Citometría de flujo. Múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultanea.

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Carmelo Nieto Suárez
hace 8 años
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1 Citometría de flujo Múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultanea. Estas características de las células son evaluadas debido a que las células pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 células por segundo.

Estas características de las células son evaluadas debido a que las

2 Muestra Fluido Cámara de fluido Rayo de Luz Lentes

3 QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA? Su tamaño relativo. (Forward scatter-fsc) Su granularidad o su complejidad citoplasmática. (Side scatter-ssc) Su intensidad de fluorescencia relativa. (FL1, FL2, FL3 o FL4)

4 COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA? El citómetro de flujo detecta la interacción entre una célula y un rayo láser. La forma que la célula: Desvía la luz incidente. Emite fluorescencia.

5 Dispersión lateral (SSC) LASER Dispersión frontal (FSC) El como la célula desvía los rayo de luz nos da información acerca del tamaño y la granularidad de cada célula.

6 PRINCIPIOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Amplificador Lentes Dispersion Lateral Laser Frontal Flujo Muestra

7 Qué es un fluorocromo? 488 nm HO O 530 nm Luz Incidente CO 2 H Molécula de Luz Fluorescente Emitida Fluoresceína El fluorocromo absorbe la luz del láser El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente longitud de onda

8 Fluorescencia Intensidad de Fluorescencia Emitida = Sitios de Unión FITC FITC FITC FITC FITC Número de Eventos FITC FITC FITC FITC FITC Intensidad Fluorescente

9 TABLA DE PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO Fluorocromos Aplicación Excitación (nm) Emisión (nm) 7-amino Actinomycin D 7-AAD ADN, viabilidad Aloficocianina APC IF proteínas DAPI ADN Fluoresceína FITC IF proteínas Ficoeritrina PE IF proteínas 480 ; Hidroxicumarina IF proteínas Hoechst ADN Mitramicina ADN Naranja de Acridina AND/ARN /640 Peridinina Clorofila PerCP IF proteínas Rojo Texas IF proteínas Yoduro de Propidio PI ADN, viabilidad X-Rodamina XRITC Mitocondría

480 ; 565 578 Hidroxicumarina IF proteínas 325 386 Hoechst 33342 ADN 343 483 Mitramicina ADN 445 575 Naranja de Acridina AND/ARN 503 530/640

10 Optica Fluorescencia SSC 488/10 FL1 530/30 FL2 585/42 670LP FL3 488 nm Laser azul. Cámara De flujo 488/10 FSC

11 Finalmente la señal análoga de voltaje es pasada a una señal digital numérica que se expresa en Canales

12 Fotones Señal digital Resolución List-Mode FSC SSC FL1 FL2 Event Event Event

13 PRESENTACION DE LOS DATOS Gráficas: Histograma y de distribución en dos dimensiones. Tablas de números Valores relativos y absolutos (perlas)

14 Histograma Número de Células Incremento en intensidad Voltios transformados a Canales de intensidad 510

15 IgM (-) IgM (+)

16 Negativas Low Intemediate High M2 M1

18 M1

20 FSC FL-4 SSC Eje y FL-3 eje x FL-1 FL-2

21 Gráfica de puntos Como se ubican espacialmente las poblaciones de leucocitos de sangre periférica? Complejidad interna SSC G M L G M L L G M Tamaño relativo FSC

22 Granulocitos Detritos Monocitos Linfocitos

23 R1 30% R1

24 MARCAJE CON 1 SOLO FLUOROCROMO Se quiere saber cuantas células CD3+ hay en sangre periférica. Anticuerpo anti-cd3 marcado con fluoresceína FITC 1. Muestra de sangre periférica. 2. Mezcla de la muestra con el anti-cd3 FITC. 3. Incubar en oscuridad. 4. Lisar los glóbulos rojos. 5. Lavar con solución tampón. 6. Fijar con paraformaldehido. 7. Leer en el citómetro de flujo.

25 Control de isotipo Anti-CD3 FITC

26 Complejidad interna SSC Control de isotipo Región 1 Fluorescencia naranja (FL2) Gráfica de puntos Tamaño relativo FSC Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

27 Anti-CD3 FITC Fluorescencia naranja (FL2) UL UR LL LR Gráfica de puntos Células marcadas UL 0% UR 0% LL 10% CD3- LR 90% CD3+ Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

28 UL UR LL LR CD % de R1 CD % Población celular total Gate: G1 Quad Events % Gated % Total UL UR LL LR

29 MARCAJE CON 2 FLUOROCROMOS Se quiere saber cuantas células CD3+ y CD19+ hay hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti-cd3 marcado con fluoresceína FITC Anticuerpo anti-cd19 marcado con ficoeritrina PE

30 Gráfica de puntos Anti-CD3 FITC Anti-CD19 PE Complejidad interna SSC Región 1 Células marcadas Tamaño relativo FSC

31 Anti-CD3 FITC Anti-CD19 PE Fluorescencia naranja (FL2) Anti-CD19 PE UL UR LL LR Gráfica de puntos Células marcadas UL 14% CD3- CD19+ UR 0% CD3+ CD19+ LL 10% CD3- CD19- LR 76% CD3+ CD19- Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

