supplementari) e quattro settimane (N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2), se conservati da +2 a +8 C ben chiusi immediatamente dopo l utilizzo. Non congelare. Stabilità on-board: Un minimo di cinque giorni, per otto ore al giorno, o periodo di tempo equivalente. Nota: La stabilità on-board può variare, a seconda del Sistema BN* utilizzato e delle condizioni di laboratorio. Per ulteriori dettagli, fare riferimento al rispettivo Manuale di Istruzioni Sistema BN*. La stabilità on-board di N controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2, su Sistema BN ProSpec è definita nel Manuale di Istruzioni del Sistema. Materiali richiesti, ma non forniti Sistema BN* N Protein Standard UY, codice OQLV Cleaner SCS, codice OQUB (per Sistemi BN* II e BN ProSpec) N Diluente, codice OUMT BN* II Evaporation Stoppers (opzionali), codice OVLE Altri materiali e consumabili come riportato nel Manuale d Istruzioni del Vostro Sistema BN*. Campioni in esame Sono adeguati campioni di siero umano o di plasma eparinato, sia freschi il più possibile (conservati per non oltre sette giorni da +2 a +8 C) che congelati. I campioni possono essere conservati a temperatura inferiore a -20 C per periodi fino a tre mesi se congelati entro 24 ore dal prelievo ed evitando ripetuti congelamenti e scongelamenti. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e, dopo centrifugazione, non devono contenere particelle o tracce di fibrina. I campioni lipemici o congelati, che si presentano torbidi dopo lo scongelamento, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 minuti a ca x g) prima del test. Esecuzione del test Note: 1. Per istruzioni più dettagliate, consultare il Manuale d Istruzioni per i Sistemi Nefelometrici Behring. 2. I reagenti liofilizzati non devono essere utilizzati prima di essere stati adeguatamente ricostituiti (almeno 30 minuti dopo aggiunta di acqua distillata). 3. Lasciar equilibrare reagenti e campioni a temperatura ambiente (da +15 a +25 C) prima dell utilizzo sui Sistemi BN* 100. Con i Sistemi BN* II e BN ProSpec reagenti e campioni conservati da +2 a +8 C possono essere collocati direttamente sull analizzatore. 4. Sul Sistema BN* 100, i campioni devono essere analizzati circa alla stessa temperatura ambiente (deviazione massima 3 C) utilizzata per le misure della curva di calibrazione. Protocollo Analitico per i Sistemi BN* Il protocollo analitico per siero e plasma viene fornito nel Manuale di Istruzioni dei Sistemi BN* e con il software degli strumenti. Tutti i passaggi vengono eseguiti automaticamente dal Sistema. Definizione della Curva di Calibrazione Le curve di calibrazione vengono generate mediante calibrazione multi-punto. Diluizioni seriali di N Protein Standard UY vengono preparate automaticamente dallo strumento utilizzando N Diluent. Le diluizioni dello standard devono essere utilizzate entro quattro ore. La curva di calibrazione è valida per due settimane. La curva può essere utilizzata oltre tale periodo di tempo finché i controlli come N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2 ed i relativi valori metodo-dipendenti rientrano nel corrispondente intervallo di confidenza. Se si utilizza un lotto diverso di reagente, occorre generare una nuova curva di calibrazione. L intervallo esatto di misurazione dipende dalla concentrazione della proteina in ogni lotto di N Protein Standard UY. Per valori tipici, fare riferimento al Manuale di Istruzioni del Sistema BN*. Analisi dei Campioni I campioni vengono diluiti automaticamente 1:100 con N Diluent. I campioni diluiti devono essere analizzati entro 4 ore. Se i risultati ottenuti sono al di fuori dell intervallo di misura, il dosaggio può essere ripetuto utilizzando una diluizione del campione più elevata o più