UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas

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1 UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas SUBPOBLACIONES CELULARES EN SANGRE PERIFÉRICA DE ABORTADORAS RECURRENTES DURANTE LA FASE LÚTEA DEL CICLO MENSTRUAL Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Aramilena Prado Drayer Como requisito parcial para optar al título de MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Realizado con la tutoría de Prof. María Isabel Camejo Octubre 2006

2 ii Universidad Simón Bolívar Decanato de estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas SUBPOBLACIONES CELULARES EN SANGRE PERIFÉRICA DE ABORTADORAS RECURRENTES DURANTE LA FASE LÚTEA DEL CICLO MENSTRUAL Este trabajo ha sido aprobado en nombre de la Universidad Simón Bolívar por el siguiente jurado examinador: Prof. Henry Caballero Presidente-USB Prof. Ysabel Casart UCV Prof. María Isabel Camejo Tutor-USB 05 de octubre de 2006

3 iii Dedicado a la memoria De mis amados abuelos Félix Drayer y Juanita de Drayer Tato y Nana y a mi gran amiga y consejera Hilda Camarillo siempre los llevaré en mi corazón doy gracias a Dios por haberme permitido compartir parte de mi vida con ustedes.

4 iv AGRADECIMIENTOS A la Dra. María Isabel Camejo por haber creído en este proyecto, por su labor docente, por ser amiga y consejera. Al Dr. José Teppa sin su colaboración este proyecto no hubiese sido posible. Al Dr. Pedro Sánchez por haber hecho más fácil la realización de este sueño, por su guía, su orientación, sus consejos y por compartir sus conocimientos conmigo. A mi amado esposo el Dr. José Carlos Rosales, por ser ejemplo a seguir, por su apoyo incondicional, por su comprensión y paciencia. A mi mamá Aracelis Drayer, a mis hermanas: Arakarina, Aramarina y Aracelis, a Rafael Valdéz y a toda mi familia por apoyarme, aconsejarme, por alegrar mis días y entender la escasez de mi tiempo. A todas las pacientes que participaron en este estudio, sin ustedes nada hubiese sido posible. A la Lic. y buena amiga Juvic Goncalvéz por su colaboración en este proyecto y por su compañía durante todo el postgrado. A la Lic. Lorena Lozano, que colaboró conmigo de manera desinteresada y resultó ser una gran compañera. Al Lic. José Antonio Orosa por su colaboración en este proyecto. A las Lic. Anyela Moreno y Yadira Doria quienes colaboraron desinteresadamente conmigo. A la Srta. Niurka, la Sra. Oceanía y la Sra. América, que siempre estuvieron dispuestas a colaborar. A mi gran amiga Ninoska por su apoyo incondicional. A la Dra. Osiris Da Costa por su compañía y su amistad. A la Lic. Patricia Rodríguez, por compartir sus conocimientos conmigo, por su paciencia y compresión. A la Lic. Lisbeth García quien guió mis primeros pasos en el área de la reproducción.

5 v RESUMEN Durante el embarazo el sistema inmunológico materno experimenta un proceso único de tolerancia, para evitar el rechazo del embrión. Con la finalidad de evaluar el estado inmune de mujeres fértiles normales (CN) y con historia de aborto recurrente (AR) de etiología desconocida, durante la fase lútea del ciclo menstrual, se estudiaron 18 AR y 10 CN. Las muestras de sangre periférica se analizaron por citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de células T ayudadoras (CD4), citotóxicas (CD8), vírgenes (CD45RA), de memoria (CD45RO) y células citotóxicas naturales NK (CD16+/CD56+/CD3-). También se evaluó el receptor de células T (TCRαβ, TCRγδ), el estado de activación de las células T (CD3+) y de NK por la expresión de CD69 de superficie e intracelular. Los niveles séricos de TNFα fueron medidos y se evaluó el efecto de los sueros de AR y CN sobre cultivos de células mononucleares de sangre periférica. Sólo en AR se encontró incrementada, la población células T activadas en la superficie celular (P<0.004) e intracelular (P<0.015), cuando se comparó con el CN. El resto de las subpoblaciones linfocitarias fueron similares en ambos grupos. El porcentaje total de NK fue significativamente mayor en AR en relación a los CN (P<0.002), adicionalmente se encontró incrementado el porcentaje de NKdim en AR (P<0.003), no ocurriendo así con las NKbright. Las NK de AR mostraron aumentada la expresión del CD69 intracelular (P<0.007). Los niveles de TNFα no mostraron diferencia entre grupos. No se encontró ningún efecto de los sueros de AR y CN sobre los cultivos celulares. Estos resultados sugieren que la determinación del estado de activación de células T y NK, del porcentaje total de NK y de NKdim podrían considerarse como factores aloinmunes en AR, durante el período de receptividad uterina. Palabras claves: abortadoras recurrentes, linfocitos T, NKdim, NKbright, CD69,

6 vi ÍNDICE GENERAL I.- INTRODUCCIÓN II.-OBJETIVOS Página 1 5 III.- MARCO TEÓRICO Inmunología del embarazo: Tolerancia vs. Rechazo Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) El aborto Linfocitos T Células T efectoras y de memoria Receptor de células T Células Citotóxicas Naturales (NK) Leucocitos endometriales y deciduales Citocinas IV.- MATERIALES Y MÉTODOS Abortadoras recurrentes (AR) Controles Normales (CN) Muestras Niveles séricos de TNFα Cultivos Celulares Análisis de subpoblaciones celulares por citometría de flujo Análisis estadístico V.- RESULTADOS Datos clínicos Células T Células citotóxicas naturales NK Abortadoras recurrentes primarias y secundarias VI.- DISCUSIÓN Características clínicas Leucocitos totales y células T Activación de células T Células citotóxicas naturales NK Activación de células citotóxicas naturales NK Abortadoras recurrentes primarias y secundarias Características Clínicas Células T Células citotóxicas naturales NK

7 vii Correlación en abortadoras recurrentes primarias Correlación abortadoras secundarias VI.- CONCLUSIONES 65 VII.- BIBLIOGRAFÍA 67 VIII.- ANEXOS Factores fetales implicados en el aborto Factores maternos implicados en el aborto Factores paternos implicados en el aborto Consentimientos de pacientes Entrevistas a pacientes

