Uso de Biomarcadores en la terapia personalizada para cáncer de pulmón.

Transcripción

1 Dónde estamos y hacia dónde vamos? Uso de Biomarcadores en la terapia personalizada para cáncer de pulmón. Graciela Cruz Rico Biología Molecular y Clínica del Cáncer.

2 Cáncer de Pulmón de Células no Pequeñas Pre-Tratamiento Post-Tratamiento Post-Tratamiento Esto explica porque Enfermedad solo el Residual. 15% de todos los pacientes vive más allá de Resistencia los 5 años al desde tratamiento. el diagnóstico. Recaída de la enfermedad. Louis Vermeulen. Lancet Oncol 2012; 13: e83 89.

3 Múltiples vías: Patogénesis de Cáncer pulmón. Heterogeneidad de las células??? cancerosas. CMC Perfiles oncogénicos CIC CIC: Células Iniciadoras de cáncer. CMC: Células Progenitoras/maduras de cáncer. El 60% de los tumores con CPCNP generan mutaciones en diferentes oncogenes. Kris MG. The Lung Cancer Mutation Consortium. Presented at: 12th Annual Targeted Therapies in Lung Cancer; February 2012; Santa Monica, CA. Células STEM-Normal. Adaptado de: James P. Sullivan. Cancer Metastasis Rev. 2010

4 Genes en Cáncer de Pulmón. Heterogeneidad de las células cancerosas. Claras diferencias del estado mutacional entre el tumor primario y las metástasis. Expansión clona maligna Diversificación clona maligna Las características pueden cambiar con el tiempo.. Tumor primario Clonas iniciadoras de metastasis La mayor parte del tumor, tiene diferentes subpoblaciones, las características celulares es sustancial para el descubrimiento de biomarcadores y para el desarrollo de fármacos. Nardin Samuel. Clinical Chemistry 59: (2013) Graves M, et. Al. Nature 2012; 481 (7381):

5 Cáncer de Pulmón de Células no Pequeñas Mas allá de la Histología..Caracterización Molecular Sub-tipificación basada en Histología Adenocarcinoma Cáncer de células escamosas TTF-1 y Napsin- A Adenocarcinoma p63 y CK 5/6 Células escamosas. Tianhong Li. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY.February 21, 2013

6 Cáncer de Pulmón de Células no Pequeñas nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa Translocación catenina en el núcleo Unión del factor de transcripción Gli, y activación de ciclina D y Myc Factor de células T /factor activador cambios en el citoesqueleto y Aumento en la migración.

7 Cáncer de Pulmón de Células no Pequeñas Hubaux et al. Environmental Health 2012, 11:89 Hubaux et al. Molecular Cancer 2013, 12:20 Activación a través de grupos sulfhídrico. Arsénico activa STAT través de JNK Induce estrés oxidativo. Inducción del crecimiento celular / diferenciación / supervivencia Crecimiento celular y diferenciación

8 Cáncer de Pulmón. Fumadores Central Bronquio Cáncer de pulmón de células pequeñas. Carcinoma de células escamosas. pérdida de heterocigosidad (3p,6p,9p, 17p..) Fumador No Fumador Fumar a través del filtro Bronquiolo AD con aberraciones desconocidas. Cambios epigenéticas KRAS-mutaciones.?? Factores Genéticos? Hormonales? Factores ambientales? Enfermedad pulmonar? *Neumonía y Tuberculosis Unidad respiratoria terminal. Periférico Existe una susceptibilidad en su proliferación y la supervivencia, es decir, '' adicción'' oncogén. Kenichi Suda. Int J Clin Oncol. 2011

9 589 pacientes Ensayo-multiplex PCR/FISH Massachusetts General Hospital EGFR, ALK y ROS1 son más comunes en los no fumadores No se puede suponer que las mutaciones están presentes en estos subgrupos, es necesario KRAS EGFR ALK PIK3CA BRAF NRAS ROS1 DESCONOCIDO 5.0% 27.3% 14.0% Fumador (415). No Fumador (128). L. V. Sequist, Annals of Oncology 22: , Dic 2011 Kristin Bergethon, J Clin Oncol 30:

10 Biomarcadores moleculares para orientar las decisiones terapéuticas Era de las OMICAS Genómica- Genes, ADN= Puede hacer (Potencial). Transcriptómica- Transcritos, ARN= Planea hacer (Estrategia). Proteómica- Enzimas Proteínas= Esta haciendo (Trabajo) Metabolómica. Esta produciendo (Resultado) + Clínica para poder definir un fenotipo que nos de el perfil molecular de un proceso biológico.