bassa. Fare riferimento al Manuale di Istruzioni del Sistema BN* per informazioni sulla ripetizione delle misurazioni con diluizioni diverse. Controllo di Qualità Interno Analizzare N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2, dopo esecuzione di ogni curva di calibrazione, all apertura di un nuovo flacone di reagente e con ogni ciclo analitico su campioni. Il controllo viene analizzato e valutato come i campioni dei pazienti. I controlli vengono analizzati e valutati come i campioni dei pazienti. Il valore dichiarato è riportato sull etichetta di ogni flacone. Per il Sistema BN ProSpec, è possibile utilizzare un CD per i dati di lotto (codice OVLP) per inserire i valori dichiarati. L intervallo di confidenza è pari al valore dichiarato ± 20 %. Il valore dichiarato deve essere utilizzato come un controllo di accuratezza a titolo noto. Se impiegato per il controllo di precisione, l Utilizzatore dovrebbe definire la concentrazione target ed i limiti di confidenza in una fase preliminare. Se il risultato di un controllo è al di fuori dell intervallo di confidenza, la determinazione deve essere ripetuta. Se la ripetizione conferma la deviazione, occorre determinare una nuova curva di calibrazione. Non refertare risultati di pazienti finché la causa della deviazione non sia stata identificata e corretta. Risultati I risultati vengono valutati automaticamente dall analizzatore ed espressi in mg/l o in altra unità di misura selezionata dall Utilizzatore del Sistema BN*. Limitazioni della esecuzione del test Le interferenze da fattori reumatoidi vengono eliminate mediante l impiego dello N Cistatina C Reagente Supplementare. Torbidità o eventuali particelle presenti nei campioni possono interferire con il test. Pertanto, campioni contenenti particelle devono essere centrifugati prima dell analisi. Campioni lipemici che non possano essere chiarificati mediante centrifugazione (10 minuti a circa x g) non devono essere usati. Non è stata rilevata interferenza da farmaci immunosoppressori (Ciclosporina, Tacrolimus, Sirolimus, Micofenolato, o Azatioprina). L interferenza da anticorpi monoclonali o policlonali utilizzati nel trattamento di pazienti trapiantati non è stata valutata. OQNM G13 C0540 (1849) CS 5 Per assicurare risultati corretti sui Sistemi BN* 100, è necessario eseguire le determinazioni di Cistatina C della giornata per prime, prima di eseguire qualsiasi altro test di routine, utilizzando segmenti di N Cuvette precedentemente incubate con soluzione di lavaggio per circa 16 ore. In alternativa, una serie distinta di segmenti di N Cuvette può essere utilizzata esclusivamente per i dosaggi di C Latex Cistatina C. Occorre utilizzare una serie distinta di cuvette se il giorno precedente sono state eseguite determinazioni di proteine totali su urina o CSF. I risultati di questo test devono sempre essere interpretati insieme con l anamnesi del paziente, i dati clinici ed altri reperti. A causa dell effetto matrice, i campioni di controllo interlaboratorio ed i campioni di controllo possono produrre risultati diversi da quelli ottenuti con altri metodi. Può quindi essere necessario valutare tali risultati in rapporto ai valori attesi metodo-specifici. Ambito di riferimento L intervallo di riferimento è stato determinato su una popolazione di soggetti evidentemente sani, senza anamnesi di patologie renali. Sono stati analizzati in totale 413 campioni ottenuti da 194 maschi e 219 femmine di età variabile da 1 a 78 anni. L intervallo di riferimento è stato calcolato non parametricamente ed è risultato essere 0,53-0,95 mg/l. Tale intervallo rappresenta il 95% centrale della popolazione. Tuttavia, ogni Ente dovrebbe determinare i propri intervalli di riferimento poiché i valori possono variare a seconda