Mapeo genético de enfermedades complejas

Transcripción

1 Mapeo genético de enfermedades complejas 2º Seminario Análisis Genético 3º Grado en Biología Polimorfismos de un sólo nucleótido: SNPs (del inglés Single Nucleotide Polymorphisms) Sitios del genoma donde existen al menos dos bases alternativas (A, G, C, T) SNP bialélico TT TG GG Es el tipo más común de variación en el genoma (aprox. 40 millones) media de 1 cada pb Inserciones/deleciones bialélicas de cualquier índole (n bases) = SNPs STRs Frecuencia del alelo raro (MAF) = 1 freq. alelo común (en bialélicos) 1

2 SNPs, eventos únicos evento de mutación t n generaciones Frecuencia actual Repeticiones cortas en tándem o microsatélites (STRs, del inglés Short Tandem Repeats) Secuencias cortas de 2 5 bp/ Menos frecuentes en el genoma (unos 30K) Más variables que los SNPs (multialélicos); diversidad número de repeticiones (AATG) n 7 repeticiones 8 repeticiones Heterocigoto: 7/8 (los alelos pueden distinguirse por el tamaño del fragmento amplificado) Homocigoto: 8/8; 7/7;.. (ambos alelos son de la misma longitud).3 alelos = 6 genotipos.4 alelos = 10 genotipos CRx,2 = X+2 1 (x+2 1)! = 2 2!(x 1)! X = número de alelos 2

3 Los conceptos Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como unidad básica para el mapeo de enfermedades comunes Estructuración de caracteres en las poblaciones humanas Haplotipos, desequilibrio de ligamiento y recombinación Estrategias de mapeo génico en enfermedades mendelianas y complejas Asociando nuestro genoma al completo: tagging SNPs, el proyecto HapMap y genotipado masivo Estructuración de caracteres en poblaciones 3

4 Estructuración poblacional de la variación génica La variación génica está estructurada en nuestras poblaciones: 377 STRs en 52 poblaciones humanas 4 5 grupos de población (continentes) Oceania Africa Europe Middle East Central Asia East Asia America SNPs en poblaciones europeas: asignación de individuos a aprox. 700 km del origen Combinaciones alélicas: haplotipos 2 7 = 128 posibilidades 5 observadas! Haplotipos Existe redundancia en la región Se dice que los 3 SNPs están asociados (en desequilibrio de ligamiento) 4

5 Al genotipar: SNP 1 CT / SNP 2 AG... Estimación de haplotipos SNP 1? SNP 2 C : 50% A : 50% Materno SNP 1 SNP 2 C A T : 50% G : 50% Paterno T G Extra info. Posibilidades SNP 1 SNP 2 Esperado Observado C A 0.5 X 0.5 = C G 0.5 X 0.5 = T A 0.5 X 0.5 = T G 0.5 X 0.5 = Desequilibrio de ligamiento (LD) como medida de asociación entre SNPs Genotipo de SNP1 predice el genotipo del SNP2 En una región ejemplo: Reordenando los SNPs por parecido del patrón 5

6 Estimación de haplotipos Reconstrucción estadística (normalmente) asociada aincertidumbre Diversos métodos: Problema es exclusivo de dobles heterocigóticos, así que se aprende de las combinaciones que aparecen en el resto de individuos (observaciones) Minimizar el número de haplotipos nuevos buscando minimizar el número de mutaciones y las recombinaciones en la genealogía Cromosoma ancestral LD: Generación por mutación 6

7 LD: Reducción por recombinación Cromosoma ancestral Recombinación y distancia Recombinación/n generaciones El desequilibrio de ligamiento generalmente decrecerá con la distancia parcialmente debido a procesos de recombinación. 7

8 Modelo simple de la estructura del LD Los patrones se simplifican si no se modela con recombinación (p.ej. región pequeña) - Mutación como único factor - Sin recombinación, las correlaciones entre SNPs están determinadas por la genealogía, no por la distancia física Medidas de LD (entre 2 loci) D de Lewontin 0 D' 1 D' = 0 LE D' = 1 no indica LD perfecto (en una tabla de 2x2, si una de las combinaciones es 0, D =1) B (f B ) b (f b ) AB (f A f B ) Ab (f A f b ) DA,B = f A,B -f A f B =-D ab =-D Ab = D ab a (f a ) ab (f a f B ) ab (f a f b ) D ' AB if ( D 0) min( f A DAB f, f b a DAB else f,) min( f f, f B a b A f,) B Coeficiente de correlación (r 2 ) 2 2 DAB 2 rab AB f f f f A a B b 0 r 2 ( D ) 2 1 r 2 = 0 LE r 2 = 1 indica LD perfecto 8