8 viii ÍNDICE DE TABLAS TABLA 1.- Riesgo de pérdida temprana del embarazo en mujeres jóvenes Página 15 TABLA 2.- Estudios en sangre periférica de células NK en AR 22 TABLA 3.- Leucocitos endometriales y deciduales 22 TABLA 4.- Anticuerpos monoclonales empleados en el estudio 30 TABLA 5.- Datos clínicos en CN y AR 36 TABLA 6.- Valores de la concentración de leucocitos y linfocitos en CN y AR 37 TABLA 7.- Subpoblaciones linfocitarias y expresión CD69, TCRαβ y TCRγδ en CN y AR 37 TABLA 8.- Datos clínicos de CN y AR primarias y secundarias 42 TABLA 9.- Comparación de los porcentajes de las subpoblaciones de células T que mostraron diferencias significativas entre AR primarias y secundarias con respecto al grupo control 42 TABLA 10.- Subpoblaciones de NK y expresión de CD69 en CN y AR primarias y secundarias 43 TABLA 11.- Correlaciones entre los valores sércos de TNFα con diferentes poblaciones celulares en AR primarias 43 TABLA 12.- Correlaciones entre los valores sércos de TNFα con las subpoblaciones células citotóxicas de NK en AR secundarias 44 TABLA 13.- Correlación entre el número de gestaciones y abortos con las células NKbright, NK activadas y TNFα en AR secundarias 45

9 ix ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1.- Proceso de fertilización 7 FIGURA 2.- Primeras semanas de gestación: proceso de adhesión y formación de la placenta 7 FIGURA 3.- Proceso de invasión del trofoblasto embrionario al estroma uterino 9 FIGURA 4.- Respuesta inmune ante antígenos foráneos 11 FIGURA 5.- Ambiente inmune en la interfase materno-fetal 23 FIGURA 6.- Esquema simplificado de las citocinas que actúan sobre el embrión y la placenta 24 FIGURA 7.- Análisis dot-plot FSC vs. SSC (tamaño vs. complejidad). Selección de la región R1 (correspondiente a linfocitos y monocitos) 31 FIGURA 8.- Análisis dot-plot (SSC vs. CD3) en la región R1. Selección de la región R2 (correspondiente a las células T CD3+) 31 FIGURA 9.- Análisis dot-plot (CD16 vs. CD56) en la región R1. Selección de la región R3 (correspondiente a las células NK) 32 FIGURA 10.- Expresión del marcador de activación CD69 de superficie y citoplasmático en células T en CN y AR 38 FIGURA 11.- Porcentaje de células cititóxicas naturales NK totales en CN y AR 38 FIGURA 12.A.- Porcentaje de células NK brillantes NKbright y poco brillantes NKdim en CN y AR 39 FIGURA 12.B- Inmunofenotipo de células NKbright y NKdim en CN y AR 39 FIGURA 13.- Expresión del marcador de activación CD69 de superficie y citoplasmático en células NK en CN y AR 40 FIGURA 14.- Inmunofenotipo de la expresión del marcador de activación CD69 en células T y células NK en CN y AR 41

10 x FIGURA 15.- Correlación entre las células NK dim y las células NK activadas en AR primarias 44

11 I.- INTRODUCCIÓN El aborto se define como la terminación del embarazo antes de que el feto esté suficientemente desarrollado para sobrevivir (Willians 2001). Según la Organización Mundial de la Salud el aborto es la pérdida fetal que ocurre antes de la semana 20 de gestación o cuando el peso del feto está por debajo de los 500 gramos. Un aborto espontáneo se define como la pérdida fetal que ocurre antes de la semana 20 de gestación en ausencia de procedimientos médicos electivos o quirúrgicos. Cuando el aborto ocurre antes de la semana 12 de gestación se conoce como aborto temprano. Si el embarazo se interrumpe tres o más veces espontáneamente durante el primer trimestre se habla de pérdida recurrente o aborto habitual (Speroff 2000). Una abortadora recurrente primaria se define como aquella paciente que ha perdido todos sus embarazos y no reporta ningún nacimiento vivo. La abortadora recurrente secundaria es aquella que presenta por lo menos un embarazo exitoso sin importar el número de pérdidas reportadas (Pandey M.K et al. 2005). El aborto recurrente afecta al 1-2% de la población (Laird et al. 2003), no obstante establecer un porcentaje exacto resulta sumamente difícil, dado que en humanos cerca del 25% de los embriones implantados son reabsorbidos entre los días 7-14 después de su unión al endometrio, este tipo de embarazos pasan clínicamente desapercibidos, en tanto que las pérdidas fetales antes de la semana 20 de gestación, clínicamente reconocidas, ocurren con una frecuencia del 15% (Roy Choudhury S. and Knapp L.A 2000). Las pérdidas fetales consecutivas sugieren la presencia de una causa específica, numerosos estudios orientados a identificar los mecanismos involucrados en el aborto recurrente (Clark et al. 2001), han podido determinar que la etiología del aborto es multifactorial: Causas fetales como cariotipos anormales del cigoto, del embrión o del feto temprano; Causas paternas debidas a alteraciones en el ADN espermático, y Causas maternas tales como: la edad, factores cervicales, patologías uterinas, defectos endometriales, estados protrombóticos, desórdenes endocrinos, factores ambientales, nutrición, infecciones y factores

