KEYWORDS: immunity, cellular response, immunohistochemistry, paraffin inclusion, ethanol, cattle

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Víctor Manuel Serrano Iglesias
hace 8 años
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1 IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS LEUCOCITARIAS EN MUESTRAS DE BOVINO FIJADAS EN ETANOL LEUCOCYTE CELL IDENTIFICATION IN ETHANOL-FIXED BOVINE SAMPLES C. LÓPEZ, R. PANADERO, V. DACAL, L. VÁZQUEZ, P. DÍAZ, J. PEDREIRA, P. MORRONDO, P. DÍEZ Parasitología y Enfermedades Parasitarias. Dpto. Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela Lugo (SPAIN) Fax: clopez@lugo.usc.es KEYWORDS: immunity, cellular response, immunohistochemistry, paraffin inclusion, ethanol, cattle ABSTRACT Fifteen antibodies have been used to detect and quantify different leucocyte populations in lymph-node cattle sample: B lymphocytes (CD79a HM57, CD79a JCB117, IgM Ab1 GM01 LabVision, IgM Ab-2 polyclonal LabVision, BAQ44A B-B2 VMRD Inc.); plasmatic cells (Lambda Light Chain, polyclonal, ); T lymphocytes (CD2 BAQ95A,, CD3 polyclonal, y CD3 polyclonal Sigma); CD4 subpopulation (CD4 CC8 Serotec, CD4 GC50A1 ); CD8 subpopulation (CD8 CC63 Serotec, CD8 CACT80C ); gamma-delta subpopulation (TcR1δ CACTB6A, ) and Langerhans cells (CD1a Ab4 1 CA04 LabVision). Samples were fixed in 95% ethanol 18h. and embedded in paraffin wax. Sections were cut (4µm) and antigen retrieval methods were applied (enzymatic digestion, microwave irradiation in different buffers, boiling and detergent treatment). Avidin-biotin-peroxidase complex (Vectastain ABC kit) was used in immunohistochemistry. Only the following antigens marked cells: B lymphocytes (BAQ44A B-B2 VMRD Inc.); plasmatic cells (Lambda Light Chain, polyclonal, ); T lymphocytes (CD2 BAQ95A,, CD3 polyclonal, y CD3 polyclonal Sigma) and gamma-delta subpopulation (TcR1δ CACTB6A, ). This procedure is valuable to detect leucocyte populations in cattle infections; at present, skin immune response to grub infection is being studied. INTRODUCCIÓN La cuantificación de la respuesta inmune celular que genera la parasitación de los animales supone algunas dificultades. Las muestras incluidas en parafina, sobre todo aquellas fijadas con formol, no son adecuadas para diferenciar las distintas poblaciones celulares (Gutiérrez y col., 1999; Babcock y Dawes, 1994), ya que se forman mallas de fijación que ocultan los epítopos identificativos de las células. Por ello, muchas veces es necesario obtener muestras congeladas, lo que supone disponer de cierta infraestructura que no siempre está disponible. Esta dificultad se agrava en el caso de los animales de producción, como los bovinos, ya que las muestras muchas veces tienen que ser tomadas en el campo. Por ello nos planteamos este estudio en el que se toman muestras de ganglios linfáticos de ganado vacuno. Como fijación alternativa al formol se usó etanol 95%, de más fácil obtención y mediante la cual se evitará la formación de mallas que enmascaren los epítopos identificativos de las poblaciones celulares que queremos detectar.

2 MATERIAL Y MÉTODOS Las muestras se obtuvieron de ganglios linfáticos de ganado vacuno sacrificado en matadero. Estas muestras se dividieron en partes con un grosor menor de 5mm y se sumergieron inmediatamente en etanol 95% en el que se mantuvieron 18 horas, momento en el que se comenzó la inclusión en parafina. Sobre los bloques obtenidos se realizaron cortes en microtomo de 4µm que se recogieron en portas tratados con Poly-L-Lisina para aumentar la adherencia. Al comenzar a aplicar las técnicas de inmunohistoquímica, tras la inhibición de la peroxidasa endógena en una solución de peróxido de hidrógeno 6% en metanol absoluto durante 30 minutos en oscuridad, se aplicaron diferentes técnicas de desenmascaramiento en las muestras que lo precisaron para detectar la población celular deseada. Estas técnicas fueron las siguientes: - Tratamiento enzimático (Pronasa 0,005%, PROTEASA E, Tipo XIV, SIGMA ) durante 1 minuto - Calentamiento en microondas en 400 ml de tampón citrato (10mM) ph6 o EDTA, usando los siguientes ciclos: 450W hasta la aparición de burbujas 6 minutos a 150W - Hervir en tampón citrato ph6 durante 5-15 minutos - Tratamiento detergente mediante incubación de las muestras en una solución de TRITÓN X-100 (0,5%) más Tween20 (0,5%) Posteriormente se continuaron las técnicas de inmunohistoquímica en las que se probaron los siguientes anticuerpos primarios para detectar y cuantificar las distintas poblaciones leucocitarias: CÉLULAS DIANA Identificación del clon Tipo de anticuerpo LINFOCITOS B CD79a HM57 CD79a JCB117 IgM Ab1 GM01 LabVision IgM Ab-2 LabVision BAQ44A B-B2 VMRD Inc. CÉLULAS PLASMÁTICAS Lambda Light Chain LINFOCITOS T CD2 BAQ95A VMRD Inc. CD3 CD3 SIGMA Subpoblacion CD4 Subpoblacion CD8 Subpoblacion Delta(TcR1δ) Gamma- CC8 SEROTEC GC50A1 VMRD Inc. CC63 SEROTEC CACT80C VMRD Inc. CACTB6A VMRD Inc. CÉLULAS DE LANGERHANS 1CA04 Lab Vision Tras la incubación con el anticuerpo primario toda la noche a 4ºC se lavaron los cortes con PBS y se incubaron 30 minutos con los anticuerpos secundarios (Anti-ratón biotinado () 1:50 para los primarios monoclonales y anti-conejo biotinado 1:200 para los