9 Desequilibrio de ligamiento (LD) PTPLB MYLK CCDC14 ROPN1 100 kb r Distance (kb) Enfermedades simples y complejas Simples Un solo gen causante de la enfermedad De herencia mendeliana (con relaciones matemáticas consistentes y simples; tipo de herencia fácilmente reconocible) Normalmente raras (prevalencia de fibrosis quística es de 1 en 2.500) Ejemplo: Fibrosis quística (transporte de Cl defectuoso en epitelios) por mutaciones en el gen CFTR Complejas Múltiples genes causan la enfermedad Interacción gen ambiente: enfermedad complejas Comunes (prevalencias de >1%) Ejemplos: Poligénica Retinitis pigmentosa (degeneración progresiva de la retina), con al menos 28 genes causantes. Compleja Cáncer de mama por mutaciones en los genes BRCA1, BRCA2, otros 9

10 Grados de penetrancia Variantes con alta penetrancia (>70%) mutaciones de baja frecuencia en la población (de reciente aparición y por tanto en alto LD con el entorno): Mutaciones en el gen APC y poliposis familiar adenomatosa (1%) Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 y cáncer de mama (5%) Mutaciones en CFTR y ausencia bilateral congénita de vasos deferentes Variantes con baja penetrancia (<25%) variantes de susceptibilidad de mayores frecuencias en la población: Variantes nulas en los genes GSTT1 y GSTM1 y cáncer de pulmón o vejiga. Variante 4 en el gen APOE y Alzheimer Variantes de NAT2 y cáncer colorrectal Metodologías de mapeo Ligamiento: Asociación: P r E P r E Pedigrí conocido Pocas meiosis (max 100s) Resolución: cmorgans (Mbases) Pedigrí desconocido Gran número de meiosis (>10 4 ) Resolución: 10 5 Morgans (Kbases) 10

11 Fundamento de la asociación Estudios de asociación Asociación no es más que una relación estadística entre la variación en unovarios sitios del genoma y la variación fenotípica (presencia ausencia de enfermedad, niveles de un carácter relacionado ) Comúnmente mediante el análisis de las diferencias en frecuencias o la transmisión de alelos en casos control/trios (afecto padre madre) GA AA AA AA AA GA GG GA AA casos GA GA GG GG GG GA AA GA AA control G/A A/A G/A 11

12 Análisis de ligamiento Estudio de marcadores genéticos Ventajas: Se estudia todo el genoma; se identifican genes previamente no relacionados con la enfermedad Limitaciones: Poca resolución; regiones normalmente extensas Detección de genes con efectos considerables Regiones candidatas Mapeo de enfermedades complejas: Alternativas al análisis de ligamiento? Nótese que los análisis de ligamiento nacen en el contexto del mapeo de enfermedades de herencia mendeliana Su aplicación a enfermedades complejas origina, cuanto menos, ligamientos discutibles. Como resultado el nº de genes y su efecto no puede estudiarse con certeza en enfermedades complejas con ligamiento Varios cientos, si no miles, de variantes raras serían necesarias para explicar la susceptibilidad incluso si estas aumentaran el riesgo veces 12

13 Formulación de CDCV Agrupamiento familiar + resultados de ligamiento Un modelo en el que cientos de variantes comunes, cada una incrementado el riesgo en un factor modesto de veces, sería suficiente para explicar la prevalencia y herencia de muchas de estas enfermedades (importancia de las interacciones). Variante común enfermedad común (CDCV): Variantes comunes en las distintas poblaciones con efectos leves en la enfermedad, en contraposición a variantes raras (mutaciones), explicarían una proporción de la enfermedad Los estudios de asociación son la ÚNICA alternativa Risch & Merikangas. Science 1996 Ligamiento vs Asociación 13

14 Estudios de asociación Optimo para: enfermedad genética compleja, con herencia multifactorial. Análisis de las diferencias en frecuencias o la transmisión de alelos en casoscontrol o núcleos familiares Necesario: Pedigrí desconocido: muchas más meiosis representadas en la población Muestras de individuos con y sin enfermedad (bien caracterizados), no relacionados o núcleos familiares padre madre hijo afecto Marcadores polimórficos (sin necesidad de alto grado de variación) Patrones de LD Estudios de asociación caso control Co-ocurrencia de alelos y enfermedad: el alelo de riesgo será más frecuente en individuos enfermos (casos) que en individuos sin enfermedad (controles) Necesario: - Genotipo en casos y controles sin relación familiar Mide: - Asociación no azarosa de alelos de un locus dado - Significación mediante aplicación de modelos de herencia sobre tablas de contingencia (g.l. dependiendo del modelo) 2 = (observados-esperados) 2 esperados Desventajas: - Aunque técnicamente fácil, necesita de distintos ajustes para asegurar resultados no sesgados - Influenciados por la presencia de estratificación poblacional 14