12 2 inmunológicos, han sido implicados en la pérdida fetal. Sin embargo, cabe destacar que cerca del 50% de los abortos recurrentes son de etiología desconocida (Laird et al. 2003). La principal causa de aborto es de etiología genética, bien por alteraciones numéricas en los cromosomas o por anomalías cromosómicas del feto heredadas de los padres. Si las causas genéticas han sido descartadas en pacientes con antecedentes de aborto recurrente y si las otras posibles causas de aborto (causas maternas y paternas) han sido estudiadas sin establecer ninguna alteración, el estudio inmunológico debe ser considerado en este tipo de paciente. El embrión al no ser genéticamente idéntico a la madre pudiese provocar la respuesta de las células inmunocompetentes maternas, que pudieran reconocer los antígenos fetales como extraños y provocar el rechazo del embrión. En vista de ello durante el embarazo normal, el sistema inmunológico materno experimenta un mecanismo único descrito en la inmunología, conocido como tolerancia inmunológica, proceso que permite el desarrollo embrionario (Thellin and Heinen 2003). Inmunológicamente el embrión es considerado un aloinjerto, de hecho, el término aloinjerto fetal fue propuesto por primera vez por Medawar en el año 1953, quien propone que el embrión al no ser genéticamente idéntico a la madre, por ser el producto de la fusión de genes maternos y paternos, debe ser considerado como un aloinjerto desde el punto de vista inmunológico, a partir de entonces la atención de los estudios en el área de inmunología se evocaron a tratar de explicar como se establece el mecanismo de inmunotolerancia que ocurre en la madre durante el embarazo. Aún en nuestros días son muchos los aspectos desconocidos a este respecto, lo que sí está claro, es que el embrión expone una serie de antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) no clásicos, con características muy particulares que le permiten evadir la respuesta inmune materna (Fernández N. et al 1999). Como es bien sabido existen dos niveles en la respuesta inmune, la inmunidad innata y la inmunidad de tipo adaptativa, ambas respuestas operan cooperativamente con la finalidad de producir una respuesta inmune más efectiva (Goldsby R et al 2000). La inmunidad innata como su nombre lo indica, está presente desde el nacimiento y es la primera línea de defensa no específica contra antígenos foráneos, las células involucradas en este tipo de respuesta son las células citotóxicas naturales (NK), macrófagos, polimorfonucleares. Por su parte la respuesta inmune adaptativa o adquirida posee un alto grado de especificidad y gracias a su propiedad de memoria permite generar una respuesta más rápida y efectiva para neutralizar antígenos foráneos, las células especializadas en este tipo de respuesta son los linfocitos T y B.

13 3 Específicamente las células T ayudadoras (Th) producen una serie de citocinas, que son proteínas de bajo peso molecular con capacidad de regular la intensidad y duración de la respuesta inmune, además de ejercer una variedad de efectos sobre los mismos linfocitos y otras células inmunocompetentes. Las células Th1 producen citocinas Th1 (IL-2, INFγ, TNFα) que promueven la clásica respuesta de inmunidad celular, observada en la reacción de rechazo al injerto. Las células Th2 por su parte producen citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-10) con efecto antinflamatorio. Para el establecimiento del embarazo normal es necesario que ocurra un cambio en el patrón de producción de citocinas, que favorezca la producción de las citocinas Th2, este evento es conocido como fenómeno Th2 (Sabahi et al 1995, Ekerfelt et al 1997, Satio et al 1999, Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2002). Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo normal del embarazo requiere de una serie de mecanismos que sean capaces de modular el sistema inmune materno, con la finalidad de lograr la evasión de la respuesta de las células inmunocompetentetes maternas ante la presencia del aloinjerto fetal. Por ello, resulta lógico pensar que cualquier alteración o desbalance en estos mecanismos de control podría ser causa de aborto. De allí, la importancia de evaluar el estado inmunológico de aquellas mujeres con historia de pérdidas recurrentes del embarazo de causa desconocida. Si consideramos que cerca del 50% de los abortos son de etiología idiopática, y que el estado inmune en este tipo de paciente es escasamente estudiado, la hipótesis del presente estudio consiste en que pacientes con historia de pérdidas recurrentes del embarazo de causa desconocida, podrían presentar una respuesta inmune exacerbada durante el período de la ventana de implantación embrionaria (fase lútea del ciclo menstrual), al compararse con un grupo control de mujeres fértiles. Es por ello, que el estudio del fenotipo de las células inmunocompetentes involucradas en la respuesta inmune innata y adquirida (tales como las células citotóxicas naturales: NK y células T, respectivamente) así como la investigación del estado de activación de dichas células, durante el período de receptividad uterina, nos permitiría evaluar los factores aloinmunes como posible causa de aborto recurrente en este tipo de paciente. Numerosos estudios realizados en endometrio han evaluado diferentes poblaciones celulares y han permitido establecer que un incremento en cierto tipo de células inmunes como las células NK, se asocian a aborto recurrente (Dosiou C. & Giudice L. 2005, Michou et al. 2003). De la misma manera, la mayoría de los estudios reportados en la literatura determinan

14 4 que el incremento en la población de NK durante el primer trimestre de gestación, en abortadoras recurrentes tiene incidencia directa sobre la pérdida del embarazo (Beer et al. 1996, Coulan et al. 1995, Fukui et al. 1999, Yamada et al. 2003). Adicionalmente las subpoblaciones de linfocitos T, la producción de citocinas por parte este grupo de células (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2003, Chaouat et al 1990; Haimovici et al 1991, Tsuda H. et al 2001) y el tipo de receptor de células T expresados por los linfocitos deciduales, endometriales y de sangre periférica (Szekeres-Bartho et al 2001, Mincheva-Nilsson 2003) también han sido ampliamente estudiados, demostrando la influencia de dichas células durante el embarazo normal y su posible relación con el aborto recurrente. Debido a estos antecedentes el propósito de esta investigación es estudiar, durante la fase lútea del ciclo menstrual, las características inmunofenotípicas en sangre periférica de abortadoras recurrentes y mujeres fértiles normales, con la finalidad de determinar si el grupo de abortadoras a repetición presenta una respuesta inmune exacerbada, durante el período de receptividad uterina. Estos hallazgos podrían sustentar el factor aloinmune como posible causa de las pérdidas fetales recurrentes de etiología idiopática.

