QUÍMICA BIOLOGICA (FARMACIA Y MEDIO AMBIENTE) Curso 2010

Transcripción

1 QUÍMICA BIOLOGICA (FARMACIA Y MEDIO AMBIENTE) Curso Guía de problemas II: Ácidos Nucleicos. Seminarios 2 y 3. Temario: Estructura y propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos. Propiedades funcionales. Replicación. Herramientas básicas para el estudio de ácidos nucleicos: PCR, secuenciación, enzimas de restricción, electroforesis, etc. Bibliografía específica: - Bioquímica, Stryer, Quinta ed. Cap. 5.1 a 5.4 y Bioquímica, Zubay, segunda y tercera edición. Capitulo 7. Problema 1 Una solución de ADN doble cadena es calentada y luego enfriada rápidamente. Explique cómo cambiará la absorbancia a 260 nm durante el enfriamiento, si: a) La solución fue calentada hasta una temperatura algo menor que Tm. b) La solución fue calentada hasta una temperatura algo mayor que Tm. c) Explique lo que esperaría observar si la molécula de DNA utilizada fuera: c1) Simple cadena, con la secuencia: CTTGAACCGTCGACGGTTCAAG c2) Doble cadena, con la secuencia: AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT En ambos casos el experimento se realiza como en la situación b). Nota: Suponga que la longitud de los polinucleótidos no tiene incidencia, y que las mismas conclusiones que Ud. obtenga, se aplican igualmente a cadenas mucho más largas. Problema 2 Suponga que Ud. posee una muestra desconocida de ácido nucleico y se le pide caracterizarlo. Se encuentra lo siguiente: a) Una transición abrupta de la absorbancia con el aumento de temperatura, siendo la hipercromicidad del 30%. Con un enfriamiento rápido se observa una pequeña disminución de la DO. b) El material no desnaturalizado forma una sola banda en un gradiente densidad de CsCl a 1,77 g/cm 3. c) Luego de desnaturalizarlo por calentamiento y enfriarlo rápidamente (como en a) se recentrifuga, con lo cual desaparece la banda original y aparece una a 1,72 g/cm3. Dicha banda contiene la mitad del material capaz de absorber UV respecto de la anterior. Si el contenido del tubo se mezcla, luego de lo cual se mantiene a una temperatura intermedia (que permitiría la renaturalización) y se vuelve a centrifugar, la banda de 1,72 g/cm3 desaparece, y reaparece la banda original a 1,77 g/cm3, conteniendo también todo el material capaz de absorber UV observado la primera vez. d) Se repite la secuencia de pasos descripta en (c), excepto que antes de centrifugar, el material es tratado por 1 hora a ph=12,0 y renaturalizado rápidamente a ph=7,0. El resultado de la primera centrifugación es igual al de (c), pero la banda de 1,72 g/cm3 permanece después de todos los pasos de renaturalización.

2 Interprete cada uno de estos resultados y deduzca la estructura del ácido nucleico problema. 2 Problema 3 Se obtuvo un ácido nucleico parcialmente purificado y se lo sometió a electroforesis en agarosa, resultando una única banda (carril A en la Figura 1.4). Cuando a dicha muestra se la digirió con DNAsa (enzima que hidroliza DNA pero no RNA), se observó la banda del carril B. En otro ensayo, la muestra fue incubada con β-mercaptoetanol, y se obtuvo la banda del carril C. Si a continuación del tratamiento con β-mercaptoetanol se digiere con DNAsa, se obtiene el resultado del carril D. En el carril E se corrieron los marcadores de peso molecular. Explique cada uno de los resultados, especificando: a) A qué macromoléculas se deben? b) Cuáles son sus pesos moleculares? c) Qué tipo de interacciones están involucradas? d) Con qué experimento/s confirmaría su respuesta? Figura 1.4 Problema 4 Qué efectos tienen los siguientes reactivos sobre el valor de la Tm de un dsdna? a) Urea 7 M b) Formamida 90% c) Altas concentraciones de NaCl d) Agua pura e) La proteína 32 del fago T4 que cataliza el desenrollamiento de la doble hebra de DNA

3 Problema 5 Los gráficos de desnaturalización térmica que se muestran debajo corresponden a experimentos realizados a partir de un mismo ácido nucleico (ADN de doble cadena), pero en diferentes 1.4 condiciones de concentración de Na + (NaCl 0.01M; 0.1M y 4 M). Cuál es la curva que corresponde a la 1.3 mayor concentración de Na +? Por qué? A 260 relativa Temperatura (º C) Problema 6 En la aplicación de la metodología de Sanger para secuenciar un fragmento de 300 bp de Pasteurella multocida se cometió un error en la concentración de ddgtp utilizado. La concentración fue 100 µm en lugar de 1 µm. La autorradiografía resultante mostraría: a) mayor espacio entre las bandas b) menor espacio entre las bandas c) una gran zona blanca en la parte inferior. d) menor cantidad de bandas de la reacción con ddgtp e) mayor cantidad de bandas de la reacción con ddgtp Problema 7 Como parte de un estudio de la actividad de las enzimas de restricción Pha I y Sfa NI, ambas provenientes de Pasteurella haemolytica, se obtuvo la secuencia parcial de regiones de DNA que comprenden los respectivos sitios de corte. La secuencia reconocida por Pha I es 5' GATGC 3' y la reconocida por Sfa NI, 5' GCATC 3'. En la Fig. 2 a y b se muestra el resultado de las mencionadas reacciones de secuenciación. a) Explique brevemente cómo se llevan a cabo dichas reacciones y describa cómo se realiza la electroforesis. b) Obtenga las secuencias a partir de los resultados mostrados y ubique los sitios de restricción para estas dos enzimas.