della popolazione esaminata. Caratteristiche del test Sensibilità La sensibilità del dosaggio è definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende dalla concentrazione della proteina nello N Protein Standard UY. La sensibilità analitica è stata calcolata come due deviazioni standard al di sopra del segnale medio di 20 replicati di N Diluent ed è risultata pari a 0,005 mg/l. Specificità Non è nota alcuna reattività crociata per gli anticorpi utilizzati. Precisione Il dosaggio N Latex Cistatina C è stato utilizzato per determinare le concentrazioni di Cistatina C su N Controllo Cistatina C, Livello 1 e Livello 2, su pool di sieri e su tre pool di plasma con valori compresi tra 0,8 e 7,1 mg/l. Sono state raccolte determinazioni in duplicato di due cicli analitici nell arco di venti giorni utilizzando un Sistema BN*. Riassunto Dati Riproducibilità Cistatina C Valore medio DS Intraciclo DS Interciclo DS Totale (mg/l) (CV %) (CV %) (CV %) N Controllo Cistatina C, 0,9 2,5 2,0 2,8 Livello 1 N Controllo Cistatina C, 1,8 2,3 2,2 2,9 Livello 2 Pool di Sieri 1 0,8 2,5 1,5 2,4 Pool di Sieri 2 2,3 2,6 3,5 4,3 Pool di Sieri 3 7,1 1,7 2,4 2,9 Pool di Plasma 1 0,8 3,1 1,9 3,1 Pool di Plasma 2 2,6 1,5 2,9 3,4 Pool di Plasma 3 6,5 2,5 1,8 2,7 Confronto di metodi Campioni per un totale di 698 (concentrazioni di Cistatina C fino a 7,58 mg/l) sono stati analizzati comparativamente su un Sistema BN* (y) utilizzando N Latex Cistatina C e confrontati con i risultati della creatinina (x). Riassunto dell Analisi di Regressione del Confronto di Metodi Slope Intercetta r S xy Intervallo n (95% Intervallo (95% Intervallo Cistatina C di confidenza) di confidenza) (mg/l) Sito A 0,52 ± 0,03 1,11 ± 0,12 0,891 0,89 0,57-7, Sito B 0,70 ± 0,02 0,39 ± 0,04 0,833 0,41 0,46-4, Sito C 0,79 ± 0,05 0,30 ± 0,15 0,843 0,86 0,54-6,34 99 Sensibilità e Specificità Clinica Sono stati valutati cinquecento soggetti tra pazienti da sottoporre alla procedura di Clearance dello Iotalamato per la valutazione della GFR. Tra questi, 363 (73 %) hanno mostrato una GFR anormale in base ai risultati della Clearance dello Iotalamato. I campioni sono stati analizzati anche con un metodo di confronto per la creatinina. N Latex Cistatina C su Sistema BN* II e dosaggio della creatinina hanno evidenziato specificità similare (p = 0,170). La specificità di N Latex Cistatina C è risultata apri a 82 % in confronto all 88 % per la creatinina. È stata rilevata una sensibilità sensibilmente più elevata per N Latex Cistatina C rispetto alla creatinina (p < 0,001). La sensibilità di N Latex Cistatina C è risultata pari al 94 % rispetto all 81 % per la creatinina. Sensibilità e Specificità Clinica Rilevata (%) 95% Intervallo di Confidenza (%) Cistatina C Sensibilità Diagnostica 94 (91,96) Specificità Diagnostica 82 (76,89) Valore Predittivo Positivo 93 (91,96) Valore Predittivo Negativo 83 (77,89) Creatinina Sensibilità Diagnostica 81 (77,85) Specificità Diagnostica 88 (83,94) Valore Predittivo Positivo 95 (92,97) Valore Predittivo Negativo 64 (57,71) Nota: I valori citati per le caratteristiche analitiche del dosaggio rappresentano valori tipici e non devono essere considerati come specifiche del Kit N Latex Cistatina C. Bibliografia Vedi testo Inglese. * BN è un marchio registrato di negli USA BN ProSpec è un marchio registrato di negli USA, in Germania ed altri Paesi. N Látex Cistatina C Edizione Giugno 2004 Campos de aplicación El N Látex Cistatina C es un kit para diagnóstico in-vitro, conteniendo reactivos para la determinación cuantitativa de la cistatina C en suero humano y en plasmas con heparina, por medio de inmunonefelometría con partículas intensificadoras usando los Sistemas BN*. Las medidas de cistatina C son usadas para la evaluación de la función renal.