15 Estimación de efectos Razón de ventaja (OR): surge del estimador clásico de epidemiología del riesgo de la enfermedad (no sesgado si la muestra es representativa de la población- estudios cohorte de seguimiento o prospectivos): tasa de incidencia de la enfermedad en expuestos (genotipo riesgo) con respecto a la incidencia en los no expuestos (genotipo de referencia) Exposición definida antes de la enfermedad Genotipo/alelo Muestra Enfermos No enfermos Riesgo EnR SaR Ref. Enr Sar Estimación de efectos Asociación genética Genotipo/alelo Muestra Casos Controles Riesgo CaR CoR Ref. Car Cor OR = CaR CoR Car Cor = CaR.Cor Car.CoR 15

16 Estimación de efectos Si no existen sesgos (si el estudio de caso-control cohorte), el OR proporciona una estima valida del RR OR = 1, las personas expuestas no tienen riesgo aumentado en comparación con no expuestos OR > 1, aumento del riesgo con la exposición (factor de riesgo) 0 < OR < 1, disminuye el riesgo con la exposición (factor protector) Error estándar (s) = 1/CaR 1/CoR 1/Car 1/Cor Intervalo de confianza al 95% del OR con los valores reales [e log(or)-1,96s ; e log(or)+1,96s ] [si no incluye 1 entonces la asociación es estadísticamente significativa] (Significación la obtenemos de los totales mediante 2 ) Estudios de asociación Aprox. 40 millones de variantes en nuestro genoma (10 comunes con frecuencia >5%) Como media hay unos 126 SNPs/gen (datos de SeattleSNPs) El estudio de TODAS las variantes de nuestro genoma en asociación es impracticable en la actualidad Podemos reducir la lista de variantes sin pérdida de poder estadístico? SNPs de regiones codificantes (cambios de amino ácido) Mediante desequilibrio de ligamiento y análisis de haplotipos Genes candidatos con funciones biológicas relevantes en la enfermedad o todo el genoma? 16

17 Propiedades del genoma: Proyecto HapMap Fase I (Nature 2005, 437: ) análisis 1 millón de SNPs (1,3 genotipados) 1 SNP/ 5 Kbases del genoma (87% con MAF 5%) Fase II (Nature 2007, 449: ) análisis 2,1 millón de SNPs (1/4-1/3 de los SNPs con MAF>5% del genoma) 1 SNP/Kbase del genoma 1.Haplotipos compartidos entre poblaciones (identidad, no frecuencia) 2.LD correlacionado (aunque no completamente) con la distancia física 3.La variación de la tasa local de recombinación es el principal factor de influencia en el LD 4.La mayoría de la recombinación ocurre en puntos calientes, el genoma se estructura en bloques de LD 5.Normalmente un SNP está altamente correlacionado con muchos otros (perfectamente con cercanos y parcialmente con otros) (en menor medida en africanos); Con r 2 > 0,8 YRI 50%, en CHB+JPT y CEU 75% (Fase I) Bloques de LD en el genoma Regiones de tamaño variable donde se observa poca diversidad de haplotipos (el nivel de LD entre los SNPs de la región es alto) Gabriel et al. (Science 2002, 296: ): El 50% del genoma en africanos se presenta en bloques de 22 Kbases yde 44 Kbases en europeos y asiáticos En cada bloque, un número reducido de haplotipos comunes captura 90% de la diversidad del bloque Límites de bloques y haplotipos se conservan entre poblaciones 17

18 Tagging SNPs Objetivo: Utilizar la redundancia del genoma para reducir costes sin perdida considerable de poder de detección. Una fracción pequeña de SNPs captura una gran fracción de la variación. Una proporción de SNPs no tiene correlación con otros SNPs (1% de SNPs comunes en fase II del HapMap; 90% cerca de puntos calientes de recombinación) La reducción de SNPs necesarios pude llegar a ser de hasta un 80% Genotipado masivo Chips de ADN para la detección de variantes (de 10k a 1000K) PM MM PM MM 18

19 Asociación del genoma completo Casos: Controles Ensayo de SNPs Asociación: Identificación de la vía de actuación Ventajas: Identificación del gen que origina la señal Nuevos genes/vías implicadas Detecta efectos leves Acotación de la región de interés Asociaciones del genoma completo Más de 190 estudios y 410 SNPs asociados con enfermedades y caracteres complejos 19

20 Beneficios potenciales de la identificación de los genes que subyacen a la enfermedad 1. Nuevas perspectivas de la patogénesis de la enfermedad 2. Genes como dianas terapéuticas 3. La caracterización del riesgo a la enfermedad o la respuesta a la intervención relacionada con la variabilidad genética mejoraría la diagnosis y la prognosis (medicina personalizada). 4. Conocer estos genes mejorará nuestra habilidad para identificar y caracterizar nuevos genes de susceptibilidad, otros factores de riesgo, interacciones gengen, e interacciones de los genes con el ambiente. 20