4 4 Figura 2 Problema 8 Para estudiar la replicación del DNA cromosomal en Escherichia coli se creció un cultivo en un medio que contenía: 49 mm Na 2 HPO 4, 22 mm KH 2 PO 4, 50 mm NaCl, 10 mm glucosa, 1mM MgSO4 y 0,003 mm FeCl 3, al cual se le añadió, como fuente de nitrógeno, 100 mg por litro de 15 NH 4 Cl. Al cabo de 14 horas de crecimiento con agitación a 37ºC (suficiente como para que transcurran 14 generaciones), se agregó al medio 1 g por litro de 14 NH4Cl, y se dejó crecer durante otras 4 a 8 horas. A lo largo de todo este proceso se siguió el crecimiento mediante recuentos de células viables y recuentos al microscopio (Figura 2.1). Como controles, dos cultivos crecieron en las mismas condiciones, pero con 15 NH 4 Cl durante todo el proceso o con 14 NH 4 Cl durante todo el proceso. Estos controles fueron cosechados por centrifugación, lisados con SDS, mezclados y sometidos a una centrifugación de densidad en CsCl, en una ultracentrífuga analítica durante 20 horas a x g. Al cabo de la centrifugación, se fotografió la distribución del material en el tubo de centrífuga (Figura 2.2 izq: el tope del tubo se encuentra a la izquierda y el fondo a la derecha), y la cantidad de material observado se cuantificó por densitometría (Figura 2.2 der). Alícuotas apropiadas de los cultivos de la figura 2.1 se fueron tomando a tiempos equivalentes a 0; 0,3; 0,7; 1,0; 1,1; 1,5; 1,9; 2,3; 3,0 y 4,1 generaciones transcurridas después del agregado de 14 NH 4 Cl. Las muestras se introdujeron inmediatamente en baños de agua-hielo, se centrifugaron en frío a g, 5 minutos, se resuspendieron en una solución 10 mm NaCl y 10 mm EDTA a ph=6,0, se lisaron con SDS y se sometieron a centrifugación con CsCl en las mismas condiciones que los controles de la Figura 2.2. También, al cabo de la corrida los tubos fueron fotografiados y el material que contenían, cuantificado por densitometría (Figura 2.3). Finalmente, se tomó al DNA purificado de cada uno de los controles de la Figura 2.2 y al correspondiente a 1 generación después del agregado de 14 NH 4 Cl, se los calentó a 100ºC 30 minutos, se los enfrió bruscamente y se los centrifugó en CsCl igual que antes. Los resultados obtenidos por densitometría se muestran en la Figura 2.4 (B: DNA de 1 generación después del agregado de 14 NH 4 Cl, C: pico de la izquierda, DNA del control crecido en 14 NH 4 Cl, pico de la derecha, DNA del control crecido en 15 NH 4 Cl).

5 5 Figura 2.2 Figura 2.1 Figura 2.4 Figura 2.3 a) Explique cuál es el principio de separación del DNA empleado en estos experimentos, especificando los fenómenos físicos y/o químicos que tienen lugar y sobre los cuales se basan estos métodos. b) Discuta los resultados mostrados en las Figuras 2.1 a 2.4, y proponga en base a ellos un modelo para la replicación del DNA en E. coli.