15 II.- OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL. Evaluar en sangre periférica las características inmunofenotípicas de mujeres fértiles y mujeres con historia de aborto recurrente, durante la fase lútea del ciclo menstrual. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1.- Determinar las diferentes subpoblaciones de células T y células citotóxicas naturales NK, en pacientes con antecedentes de aborto recurrente y compararlas con mujeres de fertilidad comprobada sin antecedentes de abortos, durante la fase lútea del ciclo menstrual. Para tal fin se realizó la determinación de las siguientes poblaciones celulares: 1.1- Subpoblación de linfocitos T ayudadores (CD4+/CD3+) y linfocitos T citotóxicos (CD8+/CD3+) Subpoblación de células T ayudadoras vírgenes (CD4+/CD45RA+/CD3+) y células T ayudadoras de memoria (CD4+/CD45RO+/CD3+) Subpoblación de células T citotóxicas vírgenes (CD8+/CD45RA+/CD3+) y de células T citotóxicas memoria (CD8+/CD45RO+/CD3+) Células citotóxicas naturales NK (CD16+/CD56+/CD3-) 2.- Evaluar la expresión del receptor de células T (TCRαβ/ TCRδγ) en los dos grupos estudiados. 4.- Medir la activación de las células T y de las células citotóxicas naturales NK, a través de la expresión del marcador de activación CD69 de superficie e intracelular, en pacientes con aborto recurrente y mujeres fértiles sin antecedentes de aborto. 5.- Determinar los niveles séricos de progesterona y de TNFα en abortadoras recurrentes y en el grupo control. 6.- Establecer si existe alguna relación entre los niveles séricos de TNFα con las poblaciones celulares estudiadas. 7.- Evaluar el efecto del suero de abortadoras recurrentes y mujeres fértiles normales, en cultivo de células mononucleares de sangre periférica.

16 III.- MARCO TEÓRICO INMUNOLOGÍA DEL EMBARAZO: TOLERANCIA vs. RECHAZO. Al fusionarse el gameto femenino y masculino ocurre la fecundación, proceso que se caracteriza por la reanudación de la segunda división meiótica del ovocito con la consecuente expulsión del segundo cuerpo polar y la formación del pronúcleo femenino, que contiene los 22 cromosomas maternos más el cromosoma X, entre tanto, el espermatozoide pierde la cola y el núcleo y forma el pronúcleo masculino, con sus 22 cromosomas y el cromosoma sexual (X ó Y). Ambos pronúcleos haploides, antes de establecer contacto íntimo, inician un proceso de crecimiento en el que replican sus respectivos ADN. Posterior al proceso de replicación de ADN los cromosomas de manera inmediata se disponen en forma de huso preparándose para una división mitótica, de esta manera los 23 cromosomas maternos y los 23 paternos se dividen longitudinalmente por su centrómero y las cromátides hermanas se desplazan hacia los polos opuestos, para garantizar a cada célula hija el número diploide normal de cromosomas. De esta manera se inicia el desarrollo embrionario, que trae como consecuencia la formación de un cigoto caracterizado por la combinación de cromosomas provenientes de ambos progenitores (Sadler T. W. 2002). (Figura 1). El genoma del cigoto es el producto de la mezcla de genes maternos y paternos, por esta razón el sistema inmunológico de la madre puede reconocer como extraño los antígenos paternos y producir el rechazo del embrión, sin embargo, esto no sucede en un embarazo normal, donde por el contrario, la madre experimenta un fenómeno de tolerancia inmunológica, que le permite anidar el embrión y lograr un embarazo a término (Figura 2).

17 7 Coprona radiada Primer cuerpo polar Huso meiótico Citoplasma del ovocito Zona Pelúcida Membrana celular del ovocito Figura 1. Proceso de Fertilización: entrada del espermatozoide al ovocito maduro Figura 2. Primeras semanas de gestación: proceso de adhesión y formación de la placenta.

18 8 El embarazo representa un fenómeno fisiológico único en la naturaleza que comprende la simbiosis entre dos individuos semi-alogénicos (la madre y el feto). Este proceso de simbiosis requiere de una sofisticada regulación inmunológica que evite el rechazo fetal y que controle la invasión del tejido fetal foráneo dentro de la decidua materna (Kámmerer U. et al. 2004). Para que la implantación del embrión y el mantenimiento del embarazo sean posibles es necesario que tanto el sistema inmune uterino como la antigenicidad embrionaria (HLA-G) eviten el desencadenamiento de la repuesta inmune materna. Paralelamente complejos mecanismos hacen posible que dos epitelios diferentes como el epitelio del trofoblasto embrionario y el epitelio endometrial se fusionen en uno solo a través del proceso de decidualización. Para que ocurra la decidualización el endometrio debe ser preparado a través del ciclo menstrual mediante la influencia de estrógeno, progesterona y factores de crecimiento. Además se requiere de complejos procesos como la neoangiogénesis y la vasculogénesis, el reconocimiento de las células trofoblásticas por varios componentes de la decidua como integrinas y caderinas, la invasión de la decidua por las arterias espirales, que representan los mecanismos biológicos necesarios para que ocurra la implantación embrionaria. (Druckmann R and Druckmann M. 2005) Históricamente desde el año 1953 Medawar introduce el concepto de semialoinjerto fetal, debido a que el embrión no es genéticamente idéntico a la madre y aún así, en condiciones normales, el sistema inmune materno permite la sobrevida fetal. En su tiempo Medawar sugiere que la tolerancia materna se debe a la falta de expresión antigénica fetal gracias a la separación anatómica entre el feto y la madre, ó a la supresión funcional de los linfocitos maternos. (Medawar 1953). Hoy en día se sabe que la teoría de la separación anatómica no se cumple, ya que las células del trofoblasto fetal están en estrecho contacto con las células del sistema inmunológico de la madre. Con respecto a la falta de estimulación antigénica de los linfocitos maternos, se sabe que las células del trofoblasto fetal no expresan los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), responsables del rechazo de aloinjertos en humanos (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2003) También para el año 1953 Billingham y Mcdawar proponen cuatro hipótesis para explicar la tolerancia inmunológica: la falta de inmunogenicidad fetal, una respuesta inmune significativamente baja durante el embarazo, el útero considerado como un lugar inmunoprivilegiado, y por último la placenta como una barrera inmunológica. Sin embargo, estudios en células de ratón demuestran que el trofoblasto posee propiedades inmunogénicas

