Técnicas moleculares para el diagnóstico de microorganismos fitopatógenos

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1 Técnicas moleculares para el diagnóstico de microorganismos fitopatógenos Dra. Ing. Agr. Sandra Alaniz Unidad de Fitopatología setiembre de 2015 Unidades taxonómicas Dominio Orden Familia Género Especie Sub-especie Cepa Taxonomía a Clásica Hongos: Estudios morfológicos y culturales: - Aspecto de la colonia, coloración - Forma del conidióforo - Conidios: forma, tamaño, color, presencia de tabiques - Presencia de clamidosporas, ubicación Taxonomía Clásica Bacterias: - Análisis morfológicos - Análisis bioquímicos Estudios fenotípicos: - Crecimiento a diferentes temperaturas - Resistencia a fungicidas - Producción de metabolitos Taxonomía a Clásica Virus: - Forma (microscopio electrónico) - Síntomas en plantas indicadoras - Síntomas en huésped Taxonomía a Clásica Limitantes: Resultados no son concluyentes Sujeto a cierta subjetividad Personal entrenado Tiempo requerido alto

2 Técnicas de diagnóstico basadas en BIOLOGÍA A MOLECULAR Técnicas Moleculares - Serología - Hibridación -PCR Analiza las proteínas Analiza el ADN o ARN Se basa en el análisis del ADN o ARN Quiénes pueden ser analizados? Todos los fitopatógenos que contengan ADN o ARN -Hongos - Bacterias y Fitoplasmas - Virus y Viroides - Nemátodos Que es la PCR? Consiste en amplificar muchas veces una región del ADN o ARN 95ºC Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) - Análisis de genes o regiones específicas - Análisis de todo el genoma fingerprinting Mediante hibridación - Utilización de sondas PCR: - ADN molde - Primer (cebador) -Enzima - Nucleotidos sueltos (A, T, C, G) - Buffer - Agua 40-60ºC 72ºC Virus y Viroides (ARN): RT-PCR 35 ciclos Como se visualiza el producto amplificado? Resultado con: Primers generales (ej: amplifican hongos) Teñido con bromuro de etidio Control negativo Secuenciar GTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTCCTCCGCGGCCGGCCCC CCTCCCCGGGGGGTGGCCAGCGCCCGCCAGAGGACCATCAAACTCCAGTC AGTAAACGATGCAGTCTGAAAAACATTTAATAAACTAAAACTTTCAACAA CGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAG TAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT Tamaño medio de las secuencias: de 200 y 1000 bases

3 1) Comparación de secuencias con las depositadas en el GenBank Que se hace con las secuencias? 1) Compararlas con bases de datos (genbank, otros) 2) Análisis filogenéticos 2) Análisis filogenéticos Programas: MEGA, PAUP, Sequencher, otros Identificación de especies del género Colletotrichum: Identificación molecular de especies del género Colletotrichum C. gloeosporioides MEGA 5.1 C. fragariae C. acutatum Programa: MEGA Método: Neighbord-Joining

4 Cuáles son los genes o regiones más utilizadas para los análisis? Hongos: - Región ITS (ITS1, 5.8S, ITS2): ARN Ribosomal - β-tubulina (β-tub): proteína que forma los microtúbulos (involucrados en la multiplicación celular) - Factor de elongación (Ef-1α): cataliza la traducción en la síntesis proteica - Histona 3 (H3): proteína que interviene en la división celular - Actina (Act): Proteina - Calmodulina (Cal): Proteina -IGS: espacios entre los ITS -COX: DNA mitocondrial -otros Bacterias: - Región 16S: ARN Ribosomal de las bacterias Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa): - Análisis de genes o regiones específicas - secuencias: primers generales - primers específicos Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum causantes de la podredumbre amarga en manzano Diseño de primers específicos: Región ITS (ITS1, 5.8S, ITS2) Primers específicos: - Específicamente amplifican determinado género, especie, patovar, etc - Se diseñan en regiones dónde hay variabilidad entre especies C. acutatum CaInt-2 C. gloeosporioides CgInt Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum CgInt /ITS4 CaInt-2 /ITS4 C. gloeosporioides C. acutatum? Control negativo Aplicaciones avanzadas con primers específicos Multiplex-PCR: - Se colocan dos pares o más de primers en la reacción de PCR - Permite detectar mas de una especie Identificación de Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum causantes del pie negro de la vid Controles positivos C. macrodidymum C. liriodendri Requisitos: tamaños de bandas deben ser diferentes Ventajas: mas resultados en igual tiempo

5 Aplicaciones avanzadas con primers específicos Nested-PCR: se efectuan dos PCR continuas 1º PCR: primers generales para hongos (ITS1/ITS4) 2º PCR: primers específicos Identificación de Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum 1ª PCR Primers generales ITS1/ITS4 Controles positivos C. macrodidymum C. liriodendri Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) - Análisis de genes o regiones específicas - secuencias: primers generales - primers específicos - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2ª PCR Primers específicos Aplicaciones: - Cuando la calidad del ADN no es buena - Detección en plantas RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 1º) Se amplifica una región del genoma con primers generales 2º) Se digiere (corta) el producto amplificado con una enzima de restricción (de cero a tres cortes), el producto se corre en un gel 3º) Se analiza el patrón de bandas resultante: número y tamaño de bandas Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) 37 ºC 2 horas Mediante hibridación - Utilización de sondas Qué es una sonda? Son moléculas de ADN de cadena sencilla marcadas mediante radiación (P32) o agentes químicos (digoxigenina, biotina, otros) con el fin de ser utilizadas para la detección de secuencias complementarias de DNA o RNA Procedimiento básico Sondas: - Son de relativamente pequeño tamaño (100 a 1000 bases) - Se diseñan para especificamente detectar determinado género, especie, etc Técnicas: - Southern blot: detecta ADN - Northen blot: detecta ARN Se utilizan mucho para el diagnóstico de Virus y Viroides - Dot blot: detecta ADN o ARN - Slot-blot: detecta ADN o ARN

6 Técnicas: Southern blot: detecta ADN Northen blot: detecta ARN 1- Digestión y corrida en gel 2- Transferencia a una membrana 3- Hibridación con la sonda y revelado Técnicas: Dot blot: detecta ADN o ARN 1- Se coloca la muestra directamente en la membrana 2- Hibridación con la sonda y revelado Transferencia a una membrana (nitrocelulosa) Digestión y electroforesis Aplicación de sonda y revelado Ventajas: es mucho mas rápida, permite analizar gran numero de muestras Desventajas: no hay información del tamaño de las bandas Muchas Gracias! Dra. Ing. Agr. Sandra Alaniz Unidad de Fitopatología setiembre de 2015