6 Problema 9 En la Figura 5.1 se muestra un apilamiento de secuencias correspondientes a una región del gen que codifica el factor de transcripción rpos en los siguientes microorganismos: 1) Salmonella typhimurim, 2) Shigella flexneri, 3) Erwinia carotovora, 4) Yersinia enterocolitica, 5) Serratia entomophila, 6) Pseudomonas aeruginosa, 7) P. fluorescens. a) Planifique al menos un juego de primers como para amplificar por PCR un fragmento del gen correspondiente en Escherichia coli. Para planificar los primers, tenga en cuenta: *Deben ser oligonucleótidos no menores de 20 pb. *Deben comprender un segmento de al menos 200 pb. *Deben ser específicos de un solo sitio. *No deben formar estructuras secundarias internas. *Es deseable que tengan un alto contenido de G/C, sobre todo hacia el extremo 3' b) Explique a qué se deben las recomendaciones de a). c) Escriba la secuencia de los primers, en el sentido 5' 3'. d) Usando la secuencia del gen rpos de E. coli que se muestra en la Fig. 5.2, señale los sitios que serían reconocidos por los primers y dibuje el resultado que obtendría si después de la reacción de PCR Ud. corriera sus productos en una electroforesis en gel de agarosa. Suponga que como marcadores de peso molecular, Ud. cuenta con el fago λ cortado con Hind III (fragmentos: , 9.416, 6557, 4.361, 2322, 2027, 564 y 125 pb) AGAGCT--GTTATCGCAAGGGGCCACACA GCGTGTGTTGGAC ----GGAACT--GTTATCGCAGGGAGCCACACA GCTTGTGTTGGAC ----CGAGCT--GTTATCGCAAGGGGTCCCACA GCGTGTCCTTGAC ----AGAGCT--GTTGTCTCAAGGCGTTACCCA ACGTGTATTGGAT ----TGAGCT--GTTGGCGCAAGGTGTTAC-CA GCG-GTGCT-GAT TCCAAAAGCTCCGCTTCATTAAAGCAACACAAATACATTGATTACACGCGTGCACTCGAT GCCACCACTTCCTTCTCTTCCAAACAACACAAGCACATCGACTACACGCGCGCGTTGGAC * * * * * * ** GCGACTCAGCTTTACCTTGGTGAGATTGGGTATTCACCACTGTTAACAGCCGAAGAAGAA GCGACTCAGCTTTACCTTGGTAAGATTGGTTATTCACCACTGTTAACGGCCGAAGAAGAA GCAACACAGCTCTATTTAGGAGAGATCGGCTATTCGCCGCTTTTAACCGCAGAAGAAGAA GCGACGCAGCTCTATCTGGGTGAGATCGGTTATTCGCCTCTGCTTACCGCAGAGGAAGAG GCGACACAGCTCTATCTTGGTGAGATTGGTTATTCGCCGTTGTTGACCGCAGAAGAAGAG GCGACGCAGCTGTACCTCAATGAAATCGGCTTTTCTCCATTGCTCTCCCCCGAAGAGGAA GCAACGCAGCTGTATCTCAACGAAATCGGTTTCTCGCCCCTGTTGACGCCCGAAGAGGAA ** ** ***** ** * * ** ** * ** ** * * * * ** ** ** GTCTATTTTGCGCGTCGCGACCTGCGTGGAGATGTCGCTTCTCGCCGTCGCATGATTGAG GTTTATTTTGCGCGTCGCGCACTGCGTGGAGATGTCGCCTCTCGCCGCCGGATGATCGAG GTCTATTTTGCCCGACGCGCGTTGCGTGGCGATGTCCCATCGCGCCGCCGGATGATCGAG GTCTATTTTGCGCGGCGTGCTCTGCGCGGTGACGTGCCGTCCCGCCGCCGCATGATCGAA GTTTATTTTGCCCGGCGTGCATTGCGCGGAGATGTGCCTTCACGTCGGCGTATGATCGAA GTGCACTTTGCGCGGTTGTCGCAAAGTGGTGATCCGGCCGGGCGCAAGCGCATGATTGAA GTCCACTTCGCTCGTCTGGCGCAGAAGGGCGATCCCGCTGGTCGGAAGCGGATGATCGAG ** * ** ** ** ** ** * ** ** ***** ** AGTAACCTGCGTCTGGTGGTAAAAATTGCCCGCCGTTATGGCAATCGTGGACTGGCGTTG AGTAACTTGCGTCTGGTGGTAAAAATTGCCCGCCGTTATGGCAATCGTGGTCTCGCGTTG AGTAACCTGCGGTTGGTGGTGAAAATTGCCCGCCGTTACAACAATCGTGGTCTGGCGCTG AGCAACCTGCGGCTGGTGGTGAAAATCGCCCGCCGCTATAGCAATCGCGGCCTGGCGCTG AGTAACTTGCGGTTGGTAGTGAAGATTGCTCGCCGTTACAGTAATCGCGGTTTAGCGCTG AGCAACTTGCGGCTGGTGGTGAAAATCGCCCGGCGCTATGTCAATCGTGGCCTGTCGCTG AGCAACCTGCGGTTGGTGGTGAAGATCGCCCGGCGCTATGTCAATCGCGGACTGTCCCTG ** *** **** **** ** ** ** ** ** ** ** ***** ** * * ** CTGGACCTGATTGAAGAGGGCAACCTGGGGCTTATCCGTGCAGTAGAGAAGTTTGACCCG CTGGACCTTATCGAAGAGGGCAACCTGGGGCTGATCCGCGCGGTAGAGAAGTTCGACCCG CTGGACCTGATTGAAGAGGGGAACCTCGGCCTGATCCGTGCGGTTGAAAAATTCGATCCA CTGGATCTGATTGAGGAGGGCAACCTCGGCCTGATCCGCGCGGTGGAAAAGTTTGACCCA CTGGATTTGATTGAAGAGGGTAACCTCGGTCTTATCCGTGCAGTGGAAAAGTTTGACCCA CTGGACCTGATCGAAGAGGGCAACCTCGGGCTGATCCGAGCGGTGGAGAAGTTCGATCCG CTCGACCTGATCGAGGAAGGCAACCTAGGCCTGATCCGCGCCGTGGAGAAGTTCGATCCG ** ** * ** ** ** ** ***** ** ** ***** ** ** ** ** ** ** **

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