19 9 (Hoskin y Murgita 1989) y estudios que miden el estatus de la respuesta inmune en mujeres embarazadas y no embarazadas no han demostrado diferencia significativa. Asimismo, la posibilidad del desarrollo de embarazos ectópicos acaba con la hipótesis de que el útero es un lugar inmunoprivilegiado (Thellin O. et al 2000). La teoría de que placenta es una barrera inmunológica ha sido reconsiderada ya que inicialmente se pensaba que era una barrera pasiva, sin embargo, los estudios de Petraglia et al (1996), proponen que la placenta es un sitio de tolerancia activa, ya que se ha podido determinar la presencia de moléculas antigénicas fetales potencialmente inmunogénicas en la sangre materna (Reading F et al 1995). Debido a que no existe continuidad vascular entre la madre y el feto, se presume que durante la proliferación del trofoblasto, las células y moléculas fetales potencialmente inmunogénicas pueden alcanzar la sangre materna y entrar en contacto con el sistema inmune materno, de allí que la placenta sea considerada un sitio activo de tolerancia durante el embarazo. Las células del trofoblasto son las principales células embrio-fetales que entran en contacto con las células maternas. Existen tres poblaciones diferentes de trofoblasto: el citotrofoblasto velloso que representa el grupo de células trofoblasticas en activa división dentro de las vellocidades, el sincitiotrofoblasto que cubre al citotrofoblasto y se encuentra en contacto con la sangre materna, y el citotrofoblasto extravelloso que prolifera y es el precursor de las células trofoblásticas que migran a la decidua y al miometrio. El hecho de que el sincitiotrofoblasto se encuentre en contacto con la sangre materna explica que exista un mecanismo de tolerancia inmunológica que permita la adaptación de la madre a la presencia del semialoinjerto fetal (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2003) (Figura 3). Epitelio uterino Sincitiotrofoblasto Citotrofoblasto Masa celular Interna Blastocele Implantación Invasión Figura 3. Proceso de invasión del trofoblasto embrionario al estroma uterino

20 10 Cuando se completa el proceso de implantación la respuesta inmune celular y humoral materna deben permanecer en un estricto balance que garantice la supervivencia fetal, ya que como se ha venido mencionando, el embrión al no ser genéticamente idéntico a la madre puede convertirse en un estímulo para el sistema inmunológico de la misma. Estudios en distintas especies han permitido demostrar que el trofoblasto embrionario es un tejido con muchas funciones desde el punto de vista inmunológico, que favorecen al fenómeno de tolerancia experimentado por la madre durante el embarazo (Bulletti 1996). En efecto, el trofoblasto actúa como barrera física (Chaouat et al 1983), como supresor de reactividad materna al reclutar señales que causan la migración de linfocitos uterinos y deciduales (Clark et al 1987). Adicionalmente, posee una baja antigenicidad (Smith 1983) y produce hormonas inmunosupresoras como la progesterona (Suites and Siiteri 1983). Todas estas características le confieren al trofoblasto la capacidad de modular la respuesta inmune materna. Los mecanismos de tolerancia materna al feto han sido un evento importante durante la evolución, ya que han garantizado el mantenimiento del injerto feto-placentario, a través de los años. Estos mecanismos son múltiples y actúan en diferentes períodos del desarrollo embrionario y fetal, bien sea a distancia modulando el sistema inmune materno, (a través de factores endocrinos) o localmente a nivel de la placenta (durante el contacto directo entre las células maternas y fetales, o por factores paracrinos y autocrinos solubles) (Thellin O. et al 2000). Durante el embarazo el balance entre los mecanismos de tolerancia y rechazo se encuentran bajo el control de factores externos (el medio ambiente) y factores internos que dependen de la madre y el feto. En efecto, la presencia de sustancias tóxicas, agentes infecciosos y agresiones físicas o psicológicas pueden marcar la diferencia entre la tolerancia y el rechazo del semialoinjerto fetal, por parte del sistema inmune materno (Thellin O. y Heinen E. 2003). La respuesta inmune es la consecuencia de una serie de eventos desencadenados ante la presencia de antígenos (ó autoantígenos), que hace que las células inmunes actúen como células productoras de anticuerpos (linfocitos B) y como células presentadoras de antígenos (linfocitos T). Asimismo, moléculas mensajeras como citocinas y quimiocinas con sus respectivos receptores se conjugan para generar una respuesta inmune efectiva (Mackay IR. 2005) (Figura 4).

21 11 La forma de como la madre logra vencer todos estos mecanismos inmunológicos, que pueden ocasionar el rechazo del aloinjerto fetal, se explica porque durante el embarazo normal se desarrolla un estado de no respuesta a antígenos particulares, definido como tolerancia inmunológica, equiparable al estado de tolerancia que generamos para impedir que nuestros propios antígenos sean considerados como extraños. Sin embargo, queda por explicar como hace el embrión para evadir todos estos mecanismos inmunológicos maternos. Innumerables son las hipótesis planteadas, y aunque muchos aspectos todavía resultan ser un enigma para la inmunología, lo que si está claro es que el embrión expresa una serie de elementos antigénicos en sus células que son potenciales activadores del sistema inmune materno, no obstante, estos antígenos denominados antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), presentes en todas las células, particularmente en el embrión, exhiben características peculiares que representan un mecanismo de evasión de la respuesta inmune materna. Endocitosis Receptor Antígenos (ó autoantígenos) Célula presentadora de Ag. TNFα IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 Activación de célulasb IL-4 Anticuerpos (ó autoanticuerpos) IL-4 Respuesta inflamatoria IL-12 INFγ INFγ Figura 4: Respuesta inmune frente antígenos foráneos

