Tema 13 Genética de hongos filamentosos: Neurospora crassa

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1 Tema 13 Genética de hongos filamentosos: Neurospora crassa

2 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

3 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

4 Neurospora en la naturaleza

5

6 Neurospora crece sobre troncos que han sido quemados

7

8 Primera descripción de Neurospora como el hongo que causó la contaminación de panaderías francesas en 1843

9 Shear CL y Dodge BO (1927) Life stories and heterotallism of the red bread mold fungi of the Monilia sitophila group. J. Agric. Res. 34: Describió las estructuras sexuales y la segregación del tipo sexual en varias especies de Neurospora. Bernard O. Dodge ( )

10 Ciclos de vida de Neurospora crassa

11 Especies de Neurospora Heterotálicas N. crassa N. discreta N. intermedia N. sitophila Pseudohomotálica N. tetrasperma Homotálicas N. africana N. dodgei N. galapagosensis N. lineolata N. terricola N. pannonica

12 Ciclo sexual de una especie heterotálica

13 Ciclo sexual de una especie homotálica

14 Ciclo sexual de una especie pseudohomotálica

15 Ciclo vegetativo de Neurospora crassa germinación conidios micelio conidióforos

16 Hifas de Neurospora

17 Conidiación de Neurospora crassa

18 Conidios de Neurospora crassa

19 Macroconidios y microconidios de Neurospora

20 Un reloj circadiano regula la conidiación

21 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

22 Cultivos de Neurospora crassa

23 Cultivos de Neurospora crassa

24 Medio con sorbosa

25 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

26 Mutagénesis Agentes mutagénicos usados en Neurospora Radiaciones Ultravioleta Rayos X Agentes químicos Ácido nitroso Metanosulfonato de etilo (EMS) Metilhidroxiamina ICR170 Nitrosoguanidina

27 medio completo Búsqueda de mutantes auxótrofos medio mínimo medio con grupos de nutrientes medio con distintos aminoácidos el medio con arginina permite el crecimiento

28 Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1958 George W. Beadle ( ) Edward L. Tatum ( ) El aislamiento y la caracterización mutantes auxótrofos de Neurospora les permitió formular la hipótesis de que un gen era responsable de una enzima.

29 Enriquecimiento por filtración Los protótrofos se quedan en el filtro Medio mínimo Silvestres protótrofos Mutantes nutricionales (auxótrofos) Sembrar Los auxótrofos pasan a través del filtro Los auxótrofos crecen Medio con leucina

30 Ruta de la carotenogénesis de Neurospora

31 Medio con sorbosa Mutante albino

32 Mutantes de la carotenogénesis de Neurospora Naranja (silvestre) Albino Amarillento Rojizo

33 Mutantes morfológicos de Neurospora

34 0.5 Frecuencia de los conidios Núcleos por conidio

35 Heterocariosis Los heterocariontes nos dan información sobre los mutantes: Permite saber si las mutaciones son dominantes of recesivas Permite identificar grupos de complementación

36 El micelio de Neurospora es un cenocito

37 Complementación en Neurospora Células arg-1 alteradas en una enzima de la ruta de síntesis de arginina Células arg-2 alteradas en una enzima distinta de la ruta de síntesis de arginina Fusión El heterocarionte crece sin arginina

38

39 Grupos de complementación: grupo I II III IV V mutantes 1, 5 2, 4, 6, 7 3 8, o + o + + o + o + o o o + o + o + o + o + o + o o o o o o

40 Ciclo sexual de Neurospora

41 Ciclo sexual de Neurospora Niveles bajos de C y N Peritecio Formación de protoperitecios

42 Ciclo sexual de Neurospora Meiosis

43 Ascosporas

44

45

46 Las octadas ordenadas permiten detectar el ligamiento al centrómero

47 El reparto de los cromosomas en la octada permite observar varios patrones de segregación

48 Productos de la meiosis en Neurospora Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto de un cruzamiento entre dos mutantes de la coloración de la ascospora. Se observa la segregación en la primera y segunda división meiótica.

49 Durante la recombinación se producen moléculas de ADN heterodúplices

50 Detección de la conversión génica

51 Estimación de la distancia genética por recombinación

52

53

54 cyhr: resistente a cicloheximida hom: auxórofo de homoserina nic: auxórofo de nicotóico al: albino cyhr al hom nic cyhr al hom nic silvestre cyhr al hom nic parentales cyhr al hom nic cyhr al hom nic rec en 1 rec en cyhr al hom nic rec en cyhr + hom nic + al + + rec en 1 y cyhr + + nic + al hom + rec en 1 y cyhr al + nic + + hom + rec en 2 y 3 3 5

55 Estimación de la distancia genética por recombinación cyhr al hom nic % 4.5 % 15.2 % cyhr al hom nic

56 Grupo de ligamiento I Existen unos 1000 marcadores genéticos localizados en siete grupos de ligamiento

57 Detección de mutaciones en el ADN mitocondrial

58 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

59 Ingeniería genética en Neurospora Introducción de ADN: Transformación de esferoplastos Electroporación de conidios Plásmidos integrativos Resistencia a benomilo e higromicina Otras herramientas: Promotores regulables: qa-2 Fusiones con lacz, GFP y luciferasa para medir transcripción y detectar proteínas. Inactivación génica.

60 Integración del ADN en hongos Vector Receptor de la transformación Cromosoma I Cromosoma II Reemplazamiento génico Duplicación Integración ectópica Vector

61 Receptor vector Integración ectópica Integración ectópica múltiple Integración homóloga Reemplazamiento

62 Transformación en Neurospora La competencia es una propiedad del núcleo (co-transformación). Cuando ocurre integración homóloga no suele ocurrir integración ectópica en el mismo núcleo. El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinación homóloga (si es posible). 10% de transformantes ectópicos han sufrido alteraciones cromosómicas con frecuencia. 100% de transformantes por recombinación homóloga en estirpes con una mutación en el gen mus-51 o mus-52 responsables de la recombinación no homóloga.

63 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

64 Cósmidos para construir genotecas en Neurospora

65 Clonación en Neurospora por selección de grupos (sib selection)

66 Núcleos de Neurospora marcados con H1-GFP

67 Microtúbulos de Neurospora marcados con tubulina-gfp

68 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

69 Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora

70 El genoma de Neurospora Tamaño: 42 Mb Genoma secuenciado: bp (rel. 7) Cromosoma I II III IV V VI VII Tamaño (Mb)

71 Contenido G+C Total: 50% ADN codificante: 44% ADN no codificante: 56% Intrones Presentes en el 80% de los genes Longitud promedio: 134 pb Promedio de 1,7 intrones por gen Un transposón activo, Tad, muchas copias de transposones inactivos (RIP),

72 Tamaño (Mb) Genes Haemophilus Saccharomyces C. elegans Drosophila Homo 1, Neurospora 42?

73 Fin

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