A. El punto 3 del método Reactivos queda de la siguiente manera:
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- José Ramón Duarte Ruiz
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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO COMPLEMENTO DEL MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA OCRATOXINA A MEDIANTE COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD (16/2001) LA ASAMBLEA GENERAL, De conformidad con el Párrafo 2 iv del Artículo 2 del Acuerdo sobre la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino del 3 de abril del 2001, CONSIDERANDO: Los trabajos de la Subcomisión de Métodos de Análisis de la OIV, La resolución Oeno 16/2001 referente a la determinación cuantitativa de la ocratoxina A en el vino mediante HPLC con detector fluorimétrico, previa purificación en columna de inmunoafinidad, Y la necesidad de completar dicho método con la especificación particular de los puntos críticos que hay que tener en cuenta, DECIDE: Completar la resolución Oeno 16/2001 que figura en la Recopilación de métodos internacionales de análisis de vinos y mostos con los puntos que figuran a continuación. A. El punto 3 del método Reactivos queda de la siguiente manera: 3. Reactivos 3.1 Reactivos para separar la ocratoxina A (OTA) en columna de inmunoafinidad Los reactivos siguientes se indican a modo de ejemplo. De hecho, algunos fabricantes de columnas de inmunoafinidad ofrecen soluciones de dilución y eluyentes específicos adaptados a sus productos. En ese caso, recomendamos que se respeten las indicaciones del fabricante Hidrogenofosfato de disodio dihidratado (Na 2 HPO 4 2H 2 O) CAS [ ] Dihidrogenofosfato de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 H 2 O) CAS [ ] Cloruro de sodio (NaCl) CAS [ ] Agua purificada para laboratorio, por ejemplo de tipo EN ISO 3696 (agua apta para uso en laboratorios de química analítica, especificación y método de ensayo [ISO 3696:1987]) Tampón PB (solución de dilución) 1
2 Disolver 60 g de Na 2 HPO 4 2H 2 O (3.1.1) y 8,8 g de NaH 2 PO 4 H 2 O (3.1.2) en 950 ml de agua y enrasar a 1 litro con agua Tampón PBS (solución de lavado) Disolver 2,85 g de Na 2 HPO 4 2H 2 O (3.1.1), 0,55 g de NaH 2 PO 4 H 2 O (3.1.2) y 8,7 g de NaCl (3.1.3) en 950 ml de agua y enrasar a 1 litro con agua Metanol (CH 3 OH) CAS [ ] 3.2 Reactivos para HPLC Acetonitrilo de calidad HPLC (CH 3 CN) CAS [ ] Ácido acético glacial (CH 3 COOH) CAS [ ] Fase móvil de la HPLC (agua: acetonitrilo: ácido acético glacial, 99:99:2, v/v/v) Mezclar 990 ml de agua con 990 ml de acetonitrilo (3.2.2) y 20 ml de ácido acético glacial (3.2.3). Si aparecen compuestos sin disolver, filtrar con un filtro de 0,45 μm. Desgasificar (por ejemplo, con helio) si el equipo de HPLC utilizado no dispone de una etapa de desgasificación. 3.3 Reactivos para preparar la disolución madre de OTA Tolueno (C 6 H 5 CH 3 ) CAS [ ] Mezcla de disolventes (tolueno:ácido acético glacial, 99:1, v/v). Mezclar 99 partes en volumen de tolueno (3.3.1) con una parte en volumen de ácido acético glacial (3.2.2). Los puntos 3.13 y 3.14 no cambian, pero su numeración es adaptada en 3.4 y 3.5. B. El punto 7 del método CALCULOS sufre la siguiente modificación: En la fórmula, se cambia la cifra «2» por «F» (factor de dilución). C. Se añade al método el anexo siguiente, que trata los puntos críticos del método. ANEXO Guía sobre los puntos críticos del método de determinación de la ocratoxina A mediante columna de inmunoafinidad (16/2001), de tipo II A continuación se enumeran los puntos críticos que se deben tener en cuenta a título indicativo y que sirven de guía para la aplicación del método. La numeración hace referencia a los párrafos de la resolución original. 2