22 MOLÉCULAS DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH) EMBRIONARIAS. El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) se define como un repertorio de genes, que en humanos se localizan en el cromosoma 6 y se denomina HLA (human leukocyte antigen). Se caracteriza por ser el sistema más multigénico y polimorfico hasta ahora descrito. Sus genes son organizados dentro de regiones que codifican tres clases diferentes de moléculas: clase I, clase II y clase III. Las moléculas clase I son glicoproteínas expresadas sobre la superficie de todas las células nucleadas cuya función es la presentación de antígenos a las células T citotóxicas (Tc). Las moléculas clase II son glicoproteínas expresadas básicamente sobre las células presentadoras de antígenos (macrófagos, células dendríticas y células B), su función es presentar antígenos a las células T ayudadoras (Th). Por su parte los moléculas clase III son proteínas que intervienen en diferentes funciones inmunes, como es el caso de los procesos inflamamtorios (Goldsby et al. 2000). Los genes del CMH se heredan del padre y de la madre, precisamente esa herencia de antígenos paternos podría desencadenar la respuesta inmune en la madre ocasionando el rechazo de embrión (Fernandez N. et al. 1999). Sin embargo, en condiciones normales, el embarazo se caracteriza por brindar protección al aloinjerto fetal, lo que le confiere unas características únicas a este sistema de reconocimiento antigénico. La sobrevida del aloinjerto fetal requiere de la existencia de una serie de mecanismos que garanticen la tolerancia materna. Uno de estos mecanismos está relacionado con la falta de expresión antigénica inmunológicamente activa del CMH, en la superficie de las células que se encuentran en la interfase materno-fetal. Esta falta de activación inmune puede obedecer a que exista una débil expresión o falta de la misma en los antígenos clase I y II en el sincitiotrofoblasto. De manera tal que si comparamos las células placentarias con cualquier célula del cuerpo humano observamos que la placenta presenta una expresión atípica de las moléculas del CMH, ya que las moléculas clásicas clase I, como HLA-A y HLA-B, involucradas en los procesos de presentación de antígenos, se encuentran ausentes en las células trofoblásticas de las vellocidades placentarias, al igual que en citotrofoblasto extravelloso. Sin embargo, se ha observado la expresión del ARNm del HLA-C durante el primer trimestre del embarazo. Adicionalmente se ha determinado la expresión de moléculas clase I del tipo HLA-E y HLA-G, en las poblaciones del trofoblasto humano que abandonan el

23 13 corion para invadir el citotrofoblasto placentario, lo que parece ser la clave de la supresión de la respuesta inmune al permitir que el trofoblasto sea considerado como propio por las NK maternas (Fernandez N. et al. 1999, Hunddleston y Schust 2004). Durante el período de implantación se produce una disminución de los antígenos clase Ia y clase II, mientras que la expresión de los antígenos clase Ib se incrementa, lo que indica que durante el desarrollo embrionario existe una expresión selectiva del CMH en la interfase materno-fetal, que posiblemente sea un mecanismo protectivo contra el ataque de células T y NK maternas (Robert et al 1992, Fenichel et al 1995, Fernandez N. et al. 1999). Estudios realizados en ratones han permitido seguir la expresión de los antígenos del CMH durante el desarrollo embrionario, dichos estudios han sugerido que los complejos clase I están presentes en la superficie de los embriones en estadios muy tempranos de su desarrollo, incluyendo la β2- microglobulina, sin embargo, estos antígenos parecen no ser funcionales, debido a la falta de los polipéptidos transportadores (TAP 1 y 2) cuyos niveles de ARNm han sido detectados solo en el estado de blastocisto y no en otro estadio del desarrollo embriológico preimplantación. En humanos este tipo de estudio ha sido más difícil debido a las características particulares de la fisiología y anatomía humana. Lo que si está claro es que los genes clase Ib y sus productos (HLA-E, F, G) están presentes en el embrión temprano, además se ha descrito la existencia de múltiples isoformas de HLA-G en el citotrofoblasto, producto de diferentes niveles de glicosilaciones, lo que sugiere que durante la placentación los linfocitos deciduales (NK) interactuan con estos antígenos no clásicos. En otro sentido la molécula clásica clase I del CMH el HLA-C presente en el trofoblasto, se caracteriza por tener una vida media reducida a la mitad, cuando se compara con las otras moléculas clásicas HLAA y B, lo que explica su eficiencia limitada en la presentación de antígenos, pudiendo ser este otro mecanismo protector para el aloinjerto fetal. (Hunddleston y Schust 2004) EL ABORTO Los análisis matemáticos clásicos de Roberts y Lowe realizados en el año 1975, indican que la reproducción humana normal es un proceso fisiológico ineficiente, de hecho, se ha determinado que solo el 22,8% de las parejas que conciben finalizan en embarazos a término (Clark D. 2003). Adicionalmente se ha calculado que cerca del 10% de la población normal (población en edad reproductiva) presenta problemas de infertilidad, entendiendo por

24 14 infertilidad, la incapacidad de concebir luego de mantener relaciones sin protección durante un período de doce meses. Mucha es la terminología utilizada para definir los problemas de infertilidad y desafortunadamente la falta de estandarización en los términos empleados hacen que la nomenclatura sea complicada y específicamente en el caso del aborto, se dificulta aún más debido a que hay que tomar en cuenta una serie de factores como el período de tiempo en el cual ocurre la pérdida, las complicaciones que pueden surgir y la conducta médica, de allí, que seguidamente se definan algunos términos (Roy and Knapp 2000). El aborto se define como la terminación del embarazo antes de que el feto esté suficientemente desarrollado para sobrevivir (Willians 2001). Según la Organización Mundial de la Salud el aborto es la pérdida fetal que ocurre antes de la semana 20 de gestación o cuando el peso del feto está por debajo de los 500 gramos. Un aborto espontáneo se define como la pérdida fetal que ocurre antes de la semana 20 de gestación en ausencia de procedimientos médicos electivos o quirúrgicos. Cuando el aborto ocurre antes de la semana 12 de gestación se conoce como aborto temprano. El aborto espontáneo puede ser clasificado en varias categorías: amenaza de aborto, aborto inevitable, aborto incompleto, aborto completo, aborto diferido, aborto séptico y aborto recurrente (Griebel et al. 2005). La amenaza de aborto se define como un embarazo complicado por sangrado uterino durante las primeras 20 semanas de gestación. El aborto inevitable se caracteriza por dilatación cervical sin expulsión del producto de la concepción. El aborto incompleto se caracteriza porque parte del producto de la concepción queda retenido en el útero materno (restos ovulares). Un aborto completo es aquel donde todo el producto de la concepción es expulsado sin necesidad de intervención medico-quirúrgica. El aborto diferido es el hallazgo de ausencia de actividad cardiaca fetal, sin evidencias de actividad uterina para expulsar el producto de la concepción. Cuando se utiliza el término aborto séptico se refiere a un aborto incompleto con signos de infección (fiebre, leucocitosis, entre otros). Si el embarazo se interrumpe tres o más veces espontáneamente durante el primer trimestre se habla de pérdida recurrente o aborto habitual (Speroff 2000). Estudios epidemiológicos de Roberts y Lowe han permitido determinar que por cada aborto la probabilidad de sufrir un aborto sucesivo se incrementa notablemente (James 1963, Poland 1977, Speroff, Pandey 2005) y que luego de tres abortos las posibilidades de un embarazo satisfactorio son escasas (Tabla1).