3 primarios policlonales. Tras 2 lavados con TBS, los cortes se incubaron 1 hora con el complejo avidina-biotina (Vectastain ABC kit) y se reveló posteriormente en DAB con presencia de peróxido de hidrógeno. Las muestras se tiñeron después con hematoxilina como contraste. Como control negativo se utilizaron cortes en los que el anticuerpo primario se substituía por BSA 5%. RESULTADOS Los resultados obtenidos se pueden observar en el CUADRO 1. Cuadro 1. Identificación celular por los anticuerpos primarios Anticuerpo Número CD CD79a CD79a IgM (µ-heavy Chain) Ab1 IgM (µ-heavy Chain) Ab2 BAQ44A Lambda Light Chain (IgG-células plasmaticas) CD2 ( CD3 ( CD3 ( CD4 CD4 CD8 CD8α TcR1δ (Subpoblación T Gamma-delta) Clon HM57 JCB117 GM01 LAB VISION LAB VISION B-B2 BAQ15A VMRD, Inc SIGMA CC8 SEROTEC GC50A1 CC63 SEROTEC CACT80C CACTB6A VMRD, Inc Técnica de desenmascaramiento Ninguna Pronasa Microondas Hervir (más trat. detergente) CD1a Ab4 1CA04

4 Langerhans cells LAB VISION (Citrato/EDTA) (Citrato/EDTA) +++Células bien marcadas. Muestra limpia ++Muestras bien marcadas. Muestra coloreada + Células menos marcadas -Ninguna identificación celular Los resultados se muestran en las Fotos 1 (Linfocitos B, 400x), 2 (células plasmáticas, 400x) y 3 (Linfocitos T, 400x). Foto 1. Linfocitos B (400x) Foto 2. Células plasmáticas (400x) Foto 3. Linfocitos T (400x) DISCUSIÓN Los resultados obtenidos nos indican, en primer lugar, que el uso de proteasas para desenmascarar los epítopos en muestras fijadas con etanol no es adecuado, ya que aunque se tratan durante períodos muy cortos (1 minuto; véase Material y métodos) y a concentraciones muy bajas, las muestras fijadas con etanol se destruyen muy rápidamente en el tratamiento por enzimas proteolíticas. Como se puede observar en el Cuadro 1, a pesar de haber conseguido la detección de diferentes poblaciones celulares, la detección de las subpoblaciones de linfocitos T CD4 + y

5 CD8 + no ha podido realizarse. Los epítopos identificativos de estas poblaciones hasta ahora tienen que ser detectados mediante muestras congeladas (Navarro y col., 1996) o con fijaciones especiales, como el dicromato de formalina (Rathkolb y col., 1997; Gutiérrez y col., 1999). Además, podemos señalar que la mayor parte de los anticuerpos primarios policlonales obtenidos de conejo, excepto IgM Ab2 de LAB VISION, han podido ser utilizados con una identificación positiva de sus poblaciones diana en las condiciones marcadas en este estudio, es decir, la fijación en etanol, que es posible realizarla en cualquier momento y la inclusión en parafina, técnica estándar en histología. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Investigación AGL /GAN del MCYT y el Incentivo PGIDIT05PXIC26101PN BIBLIOGRAFÍA Alves VA, Wakamatsu A, Kanamura CT, Magalhaes ES, Siqueira SA, (1992). The importance of fixation in immunohistochemistry: distribution of vimentin and cytokeratins in samples fixed in alcohol and formol. Rev. Hosp.. Clin. Fac. Med. Sao Paulo, 47: Babcock GF, Dawes SM. (1994). Immunophenotyping using fixed cells. In: Darzynkiewicz Z, Robinson JP, Crissman HA. Eds, Flow Cytometry, Academic Press, San Diego, pp Gutierrez M, Forster, FI, McConnell SA, Cassidy JP, Pollock JM, Bryson DG. (1999). The detection of CD2+, CD4+, CD8+, and WC1+ T lymphocytes, B cells and macrophages in fixed and paraffin embedded bovine tissue using a range of antigen recovery and signal amplification techniques. Vet Immunol Immunopathol, 71: Navarro JA, Caro, MR, Seva J, Rosillo MC, Gómez MA, Gallego MC. (1996). Study of lymphocyte subpopulations in peripheral blood and secondary lymphoid organs in the gota using monoclonal antibodies to surface markers of bovine lymphocytes. Vet. Immunol. Immunopathol., 51: Rathkolb B, Pohlenz JF, Wohlsein P. (1997). Identification of leucocyte surface antigens in paraffin-embedded rat tissues. J. Histochem. Cytochem., 44:

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