3 1. Ámbito de aplicación A título indicativo, el método puede aplicarse a los mostos de uva, mostos de uva parcialmente fermentados y a los vinos jóvenes aún en fermentación. Los parámetros de validación sólo atañen a los vinos. 2. Fundamento El método consta de dos etapas distintas. La primera consiste en la purificación y la concentración de la OTA del vino o del mosto por retención en la columna de inmunoafinidad seguida de su elución. La segunda consiste en la determinación cuantitativa del eluido mediante HPLC con detector fluorimétrico a partir del extracto purificado. 3. Reactivos 3.13 Disolución madre de OTA Se desaconseja el uso de la OTA en forma sólida: utilizarla de preferencia en una solución estándar de OTA (punto 3.14) Disolución patrón de OTA Utilizar una disolución comercial cuya concentración (unos 50 μg/ml) esté adjunta y venga avalada por un certificado de análisis en el que se mencione el valor de referencia y la incertidumbre de la valoración. En principio, el volumen de estas disoluciones no viene certificado y hay que tomarlo con el equipo de pipeteo adjunto para preparar las disoluciones madres que vayan de 0,25 mg/l a 1 mg/l disueltas en etanol puro o en la fase móvil de la HPLC (3.2.3). Esta disolución se mantiene estable a -18 ºC durante al menos 4 años. 4. Instrumental 4.13 RECOMENDACIONES PARA EVALUAR EL RENDIMIENTO DE LAS COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD (opcional) En el método de análisis que nos ocupa, la fase de purificación en columna de inmunoafinidad constituye una fuente importante de incertidumbre. La experiencia ha demostrado que las columnas disponibles en el mercado pueden tener tasas de recuperación que van del 70% al 100%, por lo que conviene comprobar el rendimiento de un lote de columnas antes de utilizarlas. Se recomienda realizar esta operación cuando se cambie de fabricante o de tipo de columnas Caracterización del lote de columnas (determinación de la tasa de recuperación) Seleccionar unas 10 columnas representativas de los tipos que se usen habitualmente en el laboratorio que pertenezcan a diferentes lotes. Preparar el mismo número de vinos, que representan matrices distintas y cuya concentración de OTA es nula, y efectuar adiciones de patrón (x i ) que vayan de 0,5 μg kg -1 a 2 μg kg -1. Tras las adiciones, analizar rápidamente las n muestras con las columnas seleccionadas para obtener los valores y i. 3
4 Calcular los datos relativos a la tasa de recuperación, que es la cantidad medida con respecto a la cantidad añadida. (tasa de recuperación con la columna i) (tasa de recuperación media) (desviación típica de la tasa de recuperación) La desviación típica de la tasa de recuperación obtenida de este modo no representa únicamente la variabilidad de las tasas de recuperación de las columnas, sino que incluye también la incertidumbre típica del sistema de medida utilizado después de las columnas de HPLC. No obstante, se puede obtener una buena estimación de la desviación típica únicamente de la tasa de recuperación de las columnas al sustraer la incertidumbre típica del sistema de HPLC al error de recuperación calculado: - Estimar la incertidumbre típica S v (expresada en forma de desviación típica) del sistema de medida en sentido estricto (sin tener en cuenta la etapa del paso por la columna de inmunoafinidad). Para ello se puede utilizar un estudio de fidelidad de las soluciones de OTA. La desviación típica de la tasa de recuperación S p se calcula de la siguiente forma: Para un margen de concentración bastante amplio resulta preferible expresar su magnitud en forma de coeficiente de variación de la desviación típica (RSDR). CV% = S p 100/ concentración de la adición 5. Procedimiento El procedimiento expuesto en el punto 5 es orientativo. La composición de las soluciones de dilución y de lavado puede variar en función de los datos del fabricante de las columnas. Asimismo, la concentración de la muestra de vino diluido puede ajustarse según convenga. 4
5 6. Cuantificación de la ocratoxina a (ota) 6.1 Curva de calibración Para cada día de análisis o cada vez que cambien las condiciones cromatográficas hay que preparar una curva de calibración con las disoluciones preparadas al mezclar la disolución madre y la fase móvil (3.2.2). Los valores elegidos deben delimitar el intervalo de trabajo teniendo en cuenta el factor de concentración del vino. 5
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