25 15 TABLA 1. Riesgo de pérdida temprana del embarazo en mujeres jóvenes Mujeres con nacimientos vivos Mujeres sin un nacimiento vivo Número de pérdidas anteriores % de Riesgo de aborto en el siguiente embarazo 0 12% 1 24% 2 26% 3 32% 4 26% 6 53% 2 o más 40-45% (Tomado de: Speroff 2000) Cerca del 50% de los embarazos se pierden entre las semanas 2 y 4, luego de la concepción; esto quiere decir que la mitad de los ovocitos fertilizados no progresan a embarazos viables. (Wramsby 1997). Estas pérdidas pasan clínicamente desapercibidas, sin embargo, gracias a las determinaciones ultrasensibles de gonadotropina coriónica humana (hcg), se ha podido determinar que las pérdidas ocurridas durante el período comprendido entre la implantación y la semana 6 de gestación, superan el 30%. Los abortos clínicamente reconocidos ocurren en solo el 12% de las mujeres jóvenes alrededor de los 20 años, sin embargo, este porcentaje se va incrementando conforme aumenta la edad de la gestante, hasta llegar a un 75% en aquellas mayores de 40 años. En efecto, apenas un 4-5% de los embriones vivos, detectados por ultrasonografía, sufren pérdida en mujeres jóvenes, en tanto que en las de 40 años o más, estas cifras se alcanzan cerca del 29% (Speroff 2000). Una abortadora recurrente primaria se define como aquella paciente que ha perdido todos los embarazos y no reporta nacimientos vivos. La abortadora recurrente secundaria es aquella que presenta un embarazo exitoso sin importar el número de las pérdidas reportadas (Pandey M.K et al. 2005). El aborto recurrente afecta aproximadamente al 1% de la población y su etiología es multifactorial, no obstante sus causas pueden ser agrupadas en fetales, maternas y paternas. Las causas fetales se deben comúnmente a cariotipos anormales del cigoto, del embrión o del feto temprano, que impiden el desarrollo embrionario normal. Las causas maternas suelen atribuirse a causas anatómicas, desórdenes en la coagulación, trastornos autoinmunes,

26 16 enfermedades endocrinas y defectos endometriales (Willians 2001) (Anexos 1, 2, 3). Las causas paternas suelen deberse principalmente a alteraciones en el cigoto masculino. Sin embargo, es importante destacar que cerca del 50% de los abortos recurrentes son de etiología desconocida (Laird et al., 2004) LINFOCITOS T Las células T son las células inmunes mejor estudiadas durante el embarazo. Los linfocitos T poseen dos poblaciones: los linfocitos T ayudadores (Th), productores de citocinas y los linfocitos T citotóxicos (Tc) cuya principal función es destruir células extrañas o infectadas (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2003). De acuerdo al patrón de citocinas producidas los linfocitos Th se clasifican en Th1, Th2 y Th3. Los linfocitos Th1 producen citocinas Th1 (IL-2, factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interferon γ (IFN-γ) IL-15, IL-18) que son responsables de promover la clásica respuesta de inmunidad celular, como ha sido observada en la reacción de rechazo al injerto, en la hipersensibilidad retardada, en la repuesta antiviral y en la inflamación, que involucra a las citocinas proinflamatorias (IL-1, IL-12, y TNFα aportada por los macrófagos). Las células Th2 producen citocinas Th2 (IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17) que son más eficaces como ayudadoras en la activación de células B y que tienen efecto anti-inflamatorio (Goldsby R. et al 2000). Las células ayudadoras Th3 liberan la citocina TNFβ, que es un tipo de molécula que promueve la tolerancia (Clark 2005). En 1993 Wegmann propone que durante el embarazo se provoca un cambio en el patrón de producción de citocinas, que favorece la producción de las citocinas tipo Th2, este fenómeno denominado Th2, resulta ser beneficioso para el embarazo. Diversos estudios han demostrado que las citocinas tipo INFγ y TNFα impiden el desarrollo embriológico y fetal, (Chaouat et al 1990; Haimovici et al 1991), y se ha propuesto que la reacción inmune mediada por las células Th1 y sus citocinas respectivas hacen que las células T citotóxicas (Tc) ataquen al trofoblasto embrionario (Tsuda H. et al 2001). Varios grupos de investigadores han coincidido en que la relación en la producción de citocinas Th1/Th2 está disminuida en el embarazo normal, especialmente durante el primer trimestre de gestación (Sabahi et al 1995, Ekerfelt et al 1997, Satio et al 1999, Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2002). Aunque no está claro como se logra el fenómeno Th2,