11 Biomarcadores moleculares para orientar las decisiones terapéuticas Debe evaluarse el contenido de células tumorales antes del análisis molecular. Espécimen archivado de buen tamaño y la calidad. Formol al 10% (ph 7,2) durante 6 a 24 hrs. Se requieren métodos cuidadosos de predicción con la validación y replicación y la evaluación de la rentabilidad. Min Yu. The Journal of cell Biology. 2011

12 Heterogeneidad de acuerdo a los oncogenes Genes en Cáncer de Pulmón. Las disparidades raciales. Heterogeneidad de pacientes con EGFR. Heterogeneidad en mecanismos de resistencia. Tetsuya Mitsudomi. NATURE REVIEWS CLINICAL ONCOLOGY Dacic S. J Clin Pathol 2013;0:1 5

13 La promesa del genotipo- Terapia Dirigida. Oncogen Mutación Prevalente Predictor-Respuesta Respuesta terapéutica EGFR Asiática: 30-40% Blancos: 10-20% KRAS Asiática: 10% Blancos: 30% Sensible a TKIs-EGFR (Del. Exón 19, L858R, L861Q). Resistente T790M, Ins exón 20. Resistente a TKIs. Sensible a inhibidor de MEK? Selutinib Erlotinib: 60-83% Gefitinib: aprox. 70% Datos limitados. EML4-ALK 1%-13%; no son claras las diferencias raciales Sensible a Inhibidor ALK; resistentes a TKIs.EGFR Crizotinib: 50-60%; datos limitados con respecto a resistencia a TKI-EGFR ROS1 1.7%; mas en Asiáticas? Sensible a inhibidor-alk Crizotinib: Descononocido. HER2 Mas en Asíaticas? Sensible a inhibidor de HER2 Trastuzumab: se desconoce resp a Lapatinib, Afatinib, Dacotinib. Tianhong Li. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY.Feb; 21, 2013 Giulio Metro. Future Oncol Feb;9(2):167-77

14 La promesa del genotipo- Terapia Dirigida. Oncogen Prevalencia (%) Asociación clínica reportada BRAF Mutaciones Fumadores Raza Blanca V600E: No fumadores PIK3CA Mutaciones No se ha visto asociación. RET reordenamiento No Fumadores Raza Asiática Inhibidor -cinasa Vemurafenib GSK GDC-0941 XL147 BKM120 Vandetanib Sorafenib Sunitinib Cabozantinib (XL184) Terapia dirigida (Diferenciación, Inmu noterapia). Eliminación de CIC???. Baja capacidad de autorenovación. Enfermedad clínica aparentemente. Geoffrey R. Journal of Clinical Oncology. Vol. 31. Núm Brian J. Morrison. Targ Oncol 2013

15 La célula se vuelve dependiente, o "adicto" a, la señalización de la proteína transcrita, a menudo un receptor TK. Cáncer de Pulmón: Genes clave hay varios Visión simplificada Douglas Hanahan, Cell, Vol. 100, 57 70, 2000 Douglas Hanahan, Cell, Vol. 144, 2011

16 Cáncer de Pulmón: Genes clave hay varios Peter Blume-Jensen & Tony Hunter. Nature; (6835): ,

17 ALK en Cáncer de Pulmón. 2p23 GEN CINASA DE LINFOMA ANAPLASICO Cromosoma 2p23 PROTEÍNA 180 kda SNC, Testículo Super fam. de IR Palmer et al., Biochem J 2009; 420: Drexler et al., Leukemia 2000; 14: Fergal C. Eur J Cancer. 2010

18 2007: Descripción del reordenamiento ALK. Soda and cols. Nature 2007 EML4-ALK detectada en CPCNP. Blanco Molecular.

19 21 variantes EML4- E13;A20 EML4-ALK ALKE10del54E13;A20 2p21 ALK-Exón 20 E20;A20 E20ins18;A2 0 E6;A20 KIF5B-ALK KLC1-ALK TFG-ALK ALK-PTPN3 E6ins33;A20 E6ins18;A20 E14;ins11del49A20 E14;del12A20 E14;del36A20 E17;ins30A20 E17ins61;ins34A20 E17del58ins39;A20 E17ins65;A20 E17ins68;A20 E15del19;del20A20 E18;A20 E2;A20 E2;ins117A20 E3;ins69A20 E6;A19 Cinasa Variante 1 Variante 2 Variante 3a Variante 3b Variante 4 Variante 5a Variante 5b Variante 6 Variante 7 Variante 8a Variante 8b Variante 4 Variante 5 Cancer Genetics and Cytogenetics 203 (2010) Tae Sung Park. J Korean Med Sci (2012) Sai Hongignatius Ou. The Oncologist (2012)

20 Cuáles son las consecuencias? Señales ONCOGENICAS Inamura K et al. J Thorac Oncol 2008

21 ALK- Activación Mecanismos de Resistencia. PI3K/AKT EGFRrecep. KITreceptor SHH/GLT1 ERBB3 lig. Otras vías Activaciónvías señalizació n ALK- fusiones Oncogenicas. ALK. Ganancia Numero Copias. Mecanismos de Resistencia a Inhibidores ALK. Otros Mecanismos Desconocidos. Mutaciones en el dominio TK Aprox. el 13% de los pacientes ALK+, previo al tratamiento presentan un oncogén mutado adicional en la misma muestra, específicamente EGFR, KRAS, BRAF o MET. Di WU. Chin J Lung Cancer, Januar 48 y 2013, Vol.16, No.1 L1196M C1156Y F1174L L1152R S1206Y I117I G1269A 1151Tins G1202R F1174C D1203N Otras mut secundariasdesconoc.

22 Mecanismos Autónomos. Célula Tumoral Células Cáncer Vías de activación Cambios Epigenéticas Cáncer de Pulmón. Alteraciones genéticas EMC Células Estroma BMDCs Células del Estroma Células Endoteliales Matrix Extracelular FIBROBLASTOS Mecanismos No Autónomos. Célula Tumoral Resistencia- Drogas Stephen Paget, (1889): LAS SEMILLAS Y EL SUELO Hongbin Ji. Cancer Sci September 2010 vol. 101 no. 9 Filip Janku, et al. Journal of Thoracic Oncology. 2011

23 ALK: Características Clínicas. (52 años) No fumadores, moderado. Células en anillo de sello, sólido. *p63 positivo-nuclear/ttf-1 Adam S. Crystal. Clinical Advances in Hematology & Oncology *Akihiko Yoshida Am J Surg Pathol Shang-Gin Wu, Journal of Thoracic Oncology. 2012

24 PRUEBAS GENETICAS. Patólogo, Bioquímico Molecular papel IMPORTANTE en el equipo médico. Toma de Muestra. Recibir, Preparar y Procesar. Pruebas moleculares: - Especificar cual mutación se va a probar.

25 Qué muestra necesita el patólogo y el Biólogo molecular? La mejor MUESTRA!... Destacando la urgente necesidad de estandarizar todos los pasos preanalíticos. Calidad en la fijación: (10% de formalina) No, en solución Bouin (descalcificación). Cantidad en % de células tumorales. Tenemos que hacer hincapié en el valor de una muestra adecuada. AnneMcLeer-Florin, J Thorac Oncol -2

26 ELECCIÓN DE TOMA DE MUESTRA El patólogo, debe evaluar el contenido de células tumorales antes del análisis molecular. Idealmente con % de células tumorales. Localización del Tumor Estudio Histopatológico. Estudio Molecular. El tumor primario? El más accesible Tumor metastásico? AnneMcLeer-Florin, J Thorac Oncol -2011

27 Identificación de las alteraciones moleculares de ALK. FISH PCR (qrt-pcr/ mrt-pcr Secuenciación IHC Actualmente, la técnica FISH es utilizado como criterio de entrada para los ensayos crizotinib. Fred R. Hirsch. Clin Cancer Res 2010.

28 Concepto: Técnica Molecular, que permite la detección y localización in situ de secuencias específicas de ÁCIDOS NUCLEICOS mediante el empleo de SONDAS marcadas con FLUOROCROMOS 1981 A C G G T C C T A T T A G A F Unión covalente. F

29 Sondas LOCUS especifico hibrida con el ADN de la región especifica del cromosoma. Detectan alteraciones estructurales. 2p23 3 normal 5 ALK- FISH- Dual Color, Break Apart. inversión con EML4- ALK (70%) Reordenamiento positivo. Separación Deleción 5 Imagen GCR-INCAN. Vysis ALK Break Apart Probe Kit Package Insert Sai-Hong Ignatius Ou. Drug Design, Development and Therapy. 2011

30 ALK en Cáncer de Pulmón- Criterios de Positividad. Longitud del Gen-ALK exón tel Punto de rotura Características Número de Células contadas % de señales POSITIVAS Distancia entre las señales 5 3 Presencia de la señal roja 3 ALK Presencia de la señal verde 5 ALK cen Criterios de POSITIVIDAD Al menos 50 células. > 15% Más de 2 señales, separación, SI No Sai-Hong Ignatius Ou. Drug Design, Development and Therapy. 2011

31 ALK- Inmunohistoquímica. Expresión proteica. Puede convertirse en la herramienta de diagnóstico estándar. Se puede realizar en una pequeña cantidad de tejido. Anticuerpo Casa Rango de Rango de Comercial Sensibilidad Especificidad ALK1 Dako 9%-100% 97%-100% Un éxito limitado: Baja expresión de la proteína ALK en cáncer de pulmón (a diferencia con LACG). 5A4 Cuál es el mejor anticuerpo y sistema de detección? Abcam, 18%-100% 96%-100% Además de Novocastra la limitada disponibilidad y utilidad de los anticuerpos ALK D5F3 Cell Signaling 100% 99% Sai-Hong Ignatius Ou. Drug Design, Development and Therapy. 2011

32 Novocastra clone 5A4 Paik et al, JTO 2011 DAKO clone ALK1 Yi et al, JTO 2011 Cell Signaling clone D5F3 Mino-Kenudson et al., CCR 2010 Anticuerpo Autor Año Grupo ALK1 Boland HP 2009 Mayo DAKO Yi JTO 2011 Mayo Yang JTO 2012 Mayo Popat LC 2011 London, Royal Marsden Hospital Rodig CCR 2009 MGH/BWH/DFCC Shaw JCO 2009 MGH/BWH/DFCC Mino-Kenudson CCR 2011 MGH/BWH/DFCC Takeuchi MP 2009 Japan, The Cancer Institute D5F3, Cell Mino-Kenudson CCR 2010 MGH/BWH/DFCC Signaling Technology Salido JTO 2011 Barcelona/Colorado 5A4, AbCam Takeuchi CCR 2009 Japan, The Cancer Institute Novocastra Paik JTO 2011 Seoul National University Koh JTO 2011 Seoul National University McLeen-Florin JTO 2012 Grenoble, France 1.- Ab. Monoclonalconejo D5F Kit de detección Optiview IHC- DAB. 3.- Kit de amplificación Optiview.

33 AUTOR REVISTA-AÑO PUNTUACIÓN CUALITATIVA Popat LC Difuso 3+ Yoshida JTO = Débil 2+= Moderado 3+= Fuerte PUNTUACIÓN SEMI- CUANTITATIVA. Paik JTO = No tinción 1+= Débil < 5% 2+= Moderada 3+= Intensa Takeuchi MP 2009 Negativo= < 5% Parcial-positivo= 5-50% Positivo= > 50% Yi Yang McLeen-Florin Mino-Kenudson Koh Yoshida JTO 2011 Cuáles son los puntos de corte JTO 2012 JTO 2012 biológicamente relevantes?... CCR 2011 JTO 2011 AJSP = No tinción 1+ Débil > 10% cél. 2+ Moderado >10% cél. 3+ Intenso granular >10% cél. Tinción en el fondo >10% 10% cél 10% cél. Salido JTO 2011 H- Score (%cel 0+ % cél 1x1 +% cél 2x2 + %cél 3x3 + % cél 4x4) 0=? 1= Negativo o repetir 2= Débil 3= Moderado 4= Intenso

34 Genomico Expresion Virchows Arch (2012) 461:

35 ALK- Transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa. En ausencia de contaminación, este ensayo es específico, no se recomienda para el diagnóstico. Es una técnica que nos ayuda a identificar el gen de fusión con ALK y las diferentes variantes de la fusión EML4-ALK. Se cdna puede aplicar es difícil a las de muestras preparar en a bloque partir de de parafina tejido o tejido fresco. (RNA-later) incluido en parafina. Adam S. Crystal. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 201 Sai-Hong Ignatius Ou. Drug Design, Development and Therapy. 201

36 Tiempo de preparación de la muestra, y entrega de resultados hrs Toma- muestra/ Fijaciónformol 10% Preparación de la muestra, patología y análisis de mutación. 1-2 días Exámen histologico Reporte *Examinar y marcar la mayor área posible de la laminilla, usando un lápiz punta diamante (excluir áreas necróticas) Decision para análisis mutacional Evaluación celular FISH- *(50% cél.) Repetir la prueba, si está cerca de un límite de corte. Pirker et al. Journal of Thoracic Oncology días Nueva biopsia cuando la muestra no es suficiente. Reporte: Histología del tumor y mutación.

37 n=255 Bx. Pulmón n=177 n=192 IIIB / IV CPCNP n= ALK (-) FISH 15 ALK (+) FISH 23 FISH-NV 15 SIN MATERIAL 109 Bx- Parafina 63 Bx-Fresco 4-BAF 1- AMO No Cáncer de Pulmón *50% Celularidad n= 63 Cruz-Rico G-INCan, datos no reportados

38 23 FISH-NV FISH-Sonda Vysis LSI ALK Dual color El tiempo máximo de almacenamiento de bloques de tejido o células debe ser 1-6 meses (con base en la experiencia de los autores) para evitar resultados falsos negativos o falsos positivos. S, Chest 2006, 129: FISH-ALK = 154 ANALIZADAS Frecuencia del gen ALK-FISH (9.7%) en nuestro estudio FISH > 15% 15 (9.7%) FISH< 15% 139 (90.25%) Savic Cruz-Rico G- datos no publicados INCan

39 Diseño del estudio Extracción de RNA Trizol- Later Bx. FRESCO qrt-pcr ALK + FISH *10-100% Celularidad 5 18 NO CANCER DE PULMON n=13 3 n=6 0 Población objetivo Estudio muestra Casos con RNA no degradado Muestras 2 Bx. PULMON SANO Contro l ALK - FISH Sonda TaqMan *Gene expression assays V1= E13;A20 (33%) V3= E6; A20 (29%) Cruz-Rico G- INCan, datos no reportados

40 ALK-V1 Reaction efficiency (*) 0,94397 (* = 10^(-1/m) - 1) Quantitation data for Cycling A.Green ALK-V1 ( curva) n= 40 Pacientes Ct ALK-V1 Bajo C t = Alto no. Copias amplificadas pronto Ct R Value 0,99478 ALK-V1 Ct

41 Algunas Conclusiones. Una combinación de métodos de detección aumenta las posibilidades de identificar los casos ALK positivos Retos en la IHC: Elección del Ab, Sistema de mejora de la señal y puntuación. El CPCNP es una enfermedad HETEROGÉNEA, su tratamiento es cada vez más a la medida del subtipo tumoral. Una mayor comprensión de las vías moleculares y de la BIOLOGÍA DEL TUMOR hará más eficiente el diseño de biomarcardores.

42 Laboratorio Oncología- Experimental. Médicos Oncólogos Depto. Patología Médicos Radiólogos Clínica de Tabaquismo Depto. Psicología. Depto. Nutrición. Apoyo Administrativo