32 CD % R % Total Gate: G1 CD % R1 2.71% Total Quad Events % Gated % Total UL UR LL LR

33 MARCAJE CON 3 FLUOROCR ROCROMOSOMOS Se quiere saber cuantas células T CD3+/CD4+/CD8+ hay hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti-cd3 marcado con fluoresceína FITC Anticuerpo anti-cd4 marcado con ficoeritrina PE Anticuerpo anti-cd8 marcado con Peridinina clorofila PerCP

34 Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Gráfica de puntos Anti-CD8 PrCP CD3+ CD3+ CD8+ Complejidad interna SSC Región 1 CD3+ CD4+ CD3- CD4- CD8- Tamaño relativo FSC

35 Gráfica de puntos Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP Fluorescencia naranja (FL2) Anti-CD4 PE UL UR LL LR UL 5% CD3- CD4+ UR 60% CD3+ CD4+ LL 10% CD3- CD4- LR 25% CD3+ CD4- Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

36 Gráfica de puntos Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP Fluorescencia naranja (FL3) Anti-CD8 PerCP UL UR LL LR UL 5% CD3- CD8+ UR 25% CD3+ CD8+ LL 10% CD3- CD8- LR 60% CD3+ CD8- Fluorescencia verde (FL1) Anti-CD3 FITC

37 Gráfica de puntos Anti-CD3 FITC Anti-CD4 PE Anti-CD8 PrCP Fluorescencia naranja (FL3) Anti-CD4 PE UL 65% CD4+ CD8- UR 0% CD4+ CD8+ LL 10% CD4- CD8- LR 25% CD4- CD8+ UL UR LL LR Fluorescencia verde (FL3) Anti-CD8 PrCP

38 R1 PrCP

39 UL UR Complejidad interna SSC Región 1 Complejidad interna SSC LL LR Región 2 Tamaño relativo FSC Fluorescencia verde (FL3) Anti-CD3 FITC UL 0% UR 0% LL 25% CD3- LR 75% CD3+

40 R1 R2 File: Leydi Vasquez.001 Gate: G1 Quad Events % Gated % Total UL UR LL LR

41 GRAFICAS Determinar la proporción relativa de una característica para una población celular, con respecto a la población total. Ubicación en la gráfica

42 LINFOCITO PRE B CD10 CD19 CD34 CD38 CD10 CD34 CD8 HLA-DR TIMOCITO CD1 CD8 CD2 CD71 CD3 CD38 CD4 TCR NK MADURO CD2 CD8+/- CD16 CD56 CD57 LINFOCITO B CD19 CD20 CD22 IgM LINFOCITO T COOPERADOR CD4 CD3 CD28 TCR CD5 LINFOCITO T CITOTOXICO CD8 CD3 CD28 CD5

43 Leucocitos 5800/µl Linfocitos 30% Células CD3+ 70% de los linfocitos Células CD4+ 30% Células CD8+ 65% Cual es el valor absoluto de cada subpoblación en los linfocitos y cual es el significado clínico del resultado.

44 Aplicaciones de la Citometría de Flujo en investigación

45 Células dendríticas derivadas de monocitos Monocitos DC inmadura DC madura CD14+ CD83- CD14- CD83- CD14- CD83+ IL-4 GM-CSF CD14 CD86 HLA-DR CD83 Estímulo de maduración y/o antígeno de pulga CBA

46 CD derivadas de monocitos A A. R1 96.5% B 99.5% B. CD14 CD86 0.5% HLA-DR CD83

47 Subpoblaciones de CD R1 R2 CDm Lin- HLA-DR alto CD11c+ CD123 int R4 R3 R5 CDp Lin- HLA-DR alto CD11c- CD123alto

48 Detección intracelular de citocinas CMSP Marcaje Citometría NE SEB P αcd28/αcd49d 12 h BFA x 9 h

49 Selección de la población de LT CD4+

50 Células T efectoras secretoras de IL No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml

51 Células T reguladoras secretoras de IL No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml

52 Evaluación de células T multifuncionales IL-13 IL-2 IL-10 IL-10

53 LT CD4+ Análisis: Esquema de jerarquías Seder RA. Nat Rev Immunol 2008

54 Perfil de LT multifuncionales en pacientes con diferentes estadíos de enfermedad. Ej HIV El perfil multifuncional de los LT varía de acuerdo con el estadio de la enfermedad Betts MR. Blood 2006

55 La multifuncionalidad se asocia con menor carga viral Replicación viral Virus Vaccinia CMV HIV-2 HIV-1 (LTNP) HIV-1 Progresores Número de funciones Carga antigénica y duración Seder RA. NRI 2008

56 Células T reguladoras naturales

57 Cuantificación de citocinas en fluidos MIF perlas en FL3 6 perlas con diferente MIF en FL3 Cada perla con acp de captura para una citocina diferente. Adición de la muestra O el standard (citocina) IL-12 TNFα IL-10 IL-6 IL-1β IL-8 Revela la reacción con un conjugado anti citocina MIF en FL2

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