27 17 algunos autores piensan que este evento se debe a la disminución en la producción de citocinas Th1 (Satio et al 1999; Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2002), mientras que otros afirman que este cambio obedece a un incremento en la producción de las citocinas tipo Th2 (Ekerfelt et al 1997), a pesar de la polémica, lo que si está claro es que para continuar el embarazo es necesario que ocurra un cambio en la respuesta inmune que favorezca el predominio de las citocinas Th2 (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2002). El fenómeno Th2 en el embarazo se ha tratado de explicar por muchas rutas, algunos autores atribuyen este evento al incremento de hormonas durante el embarazo, como es el caso de la progesterona, que pudiera de alguna manera influir en el patrón de producción de citocinas por parte de los linfocitos. Otros autores sugieren que la progesterona podría inducir la expresión de un factor bloqueante en las células T ayudadoras (Th). También está planteado que la placenta podría generar interferencia en la producción de citocinas, ya que in vitro, se ha podido demostrar que tanto la placenta como las células del trofoblasto, producen factores capaces de inhibir la actividad citotóxica de los linfocitos T. Adicionalmente se ha determinado la producción de citocinas en células del trofoblasto, que pudieran desviar la respuesta inmune materna hacia la producción de citocinas Th2. Finalmente otro de los mecanismos propuestos para tratar de explicar el fenómeno Th2 es el relacionado con la expresión de la enzima indolamina dioxigenasa (IDO) en células del sincitiotrofoblasto velloso, ya que esta enzima cataboliza el triptófano, que indirectamente suprime la activación materna de células T por privación de este aminoácido (Veenstra van Nieuwenhoven A.L. et al 2003). Los linfocitos maternos también se encuentran en las células de la decidua, que es la porción de la placenta que se halla en estrecho contacto con el trofoblasto embrionario. Al igual que los linfocitos de sangre periférica los de la decidua producen citocinas tipo Th1 y Th2 y sus efectos han sido evaluados demostrándose que las citocinas Th1 inhiben la invasión del trofoblasto, ya que TNFα estimula la apoptosis en células del trofoblasto humano, y adicionalmente el INFγ potencia esta acción impidiendo el proceso de invasión. Juntos TNFα y INFγ son capaces de activar la protrombinasa que genera trombina, la cual activa la cascada de coagulación y la producción de IL-8, que a su vez estimula a los granulocitos y células endoteliales que bloquean el suministro de sangre y el desarrollo de la placenta. Por otra parte las citocinas Th2 de la decidua estimulan el crecimiento del trofoblasto y la invasión. Como ha

28 18 sido mencionado anteriormente, durante el embarazo normal tanto en la decidua como en sangre periférica existe un predominio de citocinas Th2. Células T efectoras y Células T de memoria. La memoria es la clave de la respuesta inmune adquirida, que resulta de la expansión clonal y de la diferenciación antígeno-específica de los linfocitos. Los linfocitos de memoria confieren una protección inmediata, en el caso de los linfocitos B, la memoria protectiva es mediada por células plasmáticas que secretan anticuerpos y cuando hay la estimulación secundaria por un antígeno específico, las células B proliferan se diferencian a células plasmáticas y generan una respuesta de memoria reactiva. Por su parte las células T para emitir una respuesta de memoria, requiere de una subpoblación especializada, las células T efectoras de memoria (TEM) que migran al tejido periférico inflamado y que posteriormente despliegan una respuesta inmune efectora inmediata, que provoca una respuesta de memoria central, que tiene poca función efectora, pero que prolifera rápidamente y se diferencia a células efectoras de memoria central (TMC) en respuesta a estimulación antigénica (Sallusto et al. 2004). Las células T efectoras de memoria (TEM) y de memoria central (TMC) se diferencian, según dos criterios: la presencia o ausencia de función efectora inmediata y por la expresión de receptores homing que permiten que las células migren a los órganos linfoides secundarios y a tejidos no linfoides. Las células de memoria central (T MC) humanas son células de memoria (CD45RO+) que expresan constitutivamente CCR7 y CD62L, que son receptores que también son expresados por las células T vírgenes (CD45RA+) y que son requeridos para la extravasación de células a través de los vasos endoteliales. Al comparar las células T vírgenes (CD45RA+) con las de memoria central (TMC) encontramos que estas últimas tienen una elevada sensibilidad a la estimulación antigénica. Las células T de memoria central (TMC) son predominantemente en las células T CD4+ (Sallusto et al. 2004). Las células T efectoras de memoria (TEM) exhiben un conjunto de receptores quimiocinas y moléculas de adhesión, las cuales son requeridas para la extravasación al tejido afectado ( homing ), ellas han perdido la expresión constitutiva de receptores CCR7 y CD62L. Al comparar las TEM con las TMC, las primeras se caracterizan por su rápida acción efectora. Las TEM son predominantemente CD8 y producen grandes cantidades de perforina, y tanto las TEM CD4 como las CD8 producen INFγ, IL-4, IL-5. (Sallusto et al. 2004).

29 19 Receptor de Células T Durante su maduración en el timo, los linfocitos T adquieren el receptor de células T (TCR), el cual reconoce a antígenos unido a proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Este receptor es un heterodímero transmembrana formado por las cadenas αβ ó γδ, que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y que al igual que éstas posee un dominio variable (V) y uno constante (C) (Goldsby R. A et al 2000). Debido a que las moléculas clásicas del CMH están ausentes en el trofoblasto, como se describió anteriormente, el reconocimiento de los antígenos fetales por los linfocitos Tαβ, restringidos por el CMH es desconocido. Sin embargo, las células Tγδ, las cuales no requieren del proceso de presentación de antígenos, pueden reconocer un número limitado de ligandos con un pequeño repertorio de receptores, lo que podrían jugar un rol significativo durante el embarazo (Szekeres-Bartho et al 2001). La mayoría de las células T circulantes en sangre periférica presentan el receptor TCR αβ (90-95%), en tanto que sólo de un 5-10% de las células T circulante presentan el TCRγδ, una porción de este receptor es generado en el timo, pero la mayor fracción parece ser generada en compartimientos extratímicos. Se sabe que en adultos humanos el TCRγδ puede ser dividido en dos grupos: los circulantes en sangre periférica, que representan del 1 al 10% de las células mononucleares, y los TCRγδ residentes en la superficie de las células de las mucosas digestiva, respiratoria y tracto urogenital. Ambos tipos de receptores TCRαβ y TCR γδ presentan funciones diferentes, ya que los primeros juegan un rol central en la respuesta inmune adaptativa, mientras que los segundos se especializan en la respuesta inmune innata (Mincheva-Nilsson 2003). La principal diferencia entre las células TCRγδ residentes y circulantes consiste en su cadena variable (V), ya que las células Tγδ residentes tienen la cadena Vδ1, en tanto las células circulantes poseen la cadena Vδ2. Estudios realizados en ratones a los que se les ha extraído el timo han permitido determinar la presencia de las células Tγδ, lo cual evidencia la existencia de éstas células independientes del timo. (Mincheva-Nilsson 2003). Un incremento en la población de linfocitos T γδ se ha encontrado en la decidua. Este incremento también se observa en la sangre periférica y en el útero de mujeres embarazadas, por lo que se ha establecido que la expresión de las células TCR γδ positivas obedece al control hormonal. El incremento de esta población de linfocitos T en la decidua